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Bioengineering

माइक्रोपोरस एनील्ड पार्टिकल मचान के लिए माइक्रोगेल बिल्डिंग ब्लॉक्स का माइक्रोफ्लुइडिक संश्लेषण

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia, 2Department of Chemical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia

Summary

यह प्रोटोकॉल माइक्रोपोरस एनील्ड कण मचान के लिए माइक्रोगेल बिल्डिंग ब्लॉकों को संश्लेषित करने के तरीकों के एक सेट का वर्णन करता है, जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

Abstract

माइक्रोपोरस एनील्ड पार्टिकल (एमएपी) मचान प्लेटफ़ॉर्म दानेदार हाइड्रोगेल का एक उपवर्ग है। यह माइक्रोगेल के एक इंजेक्शन योग्य घोल से बना है जो एक माध्यमिक प्रकाश-आधारित रासायनिक क्रॉसलिंकिंग चरण (यानी, एनीलिंग) के बाद सीटू में सेल-स्केल पोरसिटी के साथ संरचनात्मक रूप से स्थिर मचान बना सकता है। एमएपी मचान ने विभिन्न प्रकार के पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों में सफलता दिखाई है, जिसमें त्वचीय घाव भरने, मुखर गुना वृद्धि और स्टेम सेल वितरण शामिल हैं। यह पेपर एमएपी मचान बनाने के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (पीईजी) माइक्रोगेल के संश्लेषण और लक्षण वर्णन के तरीकों का वर्णन करता है। इन विधियों में एक कस्टम एनीलिंग मैक्रोमर (मेथएमएल) का संश्लेषण, माइक्रोगेल अग्रदूत जेलेशन कैनेटीक्स का निर्धारण, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण, माइक्रोगेल की माइक्रोफ्लुइडिक पीढ़ी, माइक्रोगेल शुद्धिकरण और बुनियादी मचान लक्षण वर्णन शामिल हैं, जिसमें माइक्रोगेल साइजिंग और पाड़ एनीलिंग शामिल हैं। विशेष रूप से, यहां वर्णित उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक विधियां बड़ी मात्रा में माइक्रोगेल का उत्पादन कर सकती हैं जिनका उपयोग किसी भी वांछित अनुप्रयोग के लिए एमएपी मचान उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, खासकर पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में।

Introduction

एमएपी पाड़ मंच एक इंजेक्शन योग्य बायोमैटेरियल है जो पूरी तरह से हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल्स (माइक्रोगेल) से बना है जो एक साथ क्रॉसलिंक होने पर सेल-स्केल माइक्रोपोरोसिटी प्रदान करता है, जो गिरावट-स्वतंत्र सेल माइग्रेशन और थोक ऊतक एकीकरण की अनुमति देता है1. मेजबान ऊतक और स्वाभाविक रूप से कम इम्यूनोजेनेसिटी के साथ जल्दी से एकीकृत करने की अपनी क्षमता के कारण, एमएपी पाड़ प्लेटफ़ॉर्म ने पुनर्योजी चिकित्सा उपचार 2,3,4,5,6,7,8,9,9,10 की एक विस्तृत विविधता के लिए प्रीक्लिनिकल प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया है, जिसमें त्वचीय घाव भरने में तेजी लाना 1,3 शामिल है , 11, मस्तिष्क स्ट्रोक गुहा7 को पुनर्जीवित करना, मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओंको वितरित करना 2, और ग्लोटिक अपर्याप्तता के इलाज के लिए ऊतक बल्किंग प्रदान करना6. एमएपी को एम 2 मैक्रोफेज3 की भर्ती के माध्यम से ऊतक की मेजबानी करने के लिए विरोधी भड़काऊ प्रभाव व्यक्त करने के लिए भी दिखाया गया है और यहां तक कि टीएच 2 "ऊतक मरम्मत" प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8 को बढ़ावा देने के लिए ट्यून किया जा सकता है। एमएपी पाड़ मंच के ये अनुकूल गुण इसे नैदानिक अनुप्रयोगों की एक विविध श्रृंखला में विस्तारित करने की अनुमति देते हैं।

एमएपी मचान गठन के लिए माइक्रोगेल उत्पन्न करने के लिए पहले प्रकाशित तरीकों में प्रवाह-फोकसिंग छोटी बूंद-माइक्रोफ्लुइडिक्स 1,4,7,9, इलेक्ट्रोस्प्रेइंग 5,12, और बैच इमल्शन 6,10 के साथ ओवरहेड कताई शामिल है। छोटी बूंद माइक्रोफ्लुइडिक विधि उच्च मोनोडिस्पर्सिटी वाले कणों का उत्पादन कर सकती है लेकिन बहुत धीमी प्रवाह दर का उपयोग करती है जो कणों की कम पैदावार (μL / वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रोस्प्रेइंग और बैच पायस विधियां कणों की एक उच्च मात्रा का उत्पादन कर सकती हैं, लेकिन उच्च कण पॉलीडिस्पर्सिटी के साथ। यह प्रोटोकॉल डी रूट एट अल13 द्वारा काम के आधार पर, मोनोडिस्पर्स आबादी के साथ माइक्रोगेल का उत्पादन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक विधि का उपयोग करता है। यह विधि एक फोटोमास्क से पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाने के लिए नरम लिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करती है, जिसे बाद में एक ग्लास स्लाइड से जोड़ा जाता है। डिवाइस डिजाइन माइक्रोगेल कणों (एमएल / एच) की उच्च मात्रा उत्पन्न करने के लिए चरण-पायसीकरण पर निर्भर करता है। इस विधि के साथ प्राप्त की जा सकने वाली मोनोडिस्पर्सिटी अन्य तकनीकों की तुलना में छिद्र का बेहतर नियंत्रण प्रदान करती है, क्योंकि मोनोडिस्पर्स माइक्रोगेल अधिक समान ताकना आकार2 के साथ मचान बना सकते हैं।

व्यक्तिगत माइक्रोगेल को संश्लेषित करने और चिह्नित करने के तरीके जो एमएपी मचानों के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में कार्य कर सकते हैं, इस पांडुलिपि के भीतर उल्लिखित हैं, विशेष रूप से माइक्रोगेल बनाने के संदर्भ में जिसमें एक मैलिमाइड (एमएएल) समूह के साथ एक खूंटी रीढ़ की हड्डी होती है, जो आसानी से कुशल माइकल-प्रकार के जोड़ में भाग लेती है थियोल-कार्यात्मक क्रॉसलिंकर्स माइक्रोगेल जेलेशन के लिए। एमएपी मचान एनीलिंग से माइक्रोगेल जेलेशन को अलग करने के लिए, यह पांडुलिपि यह भी बताती है कि प्रकाशित14 कस्टम एनीलिंग मैक्रोमर, मेथमल को संश्लेषित कैसे किया जाए, जो एक हेटरोफंक्शनल मेथैक्रिलामाइड / मेथैक्रिलामाइड कार्यात्मक समूह आसानी से मुक्त-कट्टरपंथी फोटोपोलिमराइजेशन (माइक्रोगेल एनीलिंग के लिए) में भाग लेते हैं, जबकि एमएएल कार्यात्मक समूहों के लिए माइकल-प्रकार के जोड़ को बढ़ावा देने वाली स्थितियों के लिए अपेक्षाकृत निष्क्रिय रहते हैं।

इसके अतिरिक्त, यह पांडुलिपि पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने, माइक्रोगेल जेलेशन कैनेटीक्स का निर्धारण करने और माइक्रोगेल आकार की विशेषता के लिए प्रोटोकॉल को रेखांकित करती है। पांडुलिपि का अंतिम भाग एमएपी मचान एनीलिंग का विवरण देता है, जो तब होता है जब माइक्रोगेल को एक माध्यमिक, फोटो-शुरू किए गए क्रॉसलिंकिंग चरण के माध्यम से थोक मचान में सीटू में संक्रमण किया जाता है जो माइक्रोगेल की सतहों को सहसंयोजक रूप से एक साथ बांधता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अन्य एनीलिंग विधियां हैं जिन्हें एमएपी मचान प्रणालियों में लागू किया जा सकता है जो प्रकाश-आधारित रसायन विज्ञान पर भरोसा नहीं करते हैं, जैसे कि एंजाइम-मध्यस्थता एनीलिंग, जैसा कि पहले वर्णित है1. कुल मिलाकर, इन विधियों का उपयोग सीधे किया जा सकता है या किसी भी अनुप्रयोग के लिए एमएपी मचान उत्पन्न करने के लिए विभिन्न हाइड्रोगेल फॉर्मूलेशन रसायन (जैसे, हाइलूरोनिक एसिड-आधारित) के साथ उपयोग किया जा सकता है।

Protocol

1. मेथमल एनीलिंग मैक्रोमर संश्लेषण

नोट: यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से खूंटी-मैलिमाइड के 1 ग्राम को संशोधित करने के लिए है लेकिन बड़े बैचों को बनाने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

  1. हलचल पट्टी के साथ एक छोटे ग्लास बीकर में 1 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) के 10 एमएल में 4-हाथ 20 केडीए पीईजी-मैलिमाइड का 1 ग्राम जोड़ें। खूंटी पूरी तरह से भंग हो गया है जब तक 300 आरपीएम पर समाधान हिलाओ (~ 30 मिनट)।
  2. 300 आरपीएम पर सरगर्मी के साथ प्रतिक्रिया में 14.65 मिलीग्राम 2-एमिनोइथेनेथियोल (0.67: 1 थियोल [एसएच] से मैलिमाइड [एमएएल] दाढ़ अनुपात) जोड़ें।
    नोट: 2-एमिनोइथेनथियोल पर थियोल समूहों को माइकल-प्रकार के अतिरिक्त के माध्यम से खूंटी-एमएएल के लगभग तीन हथियारों में जोड़ा जाएगा, जिससे अमाइन अंत समूह ों को छोड़ दिया जाएगा।
    1. जोड़ने के लिए 2-एमिनोइथेनथियोल की मात्रा के लिए निम्नलिखित उदाहरण गणना का निरीक्षण करें:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      नोट: बहुत कम मात्रा को मापने से बचने के लिए, 1 एक्स पीबीएस (पीएच 7.4) के 1 एमएल में 2-एमिनोइथेनेथियोल के 100 मिलीग्राम को भंग करें और प्रतिक्रिया में उस समाधान के 146.5 μL जोड़ें।
  3. चरण 1.2 के बाद 1 घंटे और 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें, फिर 160.1 मिलीग्राम 4- (4,6-डाइमेथॉक्सी-1,3,5-ट्रायज़िन-2-वाईएल) -4-मिथाइलमोर्फोलिनियम क्लोराइड (डीएमटीएमएम, 12: 1 दाढ़ अनुपात खूंटी) और 32.77 μL मेथैक्रिलिक एसिड (खूंटी के लिए 8: 1 दाढ़ अनुपात) 5 एमएल में मिलाएं
    नोट: इस चरण में, मेथैक्रिलिक एसिड डीएमटीएमएम के साथ एक अत्यधिक प्रतिक्रियाशील एस्टर बनाने के लिए प्रतिक्रिया करता है जिसे तब खूंटी पर उपलब्ध अमाइन समूहों के साथ जोड़ा जा सकता है।
    1. जोड़ने के लिए DMTMM की मात्रा की गणना के लिए निम्न उदाहरण परिकलन का पालन करें:
      Equation 4
      Equation 5
      Equation 6
    2. जोड़ने के लिए मेथैक्रिलिक एसिड की मात्रा की गणना के लिए निम्नलिखित उदाहरण गणना का निरीक्षण करें:
      Equation 4
      Equation 7
      Equation 8
      Equation 9
  4. 20 केडीए पीईजी-एमएएल / 2-एमिनोएथेनेथियोल समाधान के साथ बीकर में मेथैक्रिलिक एसिड /
  5. बीकर में ट्राइथाइलमाइन (मेथैक्रिलिक एसिड के लिए 1: 1 दाढ़ अनुपात) के 53.56 μL जोड़ें और 300 आरपीएम पर सरगर्मी के साथ रात भर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें। धूल और अन्य दूषित पदार्थों को बीकर में प्रवेश करने से रोकने के लिए पन्नी के साथ बीकर को कवर करें।
    1. जोड़ने के लिए ट्राइथाइलमाइन की मात्रा के लिए निम्नलिखित उदाहरण गणना का निरीक्षण करें:
      Equation 10
      Equation 11
  6. सांप की त्वचा डायलिसिस ट्यूबिंग (आणविक भार कट-ऑफ: 3,500 दा) की प्रतिक्रिया को स्थानांतरित करें।
  7. डायलिसिस ट्यूबिंग को 300 आरपीएम पर सरगर्मी के साथ 3 दिनों के लिए विआयनीकृत (डीआई) पानी (वॉल्यूम पूरी तरह से टयूबिंग को कवर करना चाहिए) में 1 एम एनएसीएल के साथ एक बड़े बीकर में रखें। कुल छह वॉश के लिए 1 एम एनएसीएल समाधान 2x दैनिक बदलें।
  8. डीआई पानी में 6 घंटे के लिए डायलिज़ करें। कुल छह धोने के लिए प्रत्येक घंटे डीआई पानी बदलें।
  9. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया हस्तांतरण और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
  10. -70 डिग्री सेल्सियस के शुरुआती तापमान पर कम से कम 72 घंटे के लिए ट्यूब को लियोफिलाइज़ करें और 0 डिग्री सेल्सियस तक 0.01 डिग्री सेल्सियस /
  11. क्लोरोफॉर्म-डी के 700 μL में 25 मिलीग्राम मेथमल को भंग करके 1एच-एनएमआर के लिए नमूना तैयार करें और एनएमआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  12. 1एच-एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में स्पेक्ट्रा निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक 500 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर अधिग्रहित किए गए थे: स्वीप चौड़ाई = 6,467.3 हर्ट्ज, समय देरी = 13.1 एस, अधिग्रहण समय = 5.1 एस, पल्स समय = 5.1 μs, और स्कैन की संख्या = 8।
  13. विश्लेषण के लिए, एक संदर्भ (~ 6.76 पीपीएम) के रूप में मैलिमाइड चोटी को एकीकृत करें और फिर दो मेथैक्रिलामाइड चोटियों (~ 5.35 पीपीएम और 5.6 पीपीएम) को एकीकृत करें। मेथैक्रिलामाइड के साथ संशोधित हथियारों के प्रतिशत को प्राप्त करने के लिए सभी तीन चोटियों के कुल क्षेत्रफल से मेथैक्रिलामाइड शिखर क्षेत्रों के अनुपात को विभाजित करें।
    नोट: एक स्वीकार्य संशोधन 67% -75% मेथैक्रिलामाइड कार्यात्मक समूह प्रतिस्थापन है। मेथमल के लिए एक उदाहरण 1एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम चित्रा 1 में दिखाया गया है।
    1. प्रतिस्थापन समीकरण की डिग्री के रूप में समीकरण (1) का उपयोग करें:
      Equation 12(1)

Figure 1
चित्रा 1: रासायनिक संरचना और मेथमल के 1एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम। (ए) रासायनिक संरचना: मेथमल एनीलिंग मैक्रोमर 20 केडीए 4-आर्म पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) से बना है जो तीन मेथैक्रिलामाइड हथियारों के साथ संशोधित होता है। (बी) यह संरचना 5.36 पीपीएम (3) और 5.76 पीपीएम (2) पर चोटियों को उत्पन्न करती है जो पीईजी-एमएएल स्पेक्ट्रा में मौजूद नहीं है, और एक मैलिमाइड बांह, जो 6.71 पीपीएम (1) पर चोटी उत्पन्न करती है। विलायक, क्लोरोफॉर्म, ने 7.26 पीपीएम पर एक चोटी उत्पन्न की, और इस नमूने में अवशिष्ट पानी ने 2.2 पीपीएम (स्पेक्ट्रा पर लेबल) पर एक चोटी उत्पन्न की। मेथमल स्पेक्ट्रा में, मैलिमाइड चोटी का एकीकृत क्षेत्र 0.27 था, और मेथैक्रिलामाइड चोटियों के क्षेत्रों का योग 0.73 (0.37 + 0.36) था। मेथैक्रिलामाइड प्रतिशत संशोधन 73% (0.73 / (0.27 + 0.73)) था। यह आंकड़ा फाफ एट अल .14 से है। कॉपीराइट (2021) अमेरिकन केमिकल सोसाइटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. माइक्रोगेल अग्रदूत जेलेशन कैनेटीक्स

नोट: जेल अग्रदूत घटकों को भंग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर के पीएच को समायोजित करके जेलेशन समय को संशोधित किया जा सकता है। खूंटी-मैलिमाइड हाइड्रोगेल के लिए, एक अधिक अम्लीय पीएच आमतौर पर धीमी गति से जेलेशन समय से मेल खाता है क्योंकि थायोलेट एकाग्रता कम पीएच15 पर कम हो जाती है।

  1. बहुलक, क्रॉसलिंकर और अन्य जेल अग्रदूत घटकों (यानी, पेप्टाइड्स, ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स) की वांछित सांद्रता को पूर्वनिर्धारित करें। 10x पीबीएस (पीएच 1.5) में खूंटी-एमएएल, आरजीडी, और मेथमल (पीईजी-रीढ़ की हड्डी) और 1 एक्स पीबीएस (पीएच 7.4) में एमएमपी -2 क्रॉसलिंकर को भंग करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, जेल अग्रदूत समाधान एक प्रकाशित सूत्रीकरण3 है, जिसमें 45.88 मिलीग्राम / एमएल 4-हाथ खूंटी-एमएएल (10 केडीए), 0.82 मिलीग्राम / एमएल आरजीडी, 8.06 मिलीग्राम / एमएल मेथमल, और 4.62 मिलीग्राम / एमएल एमएमपी -2 क्रॉसलिंकर (एंजाइमेटिक रूप से डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर) शामिल हैं।
  2. 0.4 मिमी के अंतराल आकार, 1.0 के कतरनी तनाव, 1.0 हर्ट्ज की आवृत्ति और 10,800 एस की अवधि का उपयोग करके भंडारण और हानि मॉड्यूली की निगरानी के लिए एक विस्कोमीटर, या एक समकक्ष उपकरण तैयार करें।
    1. एक 35 मिमी प्लेट रोटर (पी 35 / टीआई) ज्यामिति संलग्न करें। आर्द्र वातावरण को बनाए रखने के लिए ज्यामिति के चारों ओर एक आर्द्र कक्ष या एक नम स्पंज का उपयोग करें।
    2. खूंटी-रीढ़ की हड्डी और एमएमपी-क्रॉसलिंकर को 1: 1 वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में मिलाएं।
    3. विस्कोमीटर चरण के केंद्र पर जेल अग्रदूत समाधान के पिपेट 400 μL।
    4. धीरे-धीरे ज्यामिति को मंच पर कम करें जब तक कि यह 0.4 मिमी के पूर्व निर्धारित अंतराल आकार तक न पहुंच जाए और तुरंत कमरे के तापमान पर 6 घंटे तक भंडारण (जी ') और हानि (जी ') मॉड्यूली की निगरानी शुरू करें।
      नोट: जेलेशन को तब शुरू करने के लिए माना जाता है जब भंडारण मापांक हानि मापांक से अधिक हो जाता है, और भंडारण मापांक पठारों पर जेलेशन को पूरा माना जाता है। एक प्रतिनिधि जेलेशन कैनेटीक्स वक्र चित्रा 2 में दिखाया गया है।

Figure 2
चित्रा 2: एक विस्कोमीटर द्वारा निर्धारित एक एमएपी जेल अग्रदूत समाधान (पीएच 4.5) के जेलेशन कैनेटीक्स का प्रतिनिधि वक्र। जेलेशन भंडारण (जी') मापांक में तेजी से वृद्धि पर शुरू होता है, और जी 'वक्र पठारों पर जेलेशन पूरा होता है। जी ' हानि मापांक को इंगित करता है। यह आंकड़ा प्रुएट एट अल.3 से है। कॉपीराइट (2021) विली-वीसीएच जीएमबीएच कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण

नोट: यह प्रोटोकॉल डी रूट एट अल .13 से अनुकूलित माइक्रोफ्लुइडिक चरण-पायसीकरण डिवाइस डिजाइन के डिवाइस निर्माण का वर्णन करता है, जिसे चित्रा 3 ए में देखा जा सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी डिवाइस डिज़ाइन के साथ किया जा सकता है जो एसयू -8 वेफर में उकेरा गया है। एसयू -8 सिलिकॉन वेफर मास्टर फैब्रिकेशन को आउटसोर्स करने की सिफारिश की जाती है, जब तक कि निर्माण के लिए उपयुक्त क्लीनरूम सुविधाएं उपलब्ध न हों।

  1. एसयू -8 वेफर फोटोमास्क से पहला पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाएं।
    1. 10: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू अनुपात में आधार और इलाज एजेंट को मिलाकर ~ 200 ग्राम पीडीएमएस तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एसयू -8 वेफर को एक संस्कृति डिश में रखें (डिश के लिए वेफर के किनारों को टेप करें), माइक्रोफ्लुइडिक डिज़ाइन का सामना करना पड़ रहा है।
    3. वेफर पर 1-1.5 सेमी मोटी परत बनाने के लिए डिश में पीडीएमएस डालें। किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए डिश को वैक्यूम के नीचे रखें।
    4. पीडीएमएस को जमने तक इलाज करें (कमरे के तापमान पर 24 घंटे या 60 डिग्री सेल्सियस पर ~ 2 घंटे)।
    5. एक बार जब पीडीएमएस ठीक हो जाता है, तो पीडीएमएस के माध्यम से आयत को काटने के लिए सावधानीपूर्वक रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करें, जैसे कि वेफर पर डिजाइन के चारों ओर 0.5-1 सेमी मार्जिन हो।
      नोट: बहुत अधिक दबाव का उपयोग न करें और वेफर को नुकसान पहुंचाने (जैसे, क्रैकिंग, स्क्रैचिंग) से बचने के लिए बहुत कोमल रहें।
    6. कटौती में से एक में एक स्पैटुला वेज करें और पीडीएमएस को वेफर से अलग करने के लिए कटौती के साथ स्लाइड करें।
      नोट: जैसा कि पीडीएमएस वेफर से अलग होता है, पीडीएमएस के तहत एक हवा का बुलबुला बनना शुरू हो जाएगा ( चित्रा 3 बी देखें)।
    7. डिश से पीडीएमएस के आयत को धीरे-धीरे उठाने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें।
      नोट: वेफर के ऊपर पीडीएमएस में परिणामी अंतर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के लिए मोल्ड होगा।
  2. एसयू -8 वेफर फोटोमास्क से बाद में पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाएं।
    1. 10: 1 अनुपात में आधार और इलाज एजेंट को मिलाकर प्रति मोल्ड ~ 15-20 ग्राम पीडीएमएस तैयार करें।
    2. वेफर के ऊपर पीडीएमएस की 5 मिमी परत बनाने के लिए मोल्ड में आयताकार अंतराल में पीडीएमएस डालें। किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए वैक्यूम के तहत मोल्ड रखो।
    3. पीडीएमएस को पूरी तरह से जमने तक ठीक होने दें (कमरे के तापमान पर 24 घंटे या 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे)।
    4. एक बार जब पीडीएमएस ठीक हो जाता है, तो आयत के किनारों के चारों ओर पीडीएमएस को काटने के लिए रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करें।
      नोट: बहुत अधिक दबाव का उपयोग न करें और वेफर को नुकसान पहुंचाने (यानी, क्रैकिंग) से बचने के लिए बहुत कोमल रहें।
    5. कटौती में से एक में एक स्पैटुला वेज करें और पीडीएमएस को वेफर से अलग करने के लिए कटौती के साथ स्लाइड करें।
      नोट: जैसा कि पीडीएमएस वेफर से अलग हो जाता है, पीडीएमएस के तहत एक हवा का बुलबुला बनना शुरू हो जाएगा।
    6. दो इनलेट और आउटलेट ( चित्रा 3 बी देखें) पर पीडीएमएस आयत के माध्यम से छेद बनाने के लिए 1.5 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करें।
    7. यदि एक ही वेफर पर कई डिवाइस हैं, तो प्रत्येक डिवाइस के बीच पीडीएमएस को हल्के ढंग से स्कोर करने के लिए एक स्पैटुला या रेजर ब्लेड का उपयोग करें, फिर पीडीएमएस को धीरे-धीरे स्कोर की गई लाइनों के साथ मोड़ें ताकि पीडीएमएस अपने आप बहुत सफाई से अलग हो जाए।
    8. पीडीएमएस उपकरणों को धूल मुक्त कंटेनर में स्टोर करें।
  3. पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को ग्लास स्लाइड में बॉन्ड करें।
    1. पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस प्रति एक ग्लास स्लाइड तैयार करें। स्लाइड से किसी भी धूल को हटाने के लिए टेप, फ़िल्टर्ड एयर या आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) वॉश का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि अगले चरण पर जाने से पहले स्लाइड पूरी तरह से सूखी हैं।
    2. एक ग्लास स्लाइड और एक पीडीएमएस डिवाइस, डिज़ाइन-साइड, एक छोटे प्लास्टिक ट्रे पर एक दूसरे के बगल में रखें (एक 96-अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन इसके लिए अच्छी तरह से काम करता है) और इसे प्लाज्मा क्लीनर में रखें। दरवाजा और वायु प्रवाह वाल्व बंद करें और वैक्यूम पंप चालू करें। इसे कम से कम 30 सेकंड तक चलने दें, फिर इसे बंद कर दें।
    3. ऑक्सीजन टैंक गैस ट्यूब को वायु-प्रवाह वाल्व से कनेक्ट करें। प्लाज्मा कक्ष को 30 एस के लिए ऑक्सीजन से भरने दें, फिर ऑक्सीजन बंद करें, और वायु-प्रवाह वाल्व को बंद करें।
    4. वैक्यूम पंप चालू करें और रेडियोफ्रीक्वेंसी (आरएफ) स्तर को उच्च पर सेट करें। कक्ष एक बैंगनी-गुलाबी रंग बदल जाता है ( चित्रा 3 बी देखें) तक प्रतीक्षा करें। 30 सेकंड पास होने दें।
    5. जब टाइमर बंद हो जाता है, तो प्लाज्मा और वैक्यूम बंद कर दें। फिर, वैक्यूम को छोड़ने के लिए धीरे-धीरे वायु-प्रवाह वाल्व खोलें। प्लाज्मा क्लीनर से ट्रे निकालें।
    6. पीडीएमएस डिवाइस को धीरे-धीरे ग्लास स्लाइड पर फ्लिप करें ताकि उन्हें बांध सकें। जैसा कि बंधन होता है, पीडीएमएस की पारदर्शिता में मामूली अंतर का निरीक्षण करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, उपयोग से तुरंत पहले तक बंधुआ उपकरणों को 60 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की सतह का इलाज
    1. नोवेक तेल (1:50) में पीएफओसीटीएस (ट्राइक्लोरो (1 एच, 1 एच, 2 एच, 2 एच-पेरफ्लोरोक्टिल) सिलेन) को पतला करके सतह उपचार तैयार करें। 3-4 उपकरणों के लिए 1 एमएल का उपयोग करें। वॉल्यूम को 1 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें और 25 जी सुई संलग्न करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सुइयों को बेवल किया जाता है, इसलिए शार्प्स को संभालते समय ध्यान रखें। वांछित होने पर कुंद सुइयों का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. प्रति डिवाइस टाइगॉन ट्यूबिंग का 10-12 सेमी टुकड़ा काटें जिसका इलाज किया जाएगा।
    3. पीक ट्यूबिंग का एक टुकड़ा काटें, लंबाई में ~ 7 सेमी। टाइगॉन ट्यूबिंग के अंत में पीक ट्यूबिंग के कुछ मिलीमीटर डालें, जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, ताकि सुई को टाइगॉन ट्यूबिंग इनलेट्स को पंचर करने से रोकने में मदद मिल सके।
    4. डिवाइस (ओं) को गर्म कक्ष से बाहर निकालें और जलीय इनलेट छेद में टाइगॉन ट्यूबिंग के गैर-पीक अंत डालें।
    5. पीक ट्यूबिंग में सतह उपचार सिरिंज की सुई डालें और तेल कक्ष आउटलेट छेद को कवर करें ( चित्रा 3 बी देखें)।
    6. उपचार को धीरे-धीरे डिवाइस में इंजेक्ट करें और सुनिश्चित करें कि यह बुलबुले के बिना डिवाइस को भरता है। जलीय कक्षों को पहले भरने की प्रतीक्षा करें, उसके बाद छोटे चैनल, और फिर तेल कक्ष। डिवाइस से टाइगॉन ट्यूबिंग निकालें। एक बार डिवाइस भर जाने के बाद, इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आराम करने दें।
    7. केवल तेल (कोई सिलेन) के साथ 5 मिलीलीटर सिरिंज भरें और 25 जी सुई संलग्न करें।
    8. इनलेट और आउटलेट के माध्यम से डिवाइस से सतह के उपचार की आकांक्षा करें। जलीय इनलेट में टाइगॉन ट्यूबिंग डालें, पीक ट्यूबिंग में तेल के साथ सिरिंज डालें, और प्रत्येक डिवाइस को तेल के साथ फ्लश करें। डिवाइस से तेल की आकांक्षा करें।
    9. तेल फ्लश को 2x अधिक दोहराएं। टाइगॉन ट्यूबिंग निकालें।
      नोट: डिवाइस उपयोग करने के लिए तैयार है।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोफ्लुइडिक पीडीएमएस डिवाइस ( ए ) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिजाइन के कंप्यूटर-असिस्टेड डिज़ाइन (ऑटोकैड) ड्राइंग। माइक्रोगेल बूंद गठन तेल चैनल के दोनों ओर चैनलों में होता है, जैसा कि आवर्धित आउटक्रॉपिंग में देखा जाता है। (बी) पीडीएमएस डिवाइस निर्माण का अवलोकन। संक्षिप्त नाम: पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. माइक्रोगेल की माइक्रोफ्लुइडिक पीढ़ी

  1. बहुलक, क्रॉसलिंकर और अन्य जेल अग्रदूत घटकों (यानी, पेप्टाइड्स, ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स) की वांछित सांद्रता को पूर्वनिर्धारित करें। 10x पीबीएस (पीएच 1.5) में खूंटी-एमएएल, आरजीडी और मेथमल (पीईजी-रीढ़ की हड्डी) और 1x पीबीएस (पीएच 7.4) में बायोटिन-मैलिमाइड के 5 μM के साथ एमएमपी -2 क्रॉसलिंकर को भंग करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, जेल अग्रदूत समाधान एक प्रकाशित सूत्रीकरण3 है जिसमें 45.88 मिलीग्राम / एमएल 4-हाथ खूंटी-एमएएल (10 केडीए), 0.82 मिलीग्राम / एमएल आरजीडी, 8.06 मिलीग्राम / एमएल मेथमल, और 4.62 मिलीग्राम / एमएल एमएमपी -2 क्रॉसलिंकर (एंजाइमेटिक रूप से डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर) शामिल हैं। नीचे उल्लिखित विधियां ~ 3 एमएल माइक्रोगेल का उत्पादन करेंगी।
  2. नोवेक तेल में कम से कम 1% तक स्टॉक 5% फ्लोरोसर्फैक्टेंट को पतला करके सर्फेक्टेंट समाधान के 6 एमएल तैयार करें। इस घोल को 10 एमएल सिरिंज में जोड़ें।
    नोट: फ्लोरिनेटेड सर्फेक्टेंट पानी के साथ अमिश्रणीय है, जो शुद्धिकरण चरण में पीबीएस धोने के दौरान जलीय चरण में जेल संक्रमण के दौरान इसे आसानी से हटाने की अनुमति देता है।
  3. टाइगॉन टयूबिंग के तीन टुकड़े काटें जो सिरिंज पंप ऊंचाई के लिए एक उपयुक्त लंबाई हैं।
  4. पीक ट्यूबिंग के दो टुकड़े काटें, लंबाई में ~ 1 इंच। टाइगॉन ट्यूबिंग के दो टुकड़ों के अंत में पीक ट्यूबिंग के कुछ मिलीमीटर डालें, जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, ताकि सुई को टाइगॉन ट्यूबिंग इनलेट को पंचर करने से रोकने में मदद मिल सके।
  5. माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के इनलेट में टाइगॉन ट्यूबिंग के गैर-पीक अंत को डालें। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस आउटलेट में टाइगॉन ट्यूबिंग (अंत में कोई पीक ट्यूबिंग के साथ) के शेष टुकड़े को डालें, जैसा कि चित्रा 4 सी में दिखाया गया है।
  6. 5 मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज में कम से कम 3 मिलीलीटर तेल जोड़ें और इसे 25 जी सुई से संलग्न करें। ध्यान से टायगॉन इनलेट्स में से एक पर पीक ट्यूबिंग में सुई डालें। धीरे से तेल के साथ ट्यूबिंग और डिवाइस फ्लश। एक शंक्वाकार ट्यूब में आउटलेट से तेल ले लीजिए। दूसरे टाइगॉन इनलेट पर तेल फ्लश दोहराएं।
  7. सिरिंज पंप वांछित प्रवाह दरों के लिए सेट करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल जलीय प्रवाह दर के लिए 3 एमएल / घंटा और तेल प्रवाह दर के लिए 6 एमएल / दो अलग-अलग सिरिंज पंपों का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है।
  8. सर्फैक्टेंट युक्त सिरिंज को 25 जी सुई ( चित्रा 4 ए देखें) के माध्यम से तेल इनलेट से कनेक्ट करें और धीरे-धीरे ट्यूबिंग और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के तेल चैनल को प्राइम करने के लिए पर्याप्त तेल वितरित करें।
  9. एक बार डिवाइस और तेल इनलेट स्थापित हो जाने के बाद, एक नए 5 एमएल सिरिंज में 0.5 एमएल तेल जोड़ें, जिसमें जेल अग्रदूत होगा। तेल की इस छोटी मात्रा का उद्देश्य रन के अंत में माइक्रोफ्यूलिडिक डिवाइस के माध्यम से अग्रदूत समाधान को फ्लश करने में मदद करना है।
  10. एक शंक्वाकार ट्यूब में, खूंटी-रीढ़ की हड्डी समाधान के 1.5 मिलीलीटर और क्रॉसलिंकर समाधान के 1.5 एमएल को मिलाएं। 30 एस के लिए भंवर और जल्दी से 5 एमएल सिरिंज के लिए संयुक्त जेल अग्रदूत समाधान हस्तांतरण।
  11. एक 25 जी सुई के माध्यम से जलीय इनलेट के लिए जेल अग्रदूत समाधान के साथ सिरिंज कनेक्ट करें। ट्यूबिंग और जलीय चैनल को प्राइम करने के लिए धीरे-धीरे पर्याप्त समाधान वितरित करें।
  12. संबंधित सिरिंज पंप पर सिरिंज दबाना और प्रेस चलाने ( चित्रा 4 बी देखें)। सुनिश्चित करें कि जलीय और तेल चैनलों दोनों के माध्यम से तरल बह रहा है।
    नोट: पीडीएमएस डिवाइस के भीतर माइक्रोगेल गठन की कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  13. चैनलों से समान आकार के कणों की तलाश करें ( चित्रा 4 डी देखें)। एक शंक्वाकार ट्यूब में आउटलेट से माइक्रोगेल ले लीजिए।

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप ( ए ) एक सिरिंज (नीचे) पर 25 जी सुई के लिए पीक ट्यूबिंग (शीर्ष) और टाइगॉन ट्यूबिंग को जोड़ने के लिए विधि का चित्रण। (बी) सिरिंज पंप, ट्यूबिंग, डिवाइस और माइक्रोस्कोप के साथ माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप। (सी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सेटअप की छवि, दो इनलेट (जलीय और तेल) और एक आउटलेट के साथ। (डी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की योजनाबद्ध और चरण-पायसीकरण डिवाइस में चैनलों से अपेक्षित माइक्रोगेल गठन की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. माइक्रोगेल की शुद्धि और नसबंदी

  1. एक बार जेलेशन पूरा हो जाने के बाद (जेलेशन कैनेटीक्स लक्षण वर्णन में मापांक पठार भंडारण के लिए समय के रूप में निर्धारित), ट्यूब के नीचे से तेल चरण को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ( चित्रा 5 देखें)। फ्लोरीनेटेड कचरे के लिए इसे एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में जमा करें।
    नोट: संग्रह ट्यूब (जैसे, ट्राइथाइलमाइन) में एक कार्बनिक घुलनशील आधार जोड़कर जेलेशन समय को त्वरित किया जा सकता है, लेकिन यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक मजबूत आधार के अलावा किसी भी अनियंत्रित मैलिमाइडको हाइड्रोलाइज कर सकता है। यदि जेलेशन के बाद अतिरिक्त मैलिमाइड्स के माध्यम से माइक्रोगेल को कार्यात्मक बनाना वांछित है, तो ट्राइथाइलमाइन के अलावा छोड़ दें।
  2. 1: 1 अनुपात में माइक्रोगेल संग्रह ट्यूब में अधिक तेल जोड़ें। संग्रह ट्यूब को धीरे-धीरे उलटकर मिलाएं। भंवर मत करो।
  3. चरणों को अलग करने की अनुमति देने के लिए संग्रह ट्यूब ~ 5 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें। तल पर तेल चरण और शीर्ष पर जलीय चरण (माइक्रोगेल) की तलाश करें ( चित्रा 5 देखें)।
  4. तेल धोने को कम से कम 2 गुना अधिक दोहराएं।
  5. जेल के साथ 1: 1 अनुपात में अधिक तेल जोड़ें और जेल अनुपात में 4: 1 पीबीएस में 1 एक्स पीबीएस जोड़ें। कई बार मिश्रण करने के लिए पलटें। परतों को अलग करने के लिए, ~ 30 एस के लिए ~ 2,000 एक्स जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। ट्यूब के तल पर तेल चरण, बीच में जेल, और शीर्ष पर पीबीएस ( चित्रा 5 देखें) के लिए देखो।
  6. एक पिपेट के साथ तेल चरण निकालें और एक अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें।
    नोट: पीबीएस को न निकालें। यदि मूल संग्रह ट्यूब 15 एमएल था तो धोने को जारी रखने के लिए एक बड़ी शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें।
  7. तेल दोहराएं और पीबीएस 2x अधिक धोता है। अंतिम धोने से स्पष्ट करने के लिए अपारदर्शी से संक्रमण करने के लिए जेल की तलाश करें, जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि सर्फैक्टेंट हटा दिया गया था और जेल पीबीएस चरण में है।
  8. सारा तेल निकाल लें। शंक्वाकार ट्यूब से पीबीएस न निकालें।
  9. एक रासायनिक धूआं हुड में, पीबीएस के बराबर मात्रा में ट्यूब में हेक्सेन जोड़ने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। 30 एस के लिए शंक्वाकार ट्यूब भंवर या अच्छी तरह से मिश्रित होने तक। 5 मिनट के लिए 4,696 x g पर अपकेंद्रित्र।
  10. जुदाई के बाद, शीर्ष परत में हेक्सेन, बीच में पीबीएस, और नीचे जेल ( चित्रा 5 देखें) की तलाश करें। हेक्सेन परत को हटा दें और इसे कार्बनिक अपशिष्ट के लिए एक कंटेनर में फेंक दें। पीबीएस की आकांक्षा करें।
  11. हेक्सेन और पीबीएस धोने को कम से कम 2x अधिक दोहराएं या जब तक जेल लगभग पारदर्शी दिखाई न दे ( चित्रा 5 देखें)। पीबीएस 1x के साथ जेल को धो लें ताकि किसी भी शेष हेक्सेन को हटा दिया जाए। 5 मिनट के लिए 4,696 x g पर अपकेंद्रित्र। पीबीएस परत की आकांक्षा करें। जेल गोली परेशान नहीं करने के लिए ध्यान रखें।
    1. कैप, या बुझाने के लिए, माइक्रोगेल में किसी भी अनियंत्रित मैलिमाइड्स, 1 एक्स पीबीएस में एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन का 100 एमएम समाधान तैयार करें और इस समाधान को जेल में जोड़ें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब रोटेटर पर रखें, इसके बाद अनियंत्रित एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कई वॉश करें।
    2. दीर्घकालिक भंडारण (1 वर्ष तक) के लिए, 70% आईपीए में माइक्रोगेल को फिर से निलंबित करें और माइक्रोगेल पर बैक्टीरिया के विकास को रोकने में मदद करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. माइक्रोगेल को निष्फल करने के लिए, जैव सुरक्षा हुड में 4: 1 वी / वी अनुपात में जेल में 70% आईपीए जोड़ें। 30 एस के लिए ट्यूब भंवर, तो 5 मिनट के लिए 4,696 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। एक जैव सुरक्षा हुड में जेल गोली से आईपीए सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा। बाँझ 1x पीबीएस के साथ 3x धोने के बाद 2x अधिक आईपीए वॉश करें।
      नोट: कोशिकाओं या जानवरों के साथ जेल का उपयोग करने से पहले सभी आईपीए को हटा दिया जाना चाहिए।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोगेल शुद्धिकरण प्रक्रिया का अवलोकन। संक्षिप्त नाम: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; आईपीए = आइसोप्रोपिल अल्कोहल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. माइक्रोगेल आकार लक्षण वर्णन

नोट: माइक्रोगेल कणों को आकार देने से पहले अपने अंतिम व्यास में सूजन करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1 एक्स पीबीएस में संतुलित करने की अनुमति देने की सिफारिश की जाती है।

  1. छवि जेल कणों।
    1. 5 मिनट के लिए 4,696 × ग्राम पर एमएपी जेल को स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट करें।
    2. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके, जेल गोली से माइक्रोगेल के 5 μL को हटा दें और एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब (1:200 कमजोर पड़ने) में पीबीएस के 1 एमएल में पतला करें। आवश्यकतानुसार इस कमजोर पड़ने को समायोजित करें।
      नोट: जेल अग्रदूत समाधान के निर्माण के दौरान, बायोटिन-मैलिमाइड के 5 μM को फ्लोरोफोर के साथ माइक्रोगेल लेबलिंग के विकल्प के रूप में जोड़ा और उपयोग किया जा सकता है। इस मामले में, एक स्ट्रेप्टाविडिन-फ्लोरोफोर को 1:300 कमजोर पड़ने (1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक से) पर जोड़ा जा सकता है। इमेजिंग से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए स्ट्रेप्टाविडिन के साथ इनक्यूबेशन की अनुमति दें।
    3. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके, एक स्पष्ट 96-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं के लिए पतला माइक्रोगेल के 100 μL हस्तांतरण।
    4. 10x उद्देश्य के साथ माइक्रोगेल की कल्पना करने के लिए वाइडफील्ड या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। विश्लेषण के लिए माइक्रोगेल की छवियों को प्राप्त करें।
    5. माइक्रोगेल के प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियों के लिए चित्रा 6 देखें।
  2. इमेजजे के साथ कणों का आकार बदलना
    1. इमेजजे में माइक्रोस्कोप से छवि फ़ाइलों को खोलें।
    2. | विश्लेषण करें का चयन करें स्केल सेट करें और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के अनुसार छवि पैमाने सेट करें।
    3. छवि | का चयन करें | टाइप करें 8-बिट।
    4. छवि | का चयन करें | समायोजित करें थ्रेशोल्ड और फिर ड्रॉपडाउन बॉक्स से "ओत्सु" ऑटो-थ्रेशोल्ड विकल्प का चयन करें।
    5. एनालिसिस | पर क्लिक करें माप सेट करें और फेरेट के व्यास का चयन करें और थ्रेसहोल्ड तक सीमित करें।
    6. एनालिसिस | पर क्लिक करें कणों का विश्लेषण करें और माइक्रोगेल के लिए अपेक्षित क्षेत्र आकार सीमा (पिक्सेल ^ 2 में) दर्ज करें (विश्लेषण से छोटे मलबे को बाहर करने के लिए)। 0.75-1.00 में परिपत्रता परिवर्तित करें और | दिखाएँ का चयन करें रूपरेखा। प्रदर्शन परिणामों की जाँच करें और किनारों पर बाहर करें।
      नोट: परिपत्रता आकार फ़िल्टर छवि सीमा पर माइक्रोगेल को बाहर करता है जो एक गलत व्यास माप उत्पन्न कर सकता है।
    7. विश्लेषण कण मॉड्यूल चलाएँ।
    8. आउटपुट की प्रतीक्षा करें, जो प्रत्येक कण का फेरेट का व्यास है, और इन परिणामों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
    9. इस प्रोटोकॉल में, माइक्रोगेल आकार में विषमता निर्धारित करने के लिए पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) की गणना करें। जनसंख्या को परिभाषित करने के लिए कम से कम 100 माइक्रोगेल का विश्लेषण करें: 1.00-1.05 की एक पीडीआई सीमा एक मोनोडिस्पर्स आबादी को परिभाषित करती है, और 1.05 से अधिक पीडीआई एक पॉलीडिस्पर्स आबादी को परिभाषित करती है। पीडीआई की गणना करने के लिए समीकरण (2), समीकरण (3), और समीकरण (4) का उपयोग करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
      Equation 13 (2)
      Equation 14 (3)
      Equation 15 (4)

Figure 6
चित्रा 6: माइक्रोगेल की प्रतिनिधि छवियां (ए) माइक्रोगेल आबादी ए की फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल छवि, (बी) थ्रेसहोल्ड माइक्रोगेल की छवि, और (सी) इमेजजे विश्लेषण के बाद कण रूपरेखा। (डी) माइक्रोगेल आबादी बी की फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल छवि और (ई) माइक्रोगेल की प्रेषित प्रकाश छवि (माइक्रोगेल लगभग पारदर्शी हैं)। (एफ) इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित इमेजजे विश्लेषण से प्रतिनिधि परिणामों का चित्रण। दोनों माइक्रोगेल आबादी में अपेक्षाकृत मोनोडिस्पर्स पीडीआई हैं। माइक्रोगेल की दोनों आबादी को 3 एमएल / एच जलीय प्रवाह दर और 6 एमएल / एच तेल प्रवाह दर के साथ संश्लेषित किया गया था। हालांकि, माइक्रोगेल आकार में अंतर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस चरण आकार में अंतर के कारण है। उदाहरण के लिए, माइक्रोगेल जनसंख्या ए को 11 μm के चैनल चरण आकार के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के साथ संश्लेषित किया गया था, और माइक्रोगेल जनसंख्या बी को 40 μm के चरण आकार वाले डिवाइस में संश्लेषित किया गया था। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: पीडीआई = पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. माइक्रोपोरस एनील्ड कण (एमएपी) पाड़ एनीलिंग

  1. 1 एक्स पीबीएस (पीएच 7.4) में 2 एमएम लिथियम फिनाइल -2,4,6-ट्राइमेथिलबेंज़ोइलफॉस्फिनेट (एलएपी) का स्टॉक समाधान बनाएं।
  2. जेल वॉल्यूम के बराबर 1 एक्स पीबीएस की मात्रा में एलएपी स्टॉक समाधान को 0.2 एमएम तक पतला करें। यदि सेल अध्ययन या पशु अध्ययन के लिए एलएपी फोटोइनिशिएटर का उपयोग करते हैं, तो उपयोग करने से पहले समाधान को निष्फल करना सुनिश्चित करें।
  3. 5 मिनट के लिए 4,696 × ग्राम पर एमएपी जेल को स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
  4. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके, जेल की वांछित मात्रा को एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 1: 1 वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में जेल में 0.2 एमएम एलएपी जोड़ें (अंतिम एलएपी एकाग्रता 0.1 एमएम है)।
  6. मिश्रण भंवर और अंधेरे में कम से कम 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. जेल गोली करने के लिए 5 मिनट के लिए 18,000 × ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
  8. ध्यान से जेल गोली से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  9. एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक के साथ लक्ष्य स्थान पर एमएपी जेल स्थानांतरण।
  10. पाड़ को एनील करने के लिए 113 एस के लिए नमूने के लिए केंद्रित प्रकाश (365 एनएम, 8.66 एमडब्ल्यू / सेमी2) लागू करें।
    नोट: 113 एस के एनीलिंग समय को अनुकूलित किया गया है जैसा कि पहले 0.1 एमएम14 की एलएपी एकाग्रता के लिए प्रकाशित किया गया था, लेकिन विभिन्न फोटोइनिशिएटर सांद्रता के लिए अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

Figure 7
चित्रा 7: एमएपी पाड़ एनीलिंग (ए) एमएपी पाड़ एनीलिंग की योजनाबद्ध। जब एक फोटोइनिशिएटर और प्रकाश के संपर्क में आता है, तो मेथमल मैक्रोमर पर मेथैक्रिलामाइड कार्यात्मक समूह एक क्लिक फोटोपॉलिमराइजेशन प्रतिक्रिया से गुजरते हैं, जो माइक्रोगेल की सतहों को एक साथ बांधता है। (बी) छिद्रों में डेक्सट्रान (लाल) के साथ, 3 डी पक आकार में एक साथ एनील किए गए एमएपी माइक्रोगेल (हरे) की दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप छवि के 3 डी रेंडरिंग (इमारिस) का चित्रण। (सी) एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप छवि के 3 डी रेंडरिंग (इमारिस) का चित्रण एक एमएपी मचान की सरंध्रता दिखा रहा है जिसे फ्लोरोसेंट 70 केडीए डेक्सट्रान (लाल) के साथ सुगंधित किया गया है। स्केल सलाखों = (बी) 100 μm, (C) 70 μm। संक्षिप्त नाम: एमएपी = माइक्रोपोरस एनील्ड कण; मेथमल = कस्टम एनीलिंग मैक्रोमर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक एमएपी मचान में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोगेल बिल्डिंग ब्लॉकों को संश्लेषित करने के लिए आवश्यक सभी चरणों को रेखांकित करना है। मेथमल एनीलिंग मैक्रोमर अत्यधिक चयनात्मक और कुशल है और कई बहुलक रीढ़ की हड्डी के साथ संगत है14. यह महत्वपूर्ण है कि 20 केडीए पीईजी-मैलिमाइड के कम से कम 67% -75% को उच्च एनीलिंग दक्षता सुनिश्चित करने के लिए मेथैक्रिलामाइड कार्यात्मक समूहों के साथ संशोधित किया जाता है। प्रतिशत संशोधन सबसे आसानी से 1एच-एनएमआर स्पेक्ट्रा चोटियों का विश्लेषण करके निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। एक विस्कोमीटर द्वारा निर्धारित जेलेशन कैनेटीक्स, प्रत्येक जेल फॉर्मूलेशन के लिए विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण मीट्रिक है। यह प्रोटोकॉल एक जेल अग्रदूत समाधान का उपयोग करता है जिसमें एमएएल समूह के साथ एक खूंटी रीढ़ की हड्डी होती है, जो माइक्रोगेल जेलेशन के लिए थियोल-कार्यात्मक क्रॉसलिंकर के साथ कुशलतापूर्वक प्रतिक्रिया करती है। हालांकि, कई हाइड्रोगेल रसायन विज्ञान का उपयोग यहां वर्णित उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक विधि के माध्यम से माइक्रोगेल बनाने के लिए किया जा सकता है। जेलेशन की शुरुआत का समय माइक्रोफ्लुइडिक माइक्रोगेल पीढ़ी की अवधि में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। यह एक जेल अग्रदूत पीएच है कि 30 मिनट (चित्रा 2) और 2 घंटे के बीच जेलेशन शुरू कर सकते हैं चुनने की सिफारिश की है।

यदि जेलेशन का समय बहुत तेज़ है, तो जेल अग्रदूत समाधान माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर पॉलीमराइज़ करना शुरू कर देगा और चैनलों को रोक देगा। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि थायोलेटेड लिगैंड सांद्रता (जैसे, आरजीडी) को बदलने से जेलेशन के दौरान नेटवर्क गठन पर प्रभाव पड़ सकता है और फॉर्मूलेशन को समायोजित करके इसका हिसाब लगाने की आवश्यकता हो सकती है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण चरण थकाऊ हो सकते हैं, लेकिन सफलतापूर्वक बंधुआ डिवाइस के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। यह प्रोटोकॉल एक उच्च-थ्रूपुट, समानांतर, चरण-पायसीकरण माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करता है जिसे डी रूट एट अल .13 द्वारा डिजाइन से अनुकूलित किया गया था, और सिलिकॉन वेफर फैब्रिकेशन को माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी कंपनी को आउटसोर्स किया गया था। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित चरणों का उपयोग एसयू -8 सिलिकॉन वेफर फोटोमास्क पर नक़्क़ाशीदार किसी भी डिवाइस डिज़ाइन के साथ किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फोटोमास्क पर चैनलों के चरण आकार को डिवाइस निर्माण के दौरान अनुकूलित किया जाना चाहिए, क्योंकि यह माइक्रोगेल कणों के आकार को प्रभावित करेगा।

माइक्रोगेल की माइक्रोफ्लुइडिक पीढ़ी के लिए प्रवाह दरों को जेलेशन समय, वांछित कण आकार और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिजाइन जैसे कारकों के आधार पर प्रत्येक जेल फॉर्मूलेशन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उच्च थ्रूपुट डिवाइस का उपयोग करते समय, जलीय चरण के लिए प्रवाह दर 5 एमएल / एच जितनी अधिक हो सकती है चित्रा 4 बी इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उच्च-थ्रूपुट उपकरणों के लिए सेटअप दिखाता है। यदि डिवाइस सही ढंग से चल रहा है, तो माइक्रोगेल गठन चित्रा 4 डी में दिखाए गए समान दिखना चाहिए। शुद्धिकरण से पहले, माइक्रोगेल अपारदर्शी होंगे। विभिन्न तेल, पीबीएस, और हेक्सेन धोने को पूरा करने के बाद, जेल चित्रा 5 में प्रतिनिधि छवि की तरह स्पष्ट दिखना चाहिए। यदि माइक्रोगेल में फ्लोरोफोर को शामिल किया जाता है, तो शुद्ध उत्पाद में थोड़ा रंगीन टिंट हो सकता है लेकिन फिर भी पारदर्शी के करीब होना चाहिए। शुद्धिकरण और सूजन के बाद, माइक्रोगेल आकार में बहुत समान होना चाहिए और 1.00 और 1.05 के बीच पीडीआई होना चाहिए, जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। फोटोएनीलिंग एमएपी मचानों के लिए विभिन्न फोटोइनिशिएटर का उपयोग किया जा सकता है। यदि एलएपी के विकल्प का उपयोग करते हुए, यहां वर्णित है, तो किसी को एनीलिंग कैनेटीक्स का निर्धारण करना चाहिए जैसा कि पहलेवर्णित है 14. इसके अतिरिक्त, फोटोएनीलिंग के लिए विभिन्न प्रकाश स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि प्रकाश स्रोत फोटोइनिशिएटर से मेल खाता है। प्रकाश स्रोत को कैलिब्रेट और फोकस करना सुनिश्चित करना चाहिए। एनीलिंग समय और प्रकाश की तीव्रता को जेल सूत्रीकरण और फोटोइनिशिएटर एकाग्रता के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित एनीलिंग विधि का उपयोग इन विट्रो और विवो अध्ययन ों के लिए किया जा सकता है। एनीलिंग के बाद, माइक्रोगेल एक छिद्रपूर्ण मचान बनाएंगे जिसे दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 7 बी-सी) के साथ कल्पना की जा सकती है।

Discussion

यह प्रोटोकॉल माइक्रोगेल को संश्लेषित करने और चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करता है, जो माइक्रोपोरस एनील्ड कण (एमएपी) मचान के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में काम करते हैं। यह प्रोटोकॉल वर्दी माइक्रोगेल की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जिसे प्रवाह-फोकसिंग माइक्रोफ्लुइडिक्स 1,4,7,9 (उच्च मोनोडिस्पेरिस्टी, कम उपज), बैच पायस 6,10, और इलेक्ट्रोस्प्रेइंग 5,12 जैसे अन्य तरीकों से प्राप्त नहीं किया जा सकता है (कम मोनोडिस्पर्सिटी, उच्च उपज)। यहां वर्णित विधियों के साथ, मोनोडिस्पर्स माइक्रोगेल को एमएपी मचानों में उपयोग के लिए बनाया जा सकता है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों (जैसे, सेल डिलीवरी, घाव भरने) के लिए किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का निर्माण है। यदि उपकरणों को सही ढंग से नहीं बनाया जाता है, तो यह माइक्रोगेल गठन और मोनोडिस्पर्सिटी पर नकारात्मक डाउनस्ट्रीम प्रभाव डाल सकता है। इलाज से पहले पीडीएमएस में कलाकृतियों (यानी, बुलबुले, धूल) की शुरूआत को रोकना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह चैनलों को रोक सकता है और माइक्रोगेल गठन को काफी प्रभावित कर सकता है। इसे यथासंभव कम करने के लिए, किसी भी धूल को हटाने के लिए टेप का उपयोग करना चाहिए, उपकरणों को धूल मुक्त कंटेनर में स्टोर करना चाहिए, और यदि संभव हो तो धूल मुक्त हुड में काम करना चाहिए। सतह उपचार के साथ सर्वोत्तम परिणामों के लिए उपकरणों को 60 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की भी सिफारिश की जाती है।

पीडीएमएस उपकरणों को डालते समय, एक समान मोटाई बनाए रखना महत्वपूर्ण है जो बायोप्सी पंच की लंबाई के बराबर या उससे कम है। यदि डिवाइस बहुत मोटा है, तो बायोप्सी पंच सभी तरह से प्रवेश करने में असमर्थ होगा। बायोप्सी पंच और / या टयूबिंग डालने के साथ छिद्रण करते समय पीडीएमएस डिवाइस इनलेट / आउटलेट को फाड़ना भी महत्वपूर्ण नहीं है। पीडीएमएस डिवाइस में एक आंसू इनलेट / आउटलेट से लीक का कारण होगा, जिससे जेल अग्रदूत समाधान का नुकसान हो सकता है। यदि पीडीएमएस डिवाइस में लीक हो रहा है, तो सबसे अच्छा समाधान यह है कि इसे जितनी जल्दी हो सके एक नए डिवाइस के साथ बदल दिया जाए।

जब प्लाज्मा-उपचार डिवाइस, 30 एस के लिए शुद्ध ऑक्सीजन और प्लाज्मा-उपचार के उपयोग ने ग्लास स्लाइड में पीडीएमएस का पालन करने के लिए सर्वोत्तम परिणाम उत्पन्न किए हैं। यदि डिवाइस सही ढंग से बंधन नहीं करता है (यानी, पीडीएमएस को प्लाज्मा उपचार के बाद भी ग्लास स्लाइड से उठाया जा सकता है), तो किसी को दोबारा जांचना चाहिए कि प्लाज्मा ट्रीटर सही ढंग से काम कर रहा है और डिवाइस और स्लाइड को अच्छी तरह से साफ किया गया है। सही सिलेन सतह उपचार का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है, और, सर्वोत्तम परिणामों के लिए, पीडीएमएस उपकरणों को उपयोग से पहले सीधे सतह-इलाज किया जाना चाहिए। सतह उपचार के अन्य तरीकों, जैसे कि रासायनिक वाष्प जमाव, का भी उपयोग किया जा सकता है।

एक और महत्वपूर्ण कदम माइक्रोगेल गठन के लिए पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का सही ढंग से उपयोग कर रहा है। यह कम से कम 2: 1 के प्रवाह दर अनुपात का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (यह प्रोटोकॉल 6 एमएल / एच तेल प्रवाह दर और 3 एमएल / एच जलीय प्रवाह दर का उपयोग करता है), लेकिन इसे वांछित माइक्रोगेल आकार प्राप्त करने के लिए ट्यून किया जा सकता है। माइक्रोगेल अग्रदूत समाधान का पीएच भी डिवाइस के क्लॉगिंग को रोकने के लिए अनुकूलित करने के लिए एक महत्वपूर्ण मीट्रिक है। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) माइकल-प्रकार के अतिरिक्त रसायन विज्ञान में थियोलेट गठन को तेज करता है, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पीबीएस सांद्रता माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में माइक्रोगेल जेलेशन के लिए सर्वोत्तम परिणाम देती है। एक बार सिरिंज पंप शुरू हो जाने के बाद, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में कुछ बुलबुले हो सकते हैं, लेकिन इसे कुछ मिनटों के बाद संतुलित करना चाहिए। माइक्रोस्कोप के साथ माइक्रोगेल गठन की निगरानी करने की सिफारिश की जाती है। यदि प्रवाह इस वीडियो के समान नहीं दिखता है और / या बड़े कणों का उत्पादन करने वाले कुछ चैनल हैं, तो यह सतह उपचार चरण के साथ मुद्दों के कारण होने की संभावना है। सबसे अच्छा समाधान डिवाइस को एक के साथ बदलना है जिसे ताजा सतह-उपचारित किया गया है।

यदि माइक्रोगेल एकजुट दिखाई देते हैं, तो यह फ्लोरोसर्फैक्टेंट की अपर्याप्त एकाग्रता के कारण हो सकता है। अनुशंसित समाधान तेल चरण में सर्फेक्टेंट के डब्ल्यूटी% को बढ़ाना है। हालांकि, सर्फैक्टेंट की उच्च सांद्रता का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि शुद्धिकरण चरण के दौरान इसे हटाना अधिक कठिन हो सकता है। केवल एक बार माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, लेकिन उपकरणों का पुन: उपयोग किया जा सकता है यदि किसी भी जलीय घोल को हटाने के लिए उपयोग के तुरंत बाद नोवेक तेल के साथ फ्लश किया जाता है जो डिवाइस में जेल कर सकता है और चैनलों को रोक सकता है। जबकि एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस माइक्रोगेल (एमएल / एच) की उच्च-थ्रूपुट मात्रा का उत्पादन कर सकता है, इस उत्पादन दर को समानांतर में कई माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है।

एमएपी पाड़ असेंबली का एनीलिंग चरण कट्टरपंथी पोलीमराइजेशन के प्रकाश-सक्रिय फोटोइनिशिएटर के उपयोग पर निर्भर करता है, और वांछित अनुप्रयोग के आधार पर फोटोइनिशिएटर का चयन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लंबी लहर यूवी प्रकाश का उपयोग करते समय एलएपी फोटोइनिशिएटर में तेजी से एनीलिंग समय (<30 एस) होता है, जिसका इन विट्रो14 में सेल व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। हालांकि, यह तरंग दैर्ध्य ऊतक16 द्वारा अत्यधिक अवशोषित होता है और विवो में इन विट्रो के रूप में उच्च एनीलिंग प्रभावकारिता नहीं हो सकती है।

इओसिन वाई दृश्यमान तरंग दैर्ध्य (505 एनएम) द्वारा सक्रिय एक और फोटोइनिशिएटर है और ऊतक में गहरी पैठ है, जो ऊतक के नीचे एनील होने के लिए एमएपी मचान की क्षमता को बढ़ाता है। हालांकि, ईओसिन वाई एनीलिंग के लिए आवश्यक लंबे प्रकाश जोखिम समय मुक्त कणों के लिए सेल एक्सपोजर को लम्बा खींच सकते हैं और इन विट्रो14 में सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं। अत्यधिक समान माइक्रोगेल बिल्डिंग ब्लॉकों की उच्च-थ्रूपुट पीढ़ी के लिए इन विधियों का उपयोग एमएपी मचान-केंद्रित अनुसंधान में तेजी लाएगा और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए इंजेक्शन योग्य छिद्रपूर्ण सामग्री के क्षेत्र में अग्रिम ज्ञान होगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक मूल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिज़ाइन के साथ उनकी सहायता के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में जो डी रूट और डि कार्लो लैब को स्वीकार करना चाहते हैं, जो रिपोर्ट किए गए डिवाइस से विकसित किया गया था, साथ ही पीडीएमएस डिवाइस निर्माण और समस्या निवारण में उनके शुरुआती मार्गदर्शन के लिए। चित्रा योजनाबद्धता Biorender.com के साथ बनाई गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminoethanethiol hydrochloride Acros Organics AC153770250 For MethMal Synthesis
MW: 113.61 Da
35 mm plate rotor HAAKE P35/Ti Geometry for HAAKE viscometer
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) NOF AMERICA Corporation SUNBRIGHT PTE-100MA For microgel precursor solution
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) NOF AMERICA Corporation SUNBRIGHT PTE-200MA For MethMal Synthesis
Molecular weight specific to each batch
BD Syringe with Luer-Lok Tips Becton Dickinson Disposable plastic syringes
Biopsy punch Mitex MLTX33-31A-P/25 1.5 mm diameter
Chloroform-d Acros Organics AC209561000 For MethMal Synthesis
Collimated LED Light Source ThorLabs M365LP1-C1 365 nm
Culture dish (15 cm) Corning CLS430599 150 mm x 25 mm
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) Oakwood Chemical 151882 For MethMal Synthesis
MW: 276.72 Da
Fluorosurfactant Ran Technologies 008-Flurosurfactant-5wtH-200G 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500
FreeZone Triad Freeze Dry System Labconco 7400000 Series For MethMal Synthesis
Lyophilizer
Glass slides Fisher Scientific 12-550-A3 Plain glass slides, uncoated
HAAKE Rheowin viscometer HAAKE
ImageJ version 1.8.0_172
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump Kd Scientific 
LED Driver ThorLabs DC2200
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich 900889 Photoinitiator
Methacrylic Acid Sigma Aldrich 155721 For MethMal Synthesis
MW: 86.09 Da
Density: 1.015g/mL
Microfluidic device SU8-Si master wafer FlowJem N/A Custom-made, with silanization
MMP-2 degradable crosslinker FlowJem Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2
Needles (25 G, beveled) BD 305122 Length: 15.88 mm
Gauge: 0.5 mm
Novec 7500 3M 7100025016 Fluorinated oil
Oxygen Praxair UN1072 Compressed
Peek tubing Trajan Scientific 03-350-523 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) Sigma-Aldrich 448931 For surface treatment
Phosphate Buffered Saline Fisher BioReagants BP3994 Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001-HP
Razor blade Fisher Scientific 12-640
RGD cell adhesive peptide WatsonBio Sciences Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2
Rheowin software HAAKE  Software compatible with HAAKE viscometer
Scalpel blade Bard-Parker 371210 Size: #10
Scalpel handle Bard-Parker 371030 Size: #3
Sodium Chloride Fisher BioReagents BP358-1 For MethMal Synthesis
MW: 58.44 Da
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Chemical 2065622 Base and curing agent
Triethylamine Fisher Scientific O4884-100 For MethMal Synthesis
MW: 101.19 Da
Density: 0.73g/mL
Tygon tubing Saint Gobain Performance Plastics AAD04103 ID: 0.51 mm
OD: 1.52 mm
Varian Inova 500 Spectrometer Varian NMR
Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
माइक्रोपोरस एनील्ड पार्टिकल मचान के लिए माइक्रोगेल बिल्डिंग ब्लॉक्स का माइक्रोफ्लुइडिक संश्लेषण
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Roosa, C., Pruett, L., Trujillo, J., … More

Roosa, C., Pruett, L., Trujillo, J., Rodriguez, A., Pfaff, B., Cornell, N., Flanagan, C., Griffin, D. R. Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold. J. Vis. Exp. (184), e64119, doi:10.3791/64119 (2022).

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