Summary
Detta protokoll beskriver en uppsättning metoder för att syntetisera mikrogelbyggstenarna för mikroporös glödgad partikelställning, som kan användas för en mängd olika regenerativa medicinska applikationer.
Abstract
Den mikroporösa glödgade partikelplattformen (MAP) är en underklass av granulära hydrogeler. Den består av en injicerbar uppslamning av mikrogeler som kan bilda en strukturellt stabil byggnadsställning med cellskalans porositet in situ efter ett sekundärt ljusbaserat kemiskt tvärbindningssteg (dvs. glödgning). MAP-ställningen har visat framgång i en mängd olika applikationer för regenerativ medicin, inklusive dermal sårläkning, röstveckförstoring och stamcellsleverans. Denna uppsats beskriver metoderna för syntes och karakterisering av poly(etylenglykol) (PEG) mikrogeler som byggstenar för att bilda en MAP-ställning. Dessa metoder inkluderar syntesen av en anpassad glödgningsmakromer (MethMAL), bestämning av mikrogelprekursorgeleringskinetik, tillverkning av mikrofluidiska anordningar, mikrofluidisk generering av mikrogeler, mikrogelrening och grundläggande ställningskaraktärisering, inklusive mikrogelstorlek och ställningsglödgning. Specifikt kan de mikrofluidiska metoder med hög genomströmning som beskrivs häri producera stora volymer mikrogeler som kan användas för att generera MAP-byggnadsställningar för önskad applikation, särskilt inom regenerativ medicin.
Introduction
MAP-ställningsplattformen är ett injicerbart biomaterial som helt består av hydrogelmikropartiklar (mikrogeler) som ger mikroporositet i cellskala när de är tvärbundna tillsammans, vilket möjliggör nedbrytningsoberoende cellmigration och bulkvävnadsintegration1. På grund av dess förmåga att snabbt integreras med värdvävnad och i sig låg immunogenicitet har MAP-ställningsplattformen visat preklinisk tillämplighet för en mängd olika regenerativa läkemedelsterapier 2,3,4,5,6,7,8,9,10, inklusive accelererande dermal sårläkning 1,3 ,11, revaskulariserande hjärnslaghåla7, leverera mesenkymala stamceller2 och tillhandahålla vävnadsbulk för att behandla glottisk insufficiens6. MAP har också visat sig förmedla antiinflammatoriska effekter till värdvävnad genom rekrytering av M2-makrofager3 och kan till och med ställas in för att främja ett Th2 "vävnadsreparation" immunsvar8. Dessa gynnsamma egenskaper hos MAP-ställningsplattformen gör att den kan utökas till ett brett spektrum av kliniska applikationer.
Tidigare publicerade metoder för att generera mikrogeler för MAP-ställningsbildning har inkluderat flödesfokuserande droppmikrofluidik 1,4,7,9, elektrosprutning 5,12 och overheadspinning med batchemulsion 6,10. Droppmikrofluidikmetoden kan producera partiklar med hög monodispersitet men använder mycket långsamma flödeshastigheter som ger låga utbyten av partiklar (μL/h). Alternativt kan elektrosprutnings- och batchemulsionsmetoderna producera en hög volym partiklar, men med hög partikelpolydispersitet. Detta protokoll använder en mikrofluidisk metod med hög genomströmning för att producera mikrogeler med en monodisperspopulation, baserat på arbete av de Rutte et al13. Denna metod använder mjuka litografitekniker för att göra en polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk enhet från en fotomask, som sedan binds till en glasskiva. Enhetsdesignen är beroende av stegemulgering för att generera en hög volym mikrogelpartiklar (ml / h). Den monodispersitet som kan uppnås med denna metod ger överlägsen kontroll av porositet jämfört med andra tekniker, eftersom monodispersmikrogeler kan bilda byggnadsställningar med mer enhetliga porstorlekar2.
Metoderna för att syntetisera och karakterisera de enskilda mikrogelerna som kan fungera som byggstenar för MAP-ställningar beskrivs i detta manuskript, särskilt när det gäller att skapa mikrogeler som består av en PEG-ryggrad med en maleimid (MAL) -grupp, som lätt deltar i effektiv tillägg av Michael-typ med tiolfunktionaliserade tvärbindare för mikrogelgelering. För att frikoppla mikrogelgelering från MAP-ställningsglödgning beskriver detta manuskript också hur man syntetiserar en publicerad14 anpassad glödgningsmakromer, MethMAL, som är en heterofunktionell metakrylamid / maleimid 4-arm PEG-makromer. De metaakrylamidfunktionella grupperna deltar lätt i fotopolymerisation av fria radikaler (för mikrogelglödgning), samtidigt som de förblir relativt inerta mot de förhållanden som främjar tillägg av Michael-typ för MAL-funktionella grupper.
Dessutom beskriver detta manuskript protokollen för att skapa PDMS-mikrofluidiska enheter, bestämma mikrogelgeleringskinetik och karakterisera mikrogelstorlek. Den sista delen av manuskriptet beskriver MAP-ställningsglödgning, vilket är när mikrogelerna övergår på plats till en bulkställning genom ett sekundärt, fotoinitierat tvärbindningssteg som kovalent binder samman mikrogelernas ytor. Det är viktigt att notera att det finns andra glödgningsmetoder som kan implementeras i MAP-ställningssystem som inte är beroende av ljusbaserade kemier, såsom enzymmedierad glödgning, som tidigare beskrivits1. Sammantaget kan dessa metoder användas direkt eller användas med olika hydrogelformuleringskemier (t.ex. hyaluronsyrabaserade) för att generera MAP-ställningar för alla applikationer.
Protocol
1. MethMAL-glödgning makromersyntes
OBS: Detta protokoll är specifikt för att modifiera 1 g PEG-maleimid men kan skalas upp för att göra större satser.
- Tillsätt 1 g 4-arm 20 kDa PEG-maleimid till 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4) i en liten glasbägare med omrörningsstång. Rör om lösningen vid 300 rpm tills PEG är helt upplöst (~ 30 min).
- Tillsätt 14,65 mg 2-aminoetantiol (0,67:1 tiol [SH] till maleimid [MAL] molärt förhållande) till reaktionen under omrörning vid 300 rpm.
OBS: Tiolgrupperna på 2-aminoetantiol kommer att läggas till cirka tre armar av PEG-MAL via tillägg av Michael-typ, vilket lämnar aminändgrupper.- Observera följande exempelberäkning för mängden 2-aminoetantiol som ska tillsättas:
OBS: För att undvika att mäta en mycket liten mängd, lös upp 100 mg 2-aminoetantiol i 1 ml 1x PBS (pH 7,4) och tillsätt 146,5 μL av den lösningen till reaktionen.
- Observera följande exempelberäkning för mängden 2-aminoetantiol som ska tillsättas:
- Vänta i 1 timme och 10 minuter efter steg 1.2., blanda sedan 160,1 mg 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-yl)-4-metylmorfoliniumklorid (DMTMM, 12:1 molförhållande till PEG) och 32,77 μl metakrylsyra (8:1 molförhållande till PEG) i 5 ml 1x PBS (pH 7,4) i en ny glasbägare och reagera i 50 minuter under omrörning vid 300 rpm.
OBS: I detta steg reagerar metakrylsyran med DMTMM för att bilda en mycket reaktiv ester som sedan kan kopplas till de tillgängliga amingrupperna på PEG.- Observera följande exempelberäkning för att beräkna mängden DMTMM som ska läggas till:
- Observera följande exempelberäkning för beräkning av mängden metakrylsyra som ska tillsättas:
- Observera följande exempelberäkning för att beräkna mängden DMTMM som ska läggas till:
- Tillsätt metakrylsyra/DMTMM-lösningen i bägaren med 20 kDa PEG-MAL/2-aminoetantiollösning.
- Tillsätt 53,56 μl trietylamin (1:1 molförhållande till metakrylsyra) till bägaren och låt reagera över natten under omrörning vid 300 rpm. Täck bägaren med folie för att förhindra att damm och andra föroreningar kommer in i bägaren.
- Observera följande exempelberäkning för mängden trietylamin som ska läggas till:
- Observera följande exempelberäkning för mängden trietylamin som ska läggas till:
- Överför reaktionen på ormskinnsdialysslangar (molekylviktsavgränsning: 3 500 Da).
- Placera dialysslangen i en stor bägare med 1 M NaCl i avjoniserat (DI) vatten (volymen ska täcka slangen helt) i 3 dagar under omrörning vid 300 rpm. Byt 1 M NaCl-lösningen 2x dagligen för totalt sex tvättar.
- Dialysera i 6 timmar i DI-vatten. Byt DI-vatten varje timme för totalt sex tvättar.
- Överför reaktionen till ett 50 ml koniskt rör och frys vid −80 °C.
- Frystorkas röret i minst 72 timmar vid en starttemperatur på −70 °C och en temperaturramp på 0,01 °C/min till 0 °C.
- Bered provet för 1H-NMR genom att lösa upp 25 mg MethMAL i 700 μl kloroform-d och överför det till ett NMR-rör.
- Skaffa 1H-NMR-spektra.
OBS: Spektra i detta protokoll förvärvades med hjälp av en 500 MHz spektrometer med följande parametrar: svepbredd = 6 467,3 Hz, tidsfördröjning = 13,1 s, förvärvstid = 5,1 s, pulstid = 5,1 μs och antal skanningar = 8. - För analys, integrera maleimidtoppen som referens (~ 6,76 ppm) och integrera sedan de två metakrylamidtopparna (~ 5,35 ppm och 5,6 ppm). Dela förhållandet mellan metakrylamidtoppområdena med den totala arean för alla tre topparna för att erhålla procentandelen armar som modifierats med metakrylamid.
OBS: En acceptabel modifiering är 67% -75% metakrylamid funktionell gruppsubstitution. Ett exempel 1H-NMR-spektrum för MethMAL visas i figur 1.- Använd ekvation (1) som substitutionsekvation:
(1)
- Använd ekvation (1) som substitutionsekvation:
(1)
Figur 1: Kemisk struktur och 1H-NMR-spektrum av metMAL. (A) Kemisk struktur: MethMAL-glödgningsmakromeren består av 20 kDa 4-arm poly (etylenglykol) modifierad med tre metakrylamidarmar. (B) Denna struktur genererar toppar vid 5,36 ppm (3) och 5,76 ppm (2) som inte finns i PEG-MAL-spektra, och en maleimidarm, som genererar en topp vid 6,71 ppm (1). Lösningsmedlet, kloroform, genererade en topp vid 7,26 ppm, och kvarvarande vatten i detta prov genererade en topp vid 2,2 ppm (märkt på spektra). I MethMAL-spektra hade maleimidtoppen ett integrerat område på 0,27 och summan av metakrylamidtopparna var 0,73 (0,37 + 0,36). Metakrylamidprocentmodifieringen var 73 % (0,73/(0,27 + 0,73)). Denna siffra är från Pfaff et al.14. Upphovsrätt (2021) American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Microgel prekursor gelering kinetik
OBS: Geleringstiden kan modifieras genom att justera pH-värdet för den buffert som används för att lösa upp gelprekursorkomponenterna. För PEG-maleimidhydrogeler motsvarar ett surare pH vanligtvis långsammare geleringstid eftersom tiolatkoncentrationen minskar vid lägre pH15.
- Bestäm de önskade koncentrationerna av polymer, tvärbindare och andra gelprekursorkomponenter (dvs peptider , glykosaminoglykaner). Lös upp PEG-MAL, RGD och MethMAL (PEG-ryggrad) i 10x PBS (pH 1,5) och MMP-2-tvärbindaren i 1x PBS (pH 7,4).
OBS: I detta protokoll är gelprekursorlösningen en publicerad formulering3, som består av 45,88 mg / ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml MethMAL och 4,62 mg / ml MMP-2 tvärbindare (enzymatiskt nedbrytbar tvärbindare). - Förbered en viskosimeter, eller ett motsvarande instrument, för att övervaka lagrings- och förlustmoduler med en mellanrumsstorlek på 0,4 mm, en skjuvspänning på 1,0, en frekvens på 1,0 Hz och en varaktighet på 10 800 s.
- Fäst en 35 mm plattrotor (P35/Ti) geometri. Använd en fuktad kammare eller en fuktig svamp runt geometrin för att upprätthålla en fuktad miljö.
- Blanda PEG-ryggraden och MMP-tvärbindaren i ett volymförhållande på 1:1.
- Pipettera 400 μL av gelprekursorlösningen på mitten av viskosimetersteget.
- Sänk långsamt geometrin på scenen tills den når den förutbestämda mellanrumsstorleken på 0,4 mm och börja omedelbart övervaka lagring (G') och förlust (G'') moduli i upp till 6 timmar vid rumstemperatur.
OBS: Gelering anses börja när lagringsmodulen blir större än förlustmodulen, och gelering anses vara fullständig när lagringsmodulens platåer. En representativ geleringskinetikkurva visas i figur 2.
Figur 2: Representativ kurva för geleringskinetik för en MAP-gelprekursorlösning (pH 4,5) bestämd med en viskosimeter. Gelering börjar vid den snabba ökningen av lagring (G ') modul, och gelering slutförs när G 'kurva platåer. G'' anger förlustmodulen. Denna siffra är från Pruett et al.3. Upphovsrätt (2021) Wiley-VCH GmBH. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Tillverkning av mikrofluidiska enheter
OBS: Detta protokoll beskriver enhetstillverkning av en mikrofluidisk stegemulgeringsanordning anpassad från de Rutte et al.13, vilket kan ses i figur 3A. Detta protokoll kan dock användas med vilken enhetsdesign som helst som är etsad i en SU-8-skiva. Det rekommenderas att lägga ut SU-8 kiselskiva mastertillverkning, såvida inte lämpliga renrumsanläggningar är tillgängliga för tillverkning.
- Skapa den första mikrofluidiska polydimetylsiloxan (PDMS) från en SU-8-skivfotomask.
- Bered ~ 200 g PDMS genom att blanda basen och härdningsmedlet i ett förhållande på 10: 1 w / w (se materialtabellen).
- Placera SU-8-skivan i en odlingsskål (tejpa kanterna på skivan på skålen), med den mikrofluidiska designen uppåt.
- Häll PDMS i skålen för att skapa ett 1-1,5 cm tjockt lager över skivan. Placera skålen under vakuum för att ta bort eventuella bubblor.
- Låt PDMS härda tills det stelnat (24 timmar vid rumstemperatur eller ~2 timmar vid 60 °C).
- När PDMS har härdat, använd försiktigt ett rakblad eller en skalpell för att skära en rektangel genom PDMS, så att det finns en marginal på 0,5-1 cm runt designen på skivan.
OBS: Använd inte för mycket tryck och var mycket försiktig för att undvika att skada (t.ex. spricka, repa) skivan. - Kila en spatel i ett av snitten och skjut den längs snitten för att separera PDMS från skivan.
OBS: När PDMS separeras från skivan börjar en luftbubbla bildas under PDMS (se figur 3B). - Använd spateln för att försiktigt lyfta rektangeln med PDMS ur skålen.
OBS: Det resulterande gapet i PDMS ovanför skivan kommer att vara formen för mikrofluidiska enheter.
- Skapa efterföljande PDMS-mikrofluidiska enheter från SU-8-skivfotomasken.
- Förbered ~ 15-20 g PDMS per form genom att blanda basen och härdningsmedlet i ett förhållande 10: 1.
- Häll PDMS i det rektangulära gapet i formen för att skapa ett 5 mm lager PDMS ovanför skivan. Sätt formen under vakuum för att ta bort eventuella bubblor.
- Låt PDMS härda tills det är helt stelnat (24 timmar vid rumstemperatur eller 2 timmar vid 60 °C).
- När PDMS har härdat, använd ett rakblad eller en skalpell för att skära PDMS runt rektangelns kanter.
OBS: Använd inte för mycket tryck och var mycket försiktig för att undvika att skada (dvs. spricka) skivan. - Kila en spatel i ett av snitten och skjut den längs snitten för att separera PDMS från skivan.
OBS: När PDMS separeras från skivan börjar en luftbubbla bildas under PDMS. - Använd en 1,5 mm biopsistans för att skapa hål genom PDMS-rektangeln vid de två inloppen och utloppet (se figur 3B).
- Om det finns flera enheter på en enda skiva, använd en spatel eller rakblad för att lätt poängsätta PDMS mellan varje enhet och vik sedan försiktigt PDMS längs de poängsatta linjerna så att PDMS separeras mycket rent på egen hand.
- Förvara PDMS-enheterna i en dammfri behållare.
- Bind PDMS mikrofluidiska enheter till glasskivor.
- Förbered en glasskiva per PDMS mikrofluidisk enhet. Använd tejp, filtrerad luft eller isopropylalkohol (IPA) tvättar för att ta bort damm från bilden. Se till att bilderna är helt torra innan du går vidare till nästa steg.
- Placera en glasskiva och en PDMS-enhet, designsidan uppåt, bredvid varandra på ett litet plastbricka (ett 96-brunns plattlock fungerar bra för detta) och placera det i en plasmarengörare. Stäng dörren och luftflödesventilen och slå på vakuumpumpen. Låt den gå i minst 30 s och stäng sedan av den.
- Anslut syretankens gasrör till luftflödesventilen. Låt plasmakammaren fyllas med syre i 30 s, stäng sedan av syret och stäng luftflödesventilen.
- Slå på vakuumpumpen och ställ in radiofrekvensnivån (RF) till hög. Vänta tills kammaren får en violettrosa färg (se figur 3B). Låt 30 s passera.
- När timern går, stäng av plasma och vakuum. Öppna sedan långsamt luftflödesventilen för att frigöra vakuumet. Ta bort brickan från plasmarengöraren.
- Vänd försiktigt PDMS-enheten på glasskivan för att binda dem. När bindning sker, observera den lilla skillnaden i PDMS-transparensen.
OBS: För bästa resultat, förvara de bundna enheterna vid 60 ° C tills omedelbart före användning.
- Ytbehandling av PDMS mikrofluidiska enheter
- Bered ytbehandlingen genom att späda PFOCTS (triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl)silan) i Novec-olja (1:50). Använd 1 ml för 3-4 enheter. Överför volymen till en 1 ml spruta och fäst en 25 g nål.
OBS: Nålarna som används i detta protokoll är avfasade, så var försiktig när du hanterar vassa föremål. Trubbiga nålar kan också användas om så önskas. - Skär en 10-12 cm bit Tygon-slang per enhet som kommer att behandlas.
- Skär en bit PEEK-slang, ~ 7 cm lång. Sätt i ett par millimeter av PEEK-slangen i änden av Tygon-slangen, som visas i figur 4A, för att förhindra att nålen punkterar Tygon-slanginloppen.
- Ta ut anordningen/anordningarna ur den uppvärmda kammaren och sätt in tygonslangens icke-PEEK-ände i det vattenhaltiga inloppshålet.
- För in nålen på ytbehandlingssprutan i PEEK-slangen och täck oljekammarens utloppshål (se figur 3B).
- Injicera behandlingen i enheten långsamt och se till att den fyller enheten utan bubblor. Vänta tills vattenkamrarna fylls först, följt av de mindre kanalerna och sedan oljekammaren. Ta bort Tygon-slangen från enheten. När enheten har fyllts, låt den vila i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Fyll en 5 ml spruta med endast olja (ingen silan) och fäst en 25 G nål.
- Aspirera ytbehandlingen ur enheten genom inlopp och utlopp. Sätt i Tygon-slangen i vatteninloppet, sätt in sprutan med olja i PEEK-slangen och spola varje enhet med olja. Aspirera oljan ur enheten.
- Upprepa oljespolningen 2x mer. Ta bort Tygon-slangen.
OBS: Enheten är redo att användas.
- Bered ytbehandlingen genom att späda PFOCTS (triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl)silan) i Novec-olja (1:50). Använd 1 ml för 3-4 enheter. Överför volymen till en 1 ml spruta och fäst en 25 g nål.
Bild 3: Mikrofluidisk PDMS-enhet . (A) Datorstödd design (AutoCAD) ritning av mikrofluidisk enhetsdesign. Mikrogeldroppbildning sker i kanalerna på vardera sidan av oljekanalen, vilket ses i den förstorade utmarken. (B) Översikt över tillverkning av PDMS-enheter. Förkortning: PDMS = polydimetylsiloxan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Mikrofluidisk generering av mikrogeler
- Bestäm de önskade koncentrationerna av polymer, tvärbindare och andra gelprekursorkomponenter (dvs peptider , glykosaminoglykaner). Lös upp PEG-MAL, RGD och MethMAL (PEG-ryggrad) i 10x PBS (pH 1,5) och MMP-2-tvärbindaren tillsammans med 5 μM biotin-maleimid i 1x PBS (pH 7,4).
OBS: I detta protokoll är gelprekursorlösningen en publicerad formulering3 bestående av 45,88 mg / ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml MethMAL och 4,62 mg / ml MMP-2 tvärbindare (enzymatiskt nedbrytbar tvärbindare). Metoderna som beskrivs nedan ger ~ 3 ml mikrogeler. - Bered 6 ml ytaktiv lösning genom att späda ut 5% fluor-surfaktant till minst 1% i Nove-olja. Tillsätt denna lösning till en 10 ml spruta.
OBS: Fluorerat ytaktivt ämne är oblandbart med vatten, vilket gör att det lätt kan avlägsnas under gelövergången till vattenfasen under PBS-tvättarna i reningssteget. - Skär tre stycken Tygon-slangar som är lämpliga för sprutpumpens höjd.
- Skär två bitar PEEK-slangar, ~ 1 tum långa. Sätt i ett par millimeter av PEEK-slangen i änden av två delar av Tyton-slangen, som visas i figur 4A, för att förhindra att nålen punkterar Tyton-slanginloppen.
- Sätt i tygonslangens icke-PEEK-ände i inloppen till mikrofluidikanordningarna. Sätt i den återstående delen av Tygon-slangen (utan PEEK-slang i änden) i mikrofluidikapparatens utlopp, som visas i figur 4C.
- Tillsätt minst 3 ml olja till en 5 ml plastspruta och fäst den på en 25 G nål. För försiktigt in nålen i PEEK-slangen på ett av Tygon-inloppen. Spola försiktigt slangen och enheten med olja. Samla oljan från utloppet i ett koniskt rör. Upprepa oljespolningen på det andra Tygon-inloppet.
- Ställ sprutpumparna på önskade flödeshastigheter.
OBS: Detta protokoll använder 3 ml/h för vattenflödet och 6 ml/h för oljeflödet. Det kan vara nödvändigt att använda två separata sprutpumpar. - Anslut sprutan som innehåller ytaktivt ämne till oljeinloppet via en 25 G-nål (se figur 4A) och dosera försiktigt tillräckligt med olja för att fylla slangen och oljekanalen i den mikrofluidiska anordningen.
- När enheten och oljeinloppen har ställts in, tillsätt 0,5 ml olja till en ny 5 ml spruta, som kommer att innehålla gelprekursorn. Syftet med denna lilla mängd olja är att hjälpa till att spola prekursorlösningen genom den mikrofuilidiska enheten mot slutet av körningen.
- Kombinera 1,5 ml av PEG-ryggradslösningen i ett koniskt rör och 1,5 ml av tvärbindningslösningen. Vortex i 30 s och överför snabbt den kombinerade gelprekursorlösningen till 5 ml sprutan.
- Anslut sprutan med gelprekursorlösningen till vatteninloppet via en 25 G nål. Dosera försiktigt tillräckligt med lösning för att fylla slangen och den vattenhaltiga kanalen.
- Spänn fast sprutorna på respektive sprutpumpar och tryck på kör (se figur 4B). Se till att det finns vätska som strömmar genom både vatten- och oljekanalerna.
OBS: Det rekommenderas att använda ett mikroskop för att visualisera mikrogelbildning i PDMS-enheten. - Leta efter partiklar av enhetlig storlek från kanalerna (se figur 4D). Samla mikrogelerna från utloppet i ett koniskt rör.
Figur 4: Mikrofluidisk inställning. (A) Beskrivning av metoden för att ansluta PEEK-slangar (överst) och Tygon-slangar till en 25 G-nål på en spruta (botten). (B) Mikrofluidisk inställning med sprutpumpar, slangar, anordningar och mikroskop. (C) Bild av installationen av mikrofluidikanordningen, med två inlopp (vattenhaltiga och olja) och ett utlopp. (D) Schematisk över den mikrofluidiska anordningen och representativ ljusfältsbild av förväntad mikrogelbildning från kanalerna i en stegemulgeringsanordning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Rening och sterilisering av mikrogeler
- När geleringen är klar (bestämd som tid till lagringsmodulplatå vid karakterisering av geleringskinetik), använd en pipett för att försiktigt avlägsna oljefasen från rörets botten (se figur 5). Deponera detta i en lämplig avfallsbehållare för fluorerat avfall.
OBS: Geleringstiden kan påskyndas genom att tillsätta en organisk löslig bas till uppsamlingsröret (t.ex. trietylamin), men det är viktigt att notera att tillsatsen av en stark bas kan hydrolysera eventuella oreagerade maleimider. Om det är önskvärt att funktionalisera mikrogeler genom överskott av maleimider efter gelering, hoppa över tillsatsen av trietylamin. - Tillsätt mer olja i mikrogeluppsamlingsröret i förhållandet 1: 1. Blanda genom att försiktigt invertera uppsamlingsröret. Virvla inte.
- Låt uppsamlingsröret sätta sig i ~5 min så att faserna kan separeras. Leta efter oljefasen längst ner och vattenfasen (mikrogelerna) på toppen (se figur 5).
- Upprepa oljetvättarna minst 2x mer.
- Tillsätt mer olja i förhållandet 1: 1 med gelén och tillsätt 1x PBS i ett förhållande mellan 4: 1 PBS och gel. Invertera för att blanda flera gånger. För att separera skikten, centrifugera röret vid ~ 2,000 x g i ~ 30 s. Leta efter oljefasen längst ner på röret, gel i mitten och PBS ovanpå (se figur 5).
- Ta bort oljefasen med en pipett och kassera i en avfallsbehållare.
OBS: Ta inte bort PBS. Använd ett större koniskt rör för att fortsätta tvätta om det ursprungliga uppsamlingsröret var 15 ml. - Upprepa olja och PBS tvättar 2x mer. Leta efter gelén för att övergå från ogenomskinlig till klar vid den slutliga tvätten, som visas i figur 5, vilket indikerar att ytaktivt ämne avlägsnades och gelén är i PBS-fasen.
- Ta bort all olja. Ta inte bort PBS från det koniska röret.
- I en kemisk rökhuv, använd en glaspipett för att tillsätta hexaner till röret med samma volym som PBS. Vortex det koniska röret i 30 s eller tills det blandas noggrant. Centrifugera vid 4 696 x g i 5 min.
- Efter separation, leta efter hexaner i det övre lagret, PBS i mitten och gel längst ner (se figur 5). Ta bort hexanskiktet och kassera det i en behållare för organiskt avfall. Aspirera PBS.
- Upprepa hexan och PBS tvättar minst 2x mer eller tills gelén verkar nästan genomskinlig (se figur 5). Tvätta gelén med PBS 1x till så att eventuella kvarvarande hexaner tas bort. Centrifugera vid 4 696 x g i 5 min. Aspirera PBS-lagret. Var försiktig så att du inte stör gelpelleten.
- För att täcka eller släcka eventuella oreagerade maleimider i mikrogelerna, förbered en 100 mM lösning av N-acetyl-L-cystein i 1x PBS och tillsätt denna lösning till gelén. Placera på en rörrotator vid 37 °C över natten, följt av många tvättar med PBS för att avlägsna oreagerad N-acetyl-L-cystein.
- För långvarig lagring (upp till 1 år), återsuspendera mikrogelerna i 70% IPA och förvara vid 4 ° C för att förhindra tillväxt av bakterier på mikrogelerna.
- För att sterilisera mikrogelerna, tillsätt 70% IPA till gelén i ett 4: 1 v / v-förhållande i en biosäkerhetshuv. Vörda röret i 30 s och centrifugera sedan vid 4 696 × g i 5 minuter. Aspirera IPA-supernatanten från gelpelleten i en biosäkerhetshuv. Utför 2x fler IPA-tvättar följt av 3x tvättar med steril 1x PBS.
OBS: All IPA ska tas bort innan gelén används med celler eller djur.
Figur 5: Översikt över mikrogelreningsförfarandet. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; IPA = isopropylalkohol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Karakterisering av mikrogelstorlek
OBS: Det rekommenderas att låta mikrogelpartiklar balansera i 1x PBS över natten vid 37 ° C för att svälla till sin slutliga diameter före dimensionering.
- Bildgelpartiklar.
- Snurra ner MAP-gelén på 4 696 × g i 5 minuter och aspirera supernatanten.
- Ta med hjälp av en förskjutningspipett 5 μL mikrogeler från gelpelleten och späd i 1 ml PBS i ett mikrocentrifugrör (1:200 utspädning). Justera denna utspädning efter behov.
OBS: Under formuleringen av gelprekursorlösningen kan 5 μM biotin-maleimid tillsättas och användas som ett alternativ till märkning av mikrogeler med en fluorofor. I detta fall kan en streptavidin-fluorofor tillsättas vid en utspädning på 1:300 (från 1 mg/ml lager). Tillåt inkubation med streptavidin i minst 15 minuter före avbildning. - Använd en positiv förskjutningspipett och överför 100 μL av de utspädda mikrogelerna till brunnarna på en klar 96-brunnsplatta.
- Använd ett widefield- eller konfokalmikroskop för att visualisera mikrogelerna med ett 10x-mål. Skaffa bilder av mikrogelerna för analys.
- Se figur 6 för representativa konfokala bilder av mikrogeler.
- Dimensionera partiklar med ImageJ
- Öppna bildfilerna från mikroskopet i ImageJ.
- Välj Analysera | Ställ in Skala och ställ in bildskalan enligt mikroskopmålet.
- Välj Bild | Typ | 8-bitars.
- Välj Bild | Justera | Tröskel och välj sedan alternativet "Otsu" automatisk tröskel i listrutan.
- Klicka på Analysera | Ställ in mått och välj Ferets diameter och begränsa till tröskelvärdet.
- Klicka på Analysera | Analysera partiklar och ange det områdesstorleksintervall (i pixel^2) som förväntas för mikrogelerna (för att utesluta små skräp från att analyseras). Ändra cirkularitet till 0,75–1,00 och välj Visa | Konturer. Kontrollera visningsresultat och uteslut på kanter.
OBS: Cirkularitetsformfiltret utesluter mikrogeler på bildkanten som kan ge en felaktig diametermätning. - Kör modulen Analysera partiklar .
- Vänta på utdata, som är Ferets diameter för varje partikel, och exportera dessa resultat till ett kalkylblad.
- I detta protokoll beräknar du polydispersitetsindexet (PDI) för att bestämma heterogeniteten i mikrogelstorlek. Analysera minst 100 mikrogeler för att definiera en population: ett PDI-intervall på 1,00-1,05 definierar en monodisperspopulation och en PDI större än 1,05 definierar en polydisperspopulation. Använd ekvation (2), ekvation (3) och ekvation (4) för att beräkna PDI, enligt beskrivningen nedan.
(2)
(3)
(4)
(2)
(3)
(4)
Figur 6: Representativa bilder av mikrogeler. (A) Fluorescerande konfokal bild av mikrogelpopulation A, (B) bild av tröskelmikrogeler och (C) partikelkonturer efter ImageJ-analys. (D) Fluorescerande konfokal bild av mikrogelpopulation B och (E) överförd ljusbild av mikrogeler (mikrogeler är nästan genomskinliga). (F) Skildring av representativa resultat från ImageJ-analysen som beskrivs i detta protokoll. Båda mikrogelpopulationerna har relativt monodispersa PDI. Båda populationerna av mikrogeler syntetiserades med en 3 ml / h vattenflödeshastighet och en 6 ml / h oljeflödeshastighet. Skillnaden i mikrogelstorlek beror dock på skillnader i stegstorlek för mikrofluidiska enheter. Exempelvis syntetiserades mikrogelpopulation A med en mikrofluidisk anordning med en kanalstegstorlek på 11 μm, och mikrogelpopulation B syntetiserades i en anordning med en stegstorlek av 40 μm. Skalstänger = 100 μm. Förkortning: PDI = polydispersitetsindex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Mikroporös glödgad partikel (MAP) ställningsglödgning
- Skapa en stamlösning av 2 mM litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP) i 1x PBS (pH 7,4).
- Späd LAP-stamlösningen till 0,2 mM i en volym av 1x PBS motsvarande gelvolymen. Om du använder LAP-fotoinitiatorn för cellstudier eller djurstudier, var noga med att sterilisera lösningen före användning.
- Snurra ner MAP-gelén på 4 696 × g i 5 minuter och aspirera supernatanten.
- Använd en positiv förskjutningspipett och överför den önskade volymen gel till ett mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 0,2 mM LAP till gelén i ett volymförhållande på 1:1 (den slutliga LAP-koncentrationen är 0,1 mM).
- Vortex blandningen och inkubera i minst 15 min i mörkret.
- Centrifugera blandningen vid 18 000 × g i 5 minuter för att pelletera gelén.
- Ta försiktigt bort supernatanten från gelpelleten.
- Överför MAP-gelén till målplatsen med en positiv förskjutningspipett.
- Applicera fokuserat ljus (365 nm, 8,66 mW/cm2) på provet i 113 s för att glödga ställningen.
OBS: Glödgningstiden på 113 s har optimerats som tidigare publicerats för LAP-koncentration på 0,1 mM14, men ytterligare optimering för olika fotoinitiatorkoncentrationer kan behövas.
Figur 7: MAP-glödgning av byggnadsställningar . (A) Schematisk bild av MAP-ställningsglödgning. När de utsätts för en fotoinitiator och ljus genomgår metakrylamidfunktionsgrupperna på MethMAL-makromeren en klickfotopolymerisationsreaktion, som binder samman mikrogelernas ytor. (B) Avbildning av en 3D-rendering (Imaris) av en tvåfotonmikroskopbild av MAP-mikrogeler (gröna) glödgade ihop i en 3D-puckform, med dextran (röd) i porerna. (C) Avbildning av en 3D-rendering (Imaris) av en tvåfotonmikroskopbild som visar porositeten hos en MAP-byggnadsställning som har genomsyrats med fluorescerande 70 kDa dextran (röd). Skalstänger = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Förkortningar: MAP = mikroporös glödgad partikel; MethMAL = anpassad glödgningsmakromer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Syftet med detta protokoll är att beskriva alla steg som krävs för att syntetisera mikrogelbyggstenar som ska användas i en MAP-ställning. MethMAL-glödgningsmakromern är mycket selektiv och effektiv och är kompatibel med flera polymerstamnät14. Det är viktigt att minst 67%-75% av de 20 kDa PEG-maleimiderna modifieras med metakrylamidfunktionella grupper för att säkerställa en hög glödgningseffektivitet. Procentuell modifiering kan enklast bestämmas genom att analysera 1 H-NMR-spektratoppar, som visas i figur 1. Geleringskinetiken, bestämd av en viskosimeter, är ett viktigt mått att överväga för varje gelformulering. Detta protokoll använder en gelprekursorlösning bestående av en PEG-ryggrad med en MAL-grupp, som effektivt reagerar med tiolfunktionaliserade tvärbindare för mikrogelgelering. Många hydrogelkemier kan dock användas för att tillverka mikrogeler via den mikrofluidiska metoden med hög genomströmning som beskrivs häri. Tiden till början av gelering kommer att ge insikt i varaktigheten av mikrofluidisk mikrogelgenerering. Det rekommenderas att välja en gelprekursor pH som kan initiera gelering mellan 30 min (figur 2) och 2 h.
Om geleringstiden är för snabb börjar gelprekursorlösningen polymerisera inom mikrofluidikanordningen och täppa till kanalerna. Dessutom är det viktigt att notera att förändrade tiolata ligandkoncentrationer (t.ex. RGD) kan ha effekter på nätverksbildning under gelering och kan behöva beaktas genom att justera formuleringen. Tillverkningsstegen för mikrofluidiska enheter kan vara tråkiga, men representativa resultat av en framgångsrikt bunden enhet visas i figur 3. Detta protokoll använder en parallelliserad, stegemulgerande mikrofluidisk enhet med hög genomströmning som anpassades från en design av de Rutte et al.13, och tillverkningen av kiselskivor outsourcades till ett mikrofluidiskt teknikföretag. Stegen som beskrivs i detta protokoll kan dock användas med vilken enhetsdesign som helst etsad på en SU-8 kiselskiva fotomask. Det är viktigt att notera att stegstorleken på kanalerna på fotomasken måste optimeras under tillverkningen av enheten, eftersom det kommer att påverka storleken på mikrogelpartiklarna.
Flödeshastigheterna för mikrofluidisk generering av mikrogeler bör optimeras för varje gelformulering baserat på faktorer som geleringstid, önskad partikelstorlek och mikrofluidisk enhetsdesign. Om du använder enheten med hög genomströmning kan flödeshastigheterna för vattenfasen gå så högt som 5 ml/h. Bild 4B visar inställningen för enheter med hög genomströmning som används i det här protokollet. Om enheten körs korrekt bör mikrogelbildningen se ut som den som visas i figur 4D. Före rening kommer mikrogelerna att vara ogenomskinliga. Efter att ha slutfört de olika olje-, PBS- och hexantvättarna ska gelén se klar ut som den representativa bilden i figur 5. Om en fluorofor införlivas i mikrogelerna kan den renade produkten ha en svagt färgad nyans men bör fortfarande vara nära genomskinlig. Efter rening och svullnad bör mikrogelerna vara mycket enhetliga i storlek och ha en PDI mellan 1,00 och 1,05, som visas i figur 6. Olika fotoinitiatorer kan användas för fotoglödgning av MAP-byggnadsställningar. Om man använder ett alternativ till LAP, som beskrivs häri, måste man bestämma glödgningskinetiken som tidigare beskrivits14. Dessutom kan olika ljuskällor användas för fotoglödgning, så länge ljuskällan motsvarar fotoinitiatorn. Man måste vara noga med att kalibrera och fokusera ljuskällan. Glödgningstiden och ljusintensiteten kan behöva optimeras baserat på gelformulering och fotoinitiatorkoncentration. Den glödgningsmetod som beskrivs i detta protokoll kan användas för in vitro- och in vivo-studier. Efter glödgning bildar mikrogelerna en porös ställning som kan visualiseras med tvåfotonmikroskopi (figur 7B-C).
Discussion
Detta protokoll beskriver metoder för att syntetisera och karakterisera mikrogeler, som fungerar som byggstenar för mikroporösa glödgade partiklar (MAP) ställningar. Detta protokoll använder ett mikrofluidiskt tillvägagångssätt med hög genomströmning för att generera stora volymer enhetliga mikrogeler, vilket inte kan uppnås med andra metoder såsom flödesfokuserande mikrofluidik 1,4,7,9 (hög monodisperisty, lågt utbyte), batchemulsion 6,10 och elektrosprutning 5,12 (låg monodispersitet, högt utbyte). Med de metoder som beskrivs häri kan monodisperse mikrogeler göras för användning i MAP-ställningar som kan användas för en mängd olika regenerativa medicinska applikationer (t.ex. cellleverans, sårläkning).
Ett kritiskt steg i detta protokoll är skapandet av PDMS-mikrofluidikanordningarna. Om enheterna inte tillverkas korrekt kan detta ha negativa nedströmseffekter på mikrogelbildning och monodispersitet. Det är viktigt att förhindra införandet av artefakter (dvs bubblor, damm) i PDMS innan det härdar, eftersom detta kan täppa till kanalerna och avsevärt påverka mikrogelbildningen. För att mildra detta så mycket som möjligt bör man använda tejp för att ta bort damm, förvara enheterna i en dammfri behållare och arbeta i en dammfri huva, om möjligt. Det rekommenderas också att förvara enheterna vid 60 °C för bästa resultat med ytbehandlingen.
Vid hällning av PDMS-enheterna är det viktigt att upprätthålla en jämn tjocklek som är ungefär lika med eller mindre än längden på biopsistansen. Om enheten är för tjock kommer biopsistansen inte att kunna tränga igenom hela vägen. Det är också viktigt att inte riva PDMS-enhetens inlopp / utlopp medan du stansar med biopsistansen och / eller sätter in slangar. En rivning i PDMS-enheten kommer att orsaka läckage från inloppen / utloppet, vilket kan orsaka förlust av gelprekursorlösningen. Om det läcker ut i en PDMS-enhet är den bästa lösningen att ersätta den med en ny enhet så snabbt som möjligt.
Vid plasmabehandling av enheten har användningen av rent syre och plasmabehandling i 30 s gett de bästa resultaten för att fästa PDMS på glasskivan. Om enheten inte binder korrekt (dvs. PDMS kan fortfarande lyftas från glasskivan efter plasmabehandling) bör man dubbelkontrollera att plasmabehandlaren fungerar korrekt och att enheten och bilderna har rengjorts noggrant. Det är också viktigt att använda rätt silanytbehandling, och för bästa resultat bör PDMS-enheterna ytbehandlas direkt före användning. Andra metoder för ytbehandling, såsom kemisk ångavsättning, kan också användas.
Ett annat viktigt steg är att använda PDMS-mikrofluidikenheterna korrekt för mikrogelbildning. Det rekommenderas att använda ett flödeshastighetsförhållande på minst 2: 1 (detta protokoll använder en 6 ml / h oljeflödeshastighet och en 3 ml / h vattenflödeshastighet), men detta kan ställas in för att uppnå önskad mikrogelstorlek. PH för mikrogelprekursorlösningen är också ett viktigt mått att optimera för att förhindra igensättning av enheten. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) accelererar tiolatbildning i tillsatskemi av Michael-typ, och PBS-koncentrationerna som används i detta protokoll ger de bästa resultaten för mikrogelgelering i mikrofluidiska anordningar. När sprutpumparna har startats kan det finnas några bubblor i de mikrofluidiska kanalerna, men detta bör balansera efter några minuter. Det rekommenderas att övervaka mikrogelbildning med ett mikroskop. Om flödet inte ser ut som i den här videon och/eller om det finns några kanaler som producerar stora partiklar beror det troligen på problem med ytbehandlingssteget. Den bästa lösningen är att ersätta enheten med en som nyligen har ytbehandlats.
Om mikrogelerna verkar vara sammansmältande kan detta bero på en otillräcklig koncentration av fluortensid. Den rekommenderade lösningen är att öka viktprocenten av ytaktivt ämne i oljefasen. En begränsning med att använda höga koncentrationer av ytaktivt ämne är dock att det kan vara svårare att avlägsna under reningssteget. Det rekommenderas att endast använda mikrofluidiska enheter en gång, men enheterna kan återanvändas om de spolas med Nove-olja omedelbart efter användning för att ta bort vattenlösning som kan gela i enheten och täppa till kanalerna. Medan en mikrofluidisk enhet kan producera en volym mikrogeler med hög genomströmning (ml / h), kan denna produktionshastighet skalas genom att använda flera mikrofluidiska enheter parallellt.
Glödgningssteget för MAP-ställningsmontering är beroende av användningen av en ljusaktiverad fotoinitiator av radikalpolymerisation, och fotoinitiatorn kan väljas baserat på önskad applikation. Till exempel har LAP-fotoinitiatorn snabba glödgningstider (<30 s) vid användning av långvågigt UV-ljus, vilket har minimal inverkan på cellviabiliteten in vitro14. Denna våglängd absorberas emellertid starkt av vävnad16 och kanske inte har lika hög glödgningseffekt in vivo som in vitro.
Eosin Y är en annan fotoinitiator som aktiveras av synliga våglängder (505 nm) och har djupare penetration i vävnad, vilket förbättrar MAP-ställningens förmåga att glödgas under vävnad. De långa ljusexponeringstiderna som behövs för Eosin Y-glödgning kan dock förlänga cellexponeringen för fria radikaler och påverka cellviabiliteten in vitro14. Genom att använda dessa metoder för högkapacitetsgenerering av mycket enhetliga mikrogelbyggstenar kommer det att påskynda MAP-ställningsfokuserad forskning och främja kunskap inom området injicerbara porösa material för regenerativ medicin.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Joe de Rutte och Di Carlo Lab vid University of California, Los Angeles, för deras hjälp med den ursprungliga mikrofluidiska enhetsdesignen som den rapporterade enheten utvecklades från, liksom deras tidiga vägledning i PDMS-enhetstillverkning och felsökning. Figurscheman skapades med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148 (2020).
- de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
- Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).
