Summary
Denne protokollen beskriver et sett med metoder for å syntetisere mikrogelbyggesteinene for mikroporøst glødet partikkelstillas, som kan brukes til en rekke regenerative medisinapplikasjoner.
Abstract
Den mikroporøse glødede partikkelplattformen (MAP) er en underklasse av granulære hydrogeler. Den består av en injiserbar oppslemming av mikrogeler som kan danne et strukturelt stabilt stillas med celleskala porøsitet in situ etter et sekundært lysbasert kjemisk tverrbindingstrinn (dvs. glødning). MAP stillas har vist suksess i en rekke regenerative medisinske applikasjoner, inkludert dermal sårheling, vokalfoldforstørrelse og stamcellelevering. Denne artikkelen beskriver metodene for syntese og karakterisering av poly(etylenglykol) (PEG) mikrogeler som byggesteiner for å danne et MAP-stillas. Disse metodene inkluderer syntese av en tilpasset glødemakromer (MethMAL), bestemmelse av mikrogelforløpergeleringskinetikk, mikrofluidisk enhetsfabrikasjon, mikrofluidisk generering av mikrogeler, mikrogelrensing og grunnleggende stillaskarakterisering, inkludert mikrogeldimensjonering og stillasglødning. Spesielt kan de mikrofluidiske metodene med høy gjennomstrømning som er beskrevet her, produsere store mengder mikrogeler som kan brukes til å generere MAP-stillaser for enhver ønsket applikasjon, spesielt innen regenerativ medisin.
Introduction
MAP-stillasplattformen er et injiserbart biomateriale som består utelukkende av hydrogelmikropartikler (mikrogeler) som gir mikroporositet i celleskala når de er tverrbundet sammen, noe som muliggjør nedbrytningsuavhengig cellemigrasjon og bulkvevintegrasjon1. På grunn av sin evne til raskt å integrere med vertsvev og iboende lav immunogenitet, har MAP stillasplattformen vist preklinisk anvendelighet for et bredt spekter av regenerative medisinbehandlinger 2,3,4,5,6,7,8,9,10, inkludert akselererende dermal sårheling 1,3 ,11, revaskularisering av hjerneslagshulrom7, levering av mesenkymale stamceller2, og tilførsel av vevsbulking for å behandle glottisk insuffisiens6. MAP har også vist seg å formidle antiinflammatoriske effekter til vertsvev gjennom rekruttering av M2 makrofager3 og kan til og med justeres for å fremme en Th2 "vevsreparasjon" immunrespons8. Disse gunstige egenskapene til MAP-stillasplattformen gjør at den kan utvides til et mangfoldig utvalg av kliniske applikasjoner.
Tidligere publiserte metoder for generering av mikrogeler for MAP-stillasdannelse har inkludert strømningsfokuserende dråpemikrofluidikk 1,4,7,9, elektrosprøyting 5,12 og overheadspinning med batchemulsjon 6,10. Den dråpemikrofluidiske metoden kan produsere partikler med høy monodispersitet, men bruker svært langsomme strømningshastigheter som gir lave utbytter av partikler (μL / h). Alternativt kan elektrosprayings- og batchemulsjonsmetodene produsere et høyt volum partikler, men med høy partikkelpolydispersitet. Denne protokollen bruker en mikrofluidisk metode med høy gjennomstrømning for å produsere mikrogeler med en monodisperse populasjon, basert på arbeid av de Rutte et al13. Denne metoden benytter myke litografiteknikker for å lage en polydimetylsiloksan (PDMS) mikrofluidisk enhet fra en fotomaske, som deretter bindes til et glassglass. Enhetsdesignet er avhengig av trinnemulgering for å generere et høyt volum mikrogelpartikler (ml / t). Monodispersiteten som kan oppnås med denne metoden gir overlegen kontroll av porøsitet sammenlignet med andre teknikker, siden monodisperse mikrogeler kan danne stillaser med mer ensartede porestørrelser2.
Metodene for å syntetisere og karakterisere de enkelte mikrogelene som kan fungere som byggesteiner for MAP-stillaser er skissert i dette manuskriptet, spesielt når det gjelder å lage mikrogeler som består av en PEG-ryggrad med en maleimid (MAL) gruppe, som lett deltar i effektiv Michael-type tillegg med tiolfunksjonaliserte tverrbindinger for mikrogelgelgelering. For å koble mikrogelgelering fra MAP stillasglødning, beskriver dette manuskriptet også hvordan man syntetiserer en publisert14 tilpasset glødemakromer, MethMAL, som er et heterofunksjonelt metakrylamid / maleimid 4-arm PEG-makromer. De metakrylamidfunksjonelle gruppene deltar lett i fotopolymerisering av frie radikaler (for mikrogelglødning), mens de forblir relativt inerte mot forholdene som fremmer Michael-type tillegg for MAL-funksjonelle grupper.
I tillegg skisserer dette manuskriptet protokollene for å lage PDMS mikrofluidiske enheter, bestemme mikrogelgelgeleringskinetikk og karakterisere mikrogelstørrelse. Den siste delen av manuskriptet beskriver MAP stillasglødning, som er når mikrogelene overføres in situ til et bulkstillas gjennom et sekundært, fotoinitiert tverrbindingstrinn som kovalent binder overflatene til mikrogelene sammen. Det er viktig å merke seg at det finnes andre glødemetoder som kan implementeres i MAP stillassystemer som ikke er avhengige av lysbaserte kjemikalier, for eksempel enzymmediert glødning, som tidligere beskrevet1. Samlet sett kan disse metodene brukes direkte eller brukes med forskjellige hydrogelformuleringskjemier (f.eks. Hyaluronsyrebasert) for å generere MAP-stillaser for enhver applikasjon.
Protocol
1. MethMAL annealing macromer syntese
MERK: Denne protokollen er spesielt for å modifisere 1 g PEG-maleimid, men kan skaleres opp for å lage større batcher.
- Tilsett 1 g 4-arm 20 kDa PEG-maleimid til 10 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) i et lite glassbeger med rørstang. Rør oppløsningen ved 300 o/min til PEG er fullstendig oppløst (~30 min).
- Tilsett 14,65 mg 2-aminoetanetiol (0,67:1 tiol [SH] til maleimid [MAL] molar ratio) til reaksjonen ved omrøring ved 300 o / min.
MERK: Tiolgruppene på 2-aminoetanetiol vil bli lagt til omtrent tre armer av PEG-MAL via Michael-type tillegg, og etterlater aminendegrupper.- Vær oppmerksom på følgende eksempelberegning for mengden 2-aminoetanetiol som skal legges til:
MERK: For å unngå å måle en svært liten mengde, oppløs 100 mg 2-aminoetanetiol i 1 ml 1x PBS (pH 7,4) og tilsett 146,5 μL av den løsningen til reaksjonen.
- Vær oppmerksom på følgende eksempelberegning for mengden 2-aminoetanetiol som skal legges til:
- Vent i 1 time og 10 minutter etter trinn 1.2., bland deretter 160,1 mg 4- (4,6-dimetoksy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-metylmorfoliniumklorid (DMTMM, 12: 1 molforhold til PEG) og 32,77 μL metakrylsyre (8: 1 molar forhold til PEG) i 5 ml 1x PBS (pH 7,4) i et nytt glassbeger og reagerer i 50 minutter med omrøring ved 300 o / min.
MERK: På dette trinnet reagerer metakrylsyren med DMTMM for å danne en svært reaktiv ester som deretter kan kobles til de tilgjengelige amingruppene på PEG.- Følg følgende eksempelberegning for beregning av mengden DMTMM som skal legges til:
- Vær oppmerksom på følgende eksempelberegning for beregning av mengden metakrylsyre som skal tilsettes:
- Følg følgende eksempelberegning for beregning av mengden DMTMM som skal legges til:
- Tilsett metakrylsyre/DMTMM-løsningen i begeret med 20 kDa PEG-MAL/2-aminoetanetioloppløsningen.
- Tilsett 53,56 μL trietylamin(1:1 molar forhold til metakrylsyre) til begeret og la det reagere over natten under omrøring ved 300 o / min. Dekk begeret med folie for å forhindre at støv og andre forurensninger kommer inn i begeret.
- Vær oppmerksom på følgende eksempelberegning for mengden trietylamin som skal legges til:
- Vær oppmerksom på følgende eksempelberegning for mengden trietylamin som skal legges til:
- Overfør reaksjonen på slangeskinnsdialyserør (molekylvekt cut-off: 3,500 Da).
- Plasser dialyseslangen i et stort beger med 1 M NaCl i avionisert (DI) vann (volumet skal dekke slangen helt) i 3 dager under omrøring ved 300 o / min. Bytt 1 M NaCl-løsningen 2x daglig for totalt seks vasker.
- Dialyse i 6 timer i DI-vann. Bytt DI-vann hver time for totalt seks vasker.
- Overfør reaksjonen til et 50 ml konisk rør og frys ved -80 ° C.
- Lyofiliser tuben i minst 72 timer ved en starttemperatur på −70 °C og en temperaturøkning på 0,01 °C/min til 0 °C.
- Forbered prøven for 1H-NMR ved å oppløse 25 mg MethMAL i 700 μL kloroform-d og overføre til et NMR-rør.
- Skaff deg 1H-NMR-spektra.
MERK: Spektrene i denne protokollen ble anskaffet ved hjelp av et 500 MHz-spektrometer med følgende parametere: feiebredde = 6 467,3 Hz, tidsforsinkelse = 13,1 s, anskaffelsestid = 5,1 s, pulstid = 5,1 μs og antall skanninger = 8. - For analyse, integrer maleimidtoppen som referanse (~ 6,76 ppm) og integrer deretter de to metakrylamidtoppene (~ 5,35 ppm og 5,6 ppm). Del forholdet mellom toppområdene med metakrylamid med det totale arealet av alle tre toppene for å oppnå prosentandelen av armer modifisert med metakrylamid.
MERK: En akseptabel modifikasjon er 67% -75% metakrylamid funksjonell gruppesubstitusjon. Et eksempel på1 H-NMR-spektrum for MethMAL er vist i figur 1.- Bruk ligning (1) som graden av substitusjonsligning:
(1)
- Bruk ligning (1) som graden av substitusjonsligning:
(1)
Figur 1: Kjemisk struktur og 1H-NMR-spektrum av MethMAL. (A) Kjemisk struktur: MethMAL annealing macromer består av 20 kDa 4-arm poly (etylenglykol) modifisert med tre metakrylamidarmer. (B) Denne strukturen genererer topper ved 5,36 ppm (3) og 5,76 ppm (2) som ikke er tilstede i PEG-MAL-spektra, og en maleimidarm, som genererer en topp på 6,71 ppm (1). Løsningsmidlet, kloroform, genererte en topp på 7,26 ppm, og gjenværende vann i denne prøven genererte en topp på 2,2 ppm (merket på spektra). I MethMAL-spektrene hadde maleimidtoppen et integrert areal på 0,27, og summen av metakrylamidtoppene var 0,73 (0,37 + 0,36). Modifiseringen av metakrylamidprosenten var 73 % (0,73/(0,27 + 0,73)). Dette tallet er fra Pfaff et al.14. Opphavsrett (2021) American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Mikrogel forløper gelering kinetikk
MERK: Geleringstiden kan endres ved å justere pH i bufferen som brukes til å oppløse gelforløperkomponentene. For PEG-maleimidhydrogeler tilsvarer en surere pH vanligvis langsommere geleringstid siden tiolatkonsentrasjonen reduseres ved lavere pH15.
- Forutbestemme de ønskede konsentrasjonene av polymer, tverrbinding og andre gelforløperkomponenter (dvs. peptider, glykosaminoglykaner). Oppløs PEG-MAL, RGD og MethMAL (PEG-ryggrad) i 10x PBS (pH 1,5) og MMP-2 tverrbinding i 1x PBS (pH 7,4).
MERK: I denne protokollen er gelforløperoppløsningen en publisert formulering3, som består av 45,88 mg / ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml methmal og 4,62 mg / ml MMP-2 tverrbinding (enzymatisk nedbrytbar tverrbinding). - Forbered et viskosimeter, eller et tilsvarende instrument, for å overvåke lagrings- og tapsmoduli ved hjelp av en gapstørrelse på 0,4 mm, en skjærstamme på 1,0, en frekvens på 1,0 Hz og en varighet på 10 800 s.
- Fest en 35 mm platerotor (P35/Ti) geometri. Bruk et fuktet kammer eller en fuktig svamp rundt geometrien for å opprettholde et fuktet miljø.
- Bland PEG-ryggraden og MMP-tverrlinkeren i et volumetrisk forhold på 1: 1.
- Pipette 400 μL av gelforløperoppløsningen på midten av viskosimetertrinnet.
- Senk geometrien sakte ned på scenen til den når den forhåndsbestemte gapstørrelsen på 0,4 mm, og begynn umiddelbart å overvåke lagring (G') og tap (G'') moduli i opptil 6 timer ved romtemperatur.
MERK: Gelering anses å begynne når lagringsmodulen blir større enn tapsmodulen, og gelering anses som fullført når lagringsmodulen platåer. En representativ geleringskinetikkkurve er vist i figur 2.
Figur 2: Representativ kurve for geleringskinetikk for en MAP gelforløperløsning (pH 4,5) bestemt av et viskosimeter. Gelering begynner ved den raske økningen i lagringsmodulen (G'), og geleringen fullføres når G-kurven platåer. G'' indikerer tapsmodulen. Dette tallet er fra Pruett et al.3. Opphavsrett (2021) Wiley-VCH GmBH. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Mikrofluidisk enhetsfabrikasjon
MERK: Denne protokollen beskriver enhetsfabrikasjon av en mikrofluidisk trinnemulgeringsenhetsdesign tilpasset fra de Rutte et al.13, som kan ses i figur 3A. Imidlertid kan denne protokollen brukes med hvilken som helst enhetsdesign som er etset inn i en SU-8-wafer. Det anbefales å outsource SU-8 silisium wafer master fabrikasjon, med mindre de aktuelle renromsfasilitetene er tilgjengelige for fabrikasjon.
- Lag den første mikrofluidiske enheten av polydimetylsiloksan (PDMS) fra en SU-8 wafer-fotomaske.
- Forbered ~200 g PDMS ved å blande basen og herdemiddelet i et forhold på 10:1 w/w (se materialtabellen).
- Plasser SU-8-platen i en kulturskål (tape kantene på waferen til parabolen), med den mikrofluidiske designen vendt opp.
- Hell PDMS i skålen for å lage et 1-1,5 cm tykt lag over waferen. Plasser parabolen under vakuum for å fjerne eventuelle bobler.
- La PDMS herde til den er størknet (24 timer ved romtemperatur eller ~2 timer ved 60 °C).
- Når PDMS har herdet, bruk forsiktig et barberblad eller en skalpell for å kutte et rektangel gjennom PDMS, slik at det er en margin på 0,5-1 cm rundt designet på waferen.
MERK: Ikke bruk for mye trykk og vær veldig forsiktig for å unngå å skade (f.eks. sprekker, skrape) platen. - Kil en slikkepott inn i et av kuttene og skyv den langs kuttene for å skille PDMS fra waferen.
MERK: Når PDMS skiller seg fra waferen, vil en luftboble begynne å danne seg under PDMS (se figur 3B). - Bruk slikkepotten til å løfte rektangelet til PDMS forsiktig ut av parabolen.
MERK: Det resulterende gapet i PDMS over waferen vil være formen for mikrofluidiske enheter.
- Opprett påfølgende PDMS mikrofluidiske enheter fra SU-8 wafer fotomask.
- Forbered ~ 15-20 g PDMS per form ved å blande basen og herdemiddelet i et 10: 1-forhold.
- Hell PDMS i det rektangulære gapet i formen for å lage et 5 mm lag med PDMS over waferen. Sett formen under vakuum for å fjerne eventuelle bobler.
- La PDMS herde til den er helt størknet (24 timer ved romtemperatur eller 2 timer ved 60 °C).
- Når PDMS har herdet, bruk et barberblad eller en skalpell for å kutte PDMS rundt kantene på rektangelet.
MERK: Ikke bruk for mye trykk og vær veldig forsiktig for å unngå å skade (dvs. sprekke) platen. - Kil en slikkepott inn i et av kuttene og skyv den langs kuttene for å skille PDMS fra waferen.
MERK: Når PDMS skiller seg fra waferen, vil en luftboble begynne å danne seg under PDMS. - Bruk en 1,5 mm biopsistans for å lage hull gjennom PDMS-rektangelet ved de to innløpene og utløpet (se figur 3B).
- Hvis det er flere enheter på en enkelt wafer, bruk en slikkepott eller barberblad for å lett score PDMS mellom hver enhet, og brett deretter PDMS forsiktig langs de scorede linjene slik at PDMS skiller seg veldig rent på egen hånd.
- Oppbevar PDMS-enhetene i en støvfri beholder.
- Bind PDMS mikrofluidiske enheter til glassglass.
- Forbered ett glassglass lysbilde per PDMS mikrofluidisk enhet. Bruk tape, filtrert luft eller isopropylalkohol (IPA) vask for å fjerne støv fra lysbildet. Forsikre deg om at lysbildene er helt tørre før du går videre til neste trinn.
- Plasser et glassglass og en PDMS-enhet, designsiden opp, ved siden av hverandre på et lite plastbrett (et 96-brønns platelokk fungerer bra for dette) og legg det i en plasmarenser. Lukk døren og luftstrømsventilen og slå på vakuumpumpen. La den kjøre i minst 30 s, og slå den deretter av.
- Koble oksygentankens gassrør til luftstrømventilen. La plasmakammeret fylles med oksygen i 30 s, slå deretter av oksygenet og lukk luftstrømsventilen.
- Slå på vakuumpumpen og sett radiofrekvensnivået (RF) til høyt. Vent til kammeret får en fiolett-rosa farge (se figur 3B). La 30 s passere.
- Når timeren går av, slå av plasma og vakuum. Deretter åpner du sakte luftstrømsventilen for å frigjøre vakuumet. Fjern skuffen fra plasmarenseren.
- Vend PDMS-enheten forsiktig på glassglasset for å binde dem. Når binding skjer, må du observere den lille forskjellen i gjennomsiktigheten til PDMS.
MERK: For best resultat, oppbevar de limte enhetene ved 60 °C til umiddelbart før bruk.
- Overflatebehandling av PDMS mikrofluidiske enheter
- Forbered overflatebehandlingen ved å fortynne PFOCTS (triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan) i Novec-olje (1:50). Bruk 1 ml for 3-4 enheter. Overfør volumet til en 1 ml sprøyte og fest en 25 G kanyle.
MERK: Nålene som brukes i denne protokollen er skråstilte, så vær forsiktig når du håndterer skarpe gjenstander. Butte nåler kan også brukes om ønskelig. - Klipp et 10-12 cm stykke Tygon-rør per enhet som skal behandles.
- Klipp et stykke PEEK-rør, ~ 7 cm i lengde. Sett inn et par millimeter av PEEK-slangen i enden av Tygon-slangen, som vist i figur 4A, for å forhindre at nålen punkterer Tygon-rørinntakene.
- Ta enheten (e) ut av det oppvarmede kammeret og sett den ikke-PEEK-enden av Tygon-slangen inn i det vandige innløpshullet.
- Stikk kanylen på overflatebehandlingssprøyten inn i PEEK-slangen og dekk til utløpshullet i oljekammeret (se figur 3B).
- Injiser behandlingen sakte inn i enheten og sørg for at den fyller enheten uten bobler. Vent til de vandige kamrene fylles først, etterfulgt av de mindre kanalene, og deretter oljekammeret. Fjern Tygon-slangen fra enheten. Når enheten er fylt, la den hvile i 10 minutter ved romtemperatur.
- Fyll en 5 ml sprøyte kun med olje (ingen silan) og fest en 25 G kanyle.
- Aspirer overflatebehandlingen ut av enheten gjennom innløpene og utløpet. Sett Tygon-slangen inn i det vandige innløpet, sett sprøyten med olje inn i PEEK-slangen, og skyll hver enhet med olje. Aspirer oljen ut av enheten.
- Gjenta oljespylingen 2x mer. Fjern Tygon-slangen.
MERK: Enheten er klar til bruk.
- Forbered overflatebehandlingen ved å fortynne PFOCTS (triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan) i Novec-olje (1:50). Bruk 1 ml for 3-4 enheter. Overfør volumet til en 1 ml sprøyte og fest en 25 G kanyle.
Figur 3: Mikrofluidisk PDMS-enhet . (A) Datamaskinassistert design (AutoCAD) tegning av mikrofluidisk enhetsdesign. Mikrogeldråpedannelse forekommer i kanalene på hver side av oljekanalen, som sett i den forstørrede knausen. (B) Oversikt over produksjon av PDMS-enheter. Forkortelse: PDMS = polydimetylsiloksan. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Mikrofluidisk generering av mikrogeler
- Forutbestemme de ønskede konsentrasjonene av polymer, tverrbinding og andre gelforløperkomponenter (dvs. peptider, glykosaminoglykaner). Oppløs PEG-MAL, RGD og MethMAL (PEG-ryggrad) i 10x PBS (pH 1,5) og MMP-2 tverrbinding sammen med 5 μM biotin-maleimid i 1x PBS (pH 7,4).
MERK: I denne protokollen er gelforløperoppløsningen en publisert formulering3 bestående av 45,88 mg / ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml MethMAL og 4,62 mg / ml MMP-2 tverrbinding (enzymatisk nedbrytbar tverrbinding). Metodene som er skissert nedenfor vil gi ~ 3 ml mikrogeler. - Forbered 6 ml overflateaktivt middel ved å fortynne stamløsningen 5% FluoroSurfactant til minst 1% i Novec olje. Tilsett denne oppløsningen i en 10 ml sprøyte.
MERK: Fluorert overflateaktivt middel er ublandbart med vann, noe som gjør at det lett kan fjernes under gelovergangen til den vandige fasen under PBS-vaskene i rensetrinnet. - Klipp tre stykker Tygon-rør som er en passende lengde for sprøytepumpehøyden.
- Klipp to stykker PEEK-rør, ~ 1 tomme i lengde. Sett inn et par millimeter av PEEK-slangen i enden av to stykker Tygon-rør, som vist i figur 4A, for å forhindre at nålen punkterer Tygon-rørinntakene.
- Sett den ikke-PEEK-enden av Tygon-slangen inn i innløpene til mikrofluidiske enheter. Sett det gjenværende stykket av Tygon-slangen (uten PEEK-slanger på enden) inn i utløpet for mikrofluidiske enheter, som vist i figur 4C.
- Tilsett minst 3 ml olje i en 5 ml plastsprøyte og fest den til en 25 G kanyle. Stikk kanylen forsiktig inn i PEEK-slangen på et av Tygon-innløpene. Skyll slangen og enheten forsiktig med olje. Samle oljen fra utløpet i et konisk rør. Gjenta oljespylingen på det andre Tygon-innløpet.
- Still sprøytepumpene til ønsket strømningshastighet.
MERK: Denne protokollen bruker 3 ml / t for den vandige strømningshastigheten og 6 ml / t for oljestrømningshastigheten. Det kan være nødvendig å bruke to separate sprøytepumper. - Koble sprøyten som inneholder overflateaktivt middel til oljeinnløpet via en 25 G kanyle (se figur 4A) og dispenser forsiktig nok olje til å klargjøre slangen og oljekanalen til mikrofluidisk enhet.
- Når enheten og oljeinntakene er satt opp, tilsett 0,5 ml olje til en ny 5 ml sprøyte, som vil inneholde gelforløperen. Hensikten med denne lille mengden olje er å bidra til å skylle forløperløsningen gjennom den mikrofuiliindiske enheten mot slutten av løpet.
- I et konisk rør kombinerer du 1,5 ml PEG-ryggradsløsning og 1,5 ml tverrbindingsløsning. Vortex i 30 s og overfør raskt den kombinerte gelforløperoppløsningen til 5 ml sprøyten.
- Koble sprøyten med gelforløperoppløsningen til det vandige innløpet via en 25 G nål. Dispenser forsiktig nok oppløsning til å prime slangen og den vandige kanalen.
- Fest sprøytene på de respektive sprøytepumpene og trykk på strekk (se figur 4B). Sørg for at det strømmer væske gjennom både vandige og oljekanaler.
MERK: Det anbefales å bruke et mikroskop for å visualisere mikrogeldannelse i PDMS-enheten. - Se etter partikler av jevn størrelse fra kanalene (se figur 4D). Samle mikrogelene fra utløpet i et konisk rør.
Figur 4: Mikrofluidisk oppsett. (A) Avbildning av metoden for tilkobling av PEEK-slanger (øverst) og Tygon-slanger til en 25 G kanyle på en sprøyte (nederst). (B) Mikrofluidisk oppsett med sprøytepumper, slanger, enheter og mikroskop. (C) Bilde av oppsett av mikrofluidisk enhet, med to innløp (vandig og olje) og ett uttak. (D) Skjematisk av mikrofluidisk anordning og representativt brightfield-bilde av forventet mikrogeldannelse fra kanalene i en trinnemulgeringsanordning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Rensing og sterilisering av mikrogeler
- Når geleringen er fullført (bestemt som tid til lagringsmodulplatå i geleringskinetikkkarakterisering), bruk en pipette for å fjerne oljefasen forsiktig fra bunnen av røret (se figur 5). Deponer dette i en egnet avfallsbeholder for fluorholdig avfall.
MERK: Geleringstiden kan akselereres ved å tilsette en organisk løselig base til oppsamlingsrøret (f.eks. Trietylamin), men det er viktig å merke seg at tilsetningen av en sterk base kan hydrolysere eventuelle uomsatte maleimider. Hvis det er ønskelig å funksjonalisere mikrogeler gjennom overskytende maleimider etter gelering, hopp over tilsetningen av trietylamin. - Tilsett mer olje i mikrogeloppsamlingsrøret i forholdet 1: 1. Bland ved å snu oppsamlingsrøret forsiktig. Ikke vortex.
- La oppsamlingsrøret nøye seg i ~ 5 minutter for å la fasene skille seg. Se etter oljefasen nederst og den vandige fasen (mikrogelene) på toppen (se figur 5).
- Gjenta oljevaskene minst 2 ganger til.
- Tilsett mer olje i forholdet 1: 1 med gelen og tilsett 1x PBS i et 4: 1 PBS til gelforhold. Inverter for å blande flere ganger. For å skille lagene, sentrifuger røret ved ~ 2,000 x g for ~ 30 s. Se etter oljefasen i bunnen av røret, gel i midten og PBS på toppen (se figur 5).
- Fjern oljefasen med en pipette og kast den i en avfallsbeholder.
MERK: Ikke fjern PBS. Bruk et større konisk rør for å fortsette å vaske hvis det opprinnelige oppsamlingsrøret var 15 ml. - Gjenta olje og PBS vasker 2x mer. Se etter gelen for å gå over fra ugjennomsiktig til klar ved den endelige vasken, som vist i figur 5, som indikerer at overflateaktivt middel ble fjernet og gelen er i PBS-fasen.
- Fjern all olje. Ikke fjern PBS fra det koniske røret.
- I en kjemisk røykhette, bruk en glasspipette for å legge heksaner til røret med samme volum som PBS. Vortex det koniske røret i 30 s eller til det blandes grundig. Sentrifuge på 4,696 x g i 5 min.
- Etter separasjon, se etter heksaner i topplaget, PBS i midten og gel nederst (se figur 5). Fjern heksanlaget og kast det i en beholder for organisk avfall. Aspirer PBS.
- Gjenta heksan og PBS vasker minst 2x mer eller til gelen vises nesten gjennomsiktig (se figur 5). Vask gelen med PBS 1x mer slik at eventuelle gjenværende heksaner fjernes. Sentrifuge på 4,696 x g i 5 min. Aspirer PBS-laget. Pass på at du ikke forstyrrer gelpelleten.
- For å dekke eller slukke eventuelle uomsatte maleimider i mikrogelene, lag en 100 mM løsning av N-acetyl-L-cystein i 1x PBS og tilsett denne løsningen til gelen. Plasser på en rørrotator ved 37 °C over natten, etterfulgt av mange vasker med PBS for å fjerne uomsatt N-acetyl-L-cystein.
- For langtidsoppbevaring (opptil 1 år), resuspender mikrogelene i 70% IPA og oppbevar ved 4 ° C for å forhindre vekst av bakterier på mikrogelene.
- For å sterilisere mikrogelene, tilsett 70% IPA til gelen i et 4: 1 v / v-forhold i en biosikkerhetshette. Vortex røret i 30 s, deretter sentrifuge ved 4,696 × g i 5 min. Aspirer IPA-supernatanten fra gelpelleten i en biosikkerhetshette. Utfør 2x flere IPA-vasker etterfulgt av 3x vask med sterile 1x PBS.
MERK: All IPA bør fjernes før bruk av gelen med celler eller dyr.
Figur 5: Oversikt over prosedyren for mikrogelrensing. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; IPA = isopropylalkohol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Karakterisering av mikrogelstørrelse
MERK: Det anbefales å la mikrogelpartikler balansere i 1x PBS over natten ved 37 °C for å svulme til sin endelige diameter før dimensjonering.
- Bilde gel partikler.
- Spinn ned MAP-gelen på 4,696 × g i 5 minutter og aspirer supernatanten.
- Bruk en positiv forskyvningspipette, fjern 5 μL mikrogeler fra gelpelleten og fortynn i 1 ml PBS i et mikrosentrifugerør (1:200 fortynning). Juster denne fortynningen etter behov.
MERK: Under formuleringen av gelforløperoppløsningen kan 5 μM biotin-maleimid tilsettes og brukes som et alternativ til merking av mikrogeler med fluorofor. I dette tilfellet kan en streptavidin-fluorofor tilsettes ved en fortynning på 1:300 (fra 1 mg / ml lager). Tillat inkubering med streptavidin i minst 15 minutter før avbildning. - Ved hjelp av en positiv forskyvningspipette overfører du 100 μL av de fortynnede mikrogelene til brønnene i en klar 96-brønnsplate.
- Bruk et bredt felt eller konfokalt mikroskop for å visualisere mikrogelene med et 10x mål. Skaff bilder av mikrogelene for analyse.
- Se figur 6 for representative konfokale bilder av mikrogeler.
- Dimensjonere partikler med ImageJ
- Åpne bildefilene fra mikroskopet i ImageJ.
- Velg Analyser | Sett skala og sett bildeskalaen i henhold til mikroskopmålet.
- Velg bilde | Type | 8-biters.
- Velg bilde | Juster | Terskel og velg deretter alternativet "Otsu" automatisk terskel fra rullegardinmenyen.
- Klikk på Analyser | Sett målinger og velg Ferets diameter og grense til terskel.
- Klikk på Analyser | Analyser partikler og angi områdestørrelsesområdet (i piksel ^ 2) som forventes for mikrogelene (for å utelukke små rusk fra å bli analysert). Endre sirkularitet til 0,75-1,00 og velg Vis | Disposisjoner. Sjekk visningsresultater og ekskluder på kanter.
MERK: Sirkularitetsformfilteret ekskluderer mikrogeler på bildekanten som kan gi en unøyaktig diametermåling. - Kjør modulen Analyser partikler .
- Vent på utdataene, som er Ferets diameter på hver partikkel, og eksporter disse resultatene til et regneark.
- I denne protokollen beregner du polydispersitetsindeksen (PDI) for å bestemme heterogeniteten i mikrogelstørrelse. Analyser minst 100 mikrogeler for å definere en populasjon: et PDI-område på 1,00-1,05 definerer en monodisperse befolkning, og en PDI større enn 1,05 definerer en polydisperse befolkning. Bruk ligning (2), ligning (3) og ligning (4) for å beregne PDI, som beskrevet nedenfor.
(2)
(3)
(4)
(2)
(3)
(4)
Figur 6: Representative bilder av mikrogeler. (A) Fluorescerende konfokalt bilde av mikrogelpopulasjon A, (B) bilde av terskelmikrogeler og (C) partikkelkonturer etter ImageJ-analyse. (D) Fluorescerende konfokalt bilde av mikrogelpopulasjon B og (E) overført lysbilde av mikrogeler (mikrogeler er nesten gjennomsiktige). (F) Skildring av representative resultater fra ImageJ-analysen som er skissert i denne protokollen. Begge mikrogelpopulasjonene har relativt monodisperse PDIer. Begge populasjonene av mikrogeler ble syntetisert med en 3 ml / t vandig strømningshastighet og en 6 ml / t oljestrømningshastighet. Forskjellen i mikrogelstørrelse skyldes imidlertid forskjeller i trinnstørrelse for mikrofluidiske enheter. For eksempel ble mikrogelpopulasjon A syntetisert med en mikrofluidisk enhet med en kanaltrinnstørrelse på 11 μm, og mikrogelpopulasjon B ble syntetisert i en enhet med en trinnstørrelse på 40 μm. Skala barer = 100 μm. Forkortelse: PDI = polydispersitetsindeks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. Mikroporøs glødet partikkel (MAP) stillas annealing
- Lag en lagerløsning av 2 mM litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfin (LAP) i 1x PBS (pH 7,4).
- Fortynn LAP-stamløsningen til 0,2 mM i et volum på 1x PBS tilsvarende gelvolumet. Hvis du bruker LAP fotoinitiator for cellestudier eller dyreforsøk, må du sterilisere løsningen før bruk.
- Spinn ned MAP-gelen på 4,696 × g i 5 minutter og aspirer supernatanten.
- Bruk en positiv forskyvningspipette til å overføre ønsket volum gel til et mikrosentrifugerør.
- Tilsett 0,2 mM LAP til gelen i et volumetrisk forhold på 1:1 (endelig LAP-konsentrasjon er 0,1 mM).
- Vortex blandingen og inkuber i minst 15 minutter i mørket.
- Sentrifuge blandingen ved 18.000 × g i 5 minutter for å pelletere gelen.
- Fjern supernatanten forsiktig fra gelpelleten.
- Overfør MAP-gelen til målplasseringen med en pipette med positiv forskyvning.
- Påfør fokusert lys (365 nm, 8,66 mW/cm2) på prøven i 113 s for å annealere stillaset.
MERK: Glødetiden på 113 s er optimalisert som tidligere publisert for LAP-konsentrasjon på 0,1 mM14, men ytterligere optimalisering for forskjellige fotoinitiatorkonsentrasjoner kan være nødvendig.
Figur 7: MAP stillas annealing . (A) Skjematisk av MAP stillasglødning. Når de utsettes for en fotoinitiator og lys, gjennomgår de metakrylamidfunksjonelle gruppene på MethMAL-makromeren en klikkfotopolymeriseringsreaksjon, som binder overflatene til mikrogelene sammen. (B) Avbildning av en 3D-gjengivelse (Imaris) av et to-foton mikroskopbilde av MAP mikrogeler (grønn) glødet sammen i en 3D puck form, med dextran (rød) i porene. (C) Avbildning av en 3D-gjengivelse (Imaris) av et tofotonmikroskopbilde som viser porøsiteten til et MAP-stillas som har blitt perfundert med fluorescerende 70 kDa dextran (rød). Skala barer = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Forkortelser: MAP = mikroporøs glødet partikkel; MethMAL = tilpasset annealing macromer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Målet med denne protokollen er å skissere alle trinnene som er nødvendige for å syntetisere mikrogelbyggesteiner som skal brukes i et MAP-stillas. MethMAL-glødemakromeren er svært selektiv og effektiv og er kompatibel med flere polymerryggrader14. Det er viktig at minst 67%-75% av 20 kDa PEG-maleimide modifiseres med metakrylamidfunksjonelle grupper for å sikre høy glødeeffektivitet. Prosentmodifisering kan lettest bestemmes ved å analysere 1 H-NMR spektratopper, som vist i figur 1. Geleringskinetikken, bestemt av et viskosimeter, er en viktig beregning å vurdere for hver gelformulering. Denne protokollen bruker en gelforløperløsning som består av en PEG-ryggrad med en MAL-gruppe, som effektivt reagerer med tiolfunksjonaliserte tverrbindinger for mikrogelgelgelering. Imidlertid kan mange hydrogelkjemier brukes til å fremstille mikrogeler via den mikrofluidiske metoden med høy gjennomstrømning som er beskrevet her. Tiden til oppstart av gelering vil gi innsikt i varigheten av mikrofluidisk mikrogelgenerering. Det anbefales å velge en pH for gelforløper som kan initiere gelering mellom 30 minutter (figur 2) og 2 timer.
Hvis geleringstiden er for rask, vil gelforløperløsningen begynne å polymerisere i den mikrofluidiske enheten og tette kanalene. I tillegg er det viktig å merke seg at endring av tiolerte ligandkonsentrasjoner (f.eks. RGD) kan ha innvirkning på nettverksdannelse under gelering og kanskje må redegjøres for ved å justere formuleringen. De mikrofluidiske enhetsfabrikasjonstrinnene kan være kjedelige, men representative resultater av en vellykket bundet enhet er vist i figur 3. Denne protokollen bruker en høy gjennomstrømning, parallellisert, trinnemulgering mikrofluidisk enhet som ble tilpasset fra et design av de Rutte et al.13, og silisiumskivefabrikasjonen ble outsourcet til et mikrofluidisk teknologiselskap. Trinnene som er skissert i denne protokollen kan imidlertid brukes med hvilken som helst enhetsdesign etset på en SU-8 silisiumskive fotomaske. Det er viktig å merke seg at trinnstørrelsen på kanalene på fotomasken må optimaliseres under enhetsfabrikasjon, siden det vil påvirke størrelsen på mikrogelpartiklene.
Strømningshastighetene for mikrofluidisk generering av mikrogeler bør optimaliseres for hver gelformulering basert på faktorer som geleringstid, ønsket partikkelstørrelse og mikrofluidisk enhetsdesign. Hvis du bruker enheten med høy gjennomstrømning, kan strømningshastighetene for den vandige fasen gå så høyt som 5 ml / t. Figur 4B viser oppsettet for enheter med høy gjennomstrømning som brukes i denne protokollen. Hvis enheten kjører riktig, bør mikrogelformasjonen se ut som vist i figur 4D. Før rensing vil mikrogelene være ugjennomsiktige. Etter å ha fullført de forskjellige olje-, PBS- og heksanvaskene, skal gelen se klar ut som det representative bildet i figur 5. Hvis du inkorporerer en fluorofor i mikrogelene, kan det rensede produktet ha en svak farget fargetone, men bør fortsatt være nær gjennomsiktig. Etter rensing og hevelse skal mikrogelene være svært ensartede i størrelse og ha en PDI mellom 1,00 og 1,05, som vist i figur 6. Ulike fotoinitiatorer kan brukes til fotoannealing MAP stillaser. Hvis man bruker et alternativ til LAP, beskrevet her, må man bestemme glødeketikken som tidligere beskrevet14. I tillegg kan ulike lyskilder brukes til fotoannealing, så lenge lyskilden tilsvarer fotoinitiatoren. Man må være sikker på å kalibrere og fokusere lyskilden. Glødetiden og lysintensiteten må kanskje optimaliseres basert på gelformulering og fotoinitiatorkonsentrasjon. Annealingsmetoden beskrevet i denne protokollen kan brukes i in vitro- og in vivo-studier. Etter glødning vil mikrogelene danne et porøst stillas som kan visualiseres med tofotonmikroskopi (figur 7B-C).
Discussion
Denne protokollen beskriver metoder for å syntetisere og karakterisere mikrogeler, som fungerer som byggesteiner for mikroporøse glødede partikler (MAP) stillaser. Denne protokollen bruker en mikrofluidisk tilnærming med høy gjennomstrømning for å generere store mengder ensartede mikrogeler, som ikke kan oppnås med andre metoder som strømningsfokuserende mikrofluidikk 1,4,7,9 (høy monodisperisty, lavt utbytte), batchemulsjon6,10 og elektrosprøyting 5,12 (lav monodispersitet, høyt utbytte). Med metodene som er beskrevet her, kan monodisperse mikrogeler lages for bruk i MAP-stillaser som kan brukes til en rekke regenerative medisinapplikasjoner (f.eks. Cellelevering, sårheling).
Et kritisk trinn i denne protokollen er opprettelsen av PDMS mikrofluidiske enheter. Hvis enhetene ikke er laget riktig, kan dette ha negative nedstrømseffekter på mikrogeldannelse og monodispersitet. Det er viktig å forhindre innføring av artefakter (dvs. bobler, støv) i PDMS før det herdes, da dette kan tette kanalene og påvirke mikrogeldannelsen betydelig. For å redusere dette så mye som mulig, bør man bruke tape for å fjerne støv, lagre enhetene i en støvfri beholder og jobbe i en støvfri hette, om mulig. Det anbefales også å oppbevare apparatene ved 60 °C for best resultat med overflatebehandlingen.
Når du heller PDMS-enhetene, er det viktig å opprettholde en jevn tykkelse som er omtrent lik eller mindre enn lengden på biopsistansen. Hvis enheten er for tykk, vil biopsistansen ikke kunne trenge helt gjennom. Det er også viktig å ikke rive PDMS-enhetens innløp / utløp mens du slår med biopsistansen og / eller setter inn slangen. En rift i PDMS-apparatet vil føre til lekkasje fra innløpene/utløpet, noe som kan føre til tap av gelforløperløsningen. Hvis det lekker i en PDMS-enhet, er den beste løsningen å erstatte den med en ny enhet så raskt som mulig.
Ved plasmabehandling av enheten har bruk av rent oksygen og plasmabehandling i 30 s gitt de beste resultatene for å feste PDMS til glassglasset. Hvis enheten ikke binder seg riktig (dvs. PDMS kan fortsatt løftes fra glassglasset etter plasmabehandling), bør man dobbeltsjekke at plasmabehandleren fungerer som den skal, og at enheten og lysbildene er rengjort grundig. Det er også viktig å bruke riktig silanoverflatebehandling, og for best resultat bør PDMS-enhetene overflatebehandles direkte før bruk. Andre metoder for overflatebehandling, for eksempel kjemisk dampavsetning, kan også brukes.
Et annet viktig skritt er å bruke PDMS mikrofluidiske enheter riktig for mikrogeldannelse. Det anbefales å bruke et strømningshastighetsforhold på minst 2: 1 (denne protokollen bruker en 6 ml / t oljestrømningshastighet og en 3 ml / h vandig strømningshastighet), men dette kan justeres for å oppnå ønsket mikrogelstørrelse. PH i mikrogelforløperløsningen er også en viktig beregning for å optimalisere for å forhindre tilstopping av enheten. Fosfatbufret saltvann (PBS) akseler tiolatdannelsen i Michael-type addisjonskjemi, og PBS-konsentrasjonene som brukes i denne protokollen gir de beste resultatene for mikrogelgelering i mikrofluidiske enheter. Når sprøytepumpene er startet, kan det være noen bobler i mikrofluidiske kanaler, men dette bør likevektes etter noen minutter. Det anbefales å overvåke mikrogeldannelse med et mikroskop. Hvis strømmen ikke ser lik ut som i denne videoen og/eller det er noen få kanaler som produserer store partikler, skyldes dette sannsynligvis problemer med overflatebehandlingstrinnet. Den beste løsningen er å erstatte enheten med en som er nylig overflatebehandlet.
Hvis mikrogelene ser ut til å samle seg, kan dette skyldes utilstrekkelig konsentrasjon av fluorosurfaktant. Den anbefalte løsningen er å øke vektprosenten av overflateaktivt middel i oljefasen. En begrensning ved bruk av høye konsentrasjoner av overflateaktivt middel er imidlertid at det kan være vanskeligere å fjerne under rensetrinnet. Det anbefales å bruke mikrofluidiske enheter bare en gang, men enhetene kan gjenbrukes hvis de skylles med Novec-olje umiddelbart etter bruk for å fjerne vandig løsning som kan gele i enheten og tette kanalene. Mens en mikrofluidisk enhet kan produsere et høyt gjennomstrømningsvolum av mikrogeler (ml / t), kan denne produksjonshastigheten skaleres ved å bruke flere mikrofluidiske enheter parallelt.
Annealingstrinnet til MAP stillasmontering er avhengig av bruk av en lysaktivert fotoinitiator av radikal polymerisasjon, og fotoinitiatoren kan velges basert på ønsket applikasjon. For eksempel har LAP fotoinitiator raske glødetider (<30 s) ved bruk av langbølget UV-lys, noe som har minimal innvirkning på cellens levedyktighet in vitro14. Imidlertid absorberes denne bølgelengden sterkt av vev16 og har kanskje ikke så høy glødeeffekt in vivo som in vitro.
Eosin Y er en annen fotoinitiator aktivert av synlige bølgelengder (505 nm) og har dypere penetrasjon i vev, noe som forbedrer MAP-stillasets evne til å bli glødet under vev. Imidlertid kan de lange lyseksponeringstidene som trengs for Eosin Y-glødning, forlenge celleeksponeringen for frie radikaler og påvirke cellens levedyktighet in vitro14. Bruk av disse metodene for høy gjennomstrømningsgenerering av svært ensartede mikrogelbyggeklosser vil akselerere MAP stillasfokusert forskning og fremme kunnskap innen injiserbare porøse materialer for regenerativ medisin.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Joe de Rutte og Di Carlo Lab ved University of California, Los Angeles, for deres hjelp med den opprinnelige mikrofluidiske enhetsdesignen som den rapporterte enheten ble utviklet fra, samt deres tidlige veiledning i PDMS-enhetsfabrikasjon og feilsøking. Figurskjemaer ble opprettet med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148 (2020).
- de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
- Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).
