Summary
Questo protocollo descrive l'impianto consecutivo di una pompa osmotica per indurre l'aneurisma dell'aorta addominale mediante rilascio di angiotensina II in topi carenti di apolipoproteina E (ApoE) e di una porta di accesso vascolare con catetere della vena giugulare per il trattamento farmacologico ripetuto. Il monitoraggio dello sviluppo dell'aneurisma mediante ecografia 3D viene condotto efficacemente nonostante gli impianti dorsali.
Abstract
Poiché mancano opzioni di trattamento farmaceutico nella gestione clinica dell'aneurisma dell'aorta addominale (AAA), i modelli animali, in particolare i modelli murini, vengono applicati per far progredire la comprensione della patogenesi della malattia e per identificare potenziali bersagli terapeutici. Testare nuovi farmaci candidati per bloccare la crescita di AAA in questi modelli richiede generalmente la somministrazione ripetuta di farmaci durante il corso dell'esperimento. Qui, descriviamo un protocollo compilato per l'induzione AAA, l'inserimento di un catetere endovenoso per facilitare la terapia prolungata e il monitoraggio seriale AAA mediante ultrasuoni 3D. Gli aneurismi sono indotti nei topi carenti di apolipoproteina E (ApoE) dal rilascio di angiotensina II nell'arco di 28 giorni da minipompe osmotiche impiantate per via sottocutanea nella schiena del topo. Successivamente, viene condotta la procedura chirurgica per il cateterismo venoso giugulare esterno per consentire il trattamento farmacologico endovenoso quotidiano o il prelievo di sangue ripetuto tramite un pulsante di accesso vascolare sottocutaneo. Nonostante i due impianti dorsali, il monitoraggio dello sviluppo di AAA è prontamente facilitato dall'analisi ecografica 3D semi-automatizzata sequenziale, che fornisce informazioni complete sull'espansione del diametro e del volume aortico e sulla morfologia dell'aneurisma, come illustrato da esempi sperimentali.
Introduction
Un aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è una dilatazione patologica di un vaso a causa di processi infiammatori e distruttivi dei tessuti nella parete aortica che possono portare alla rottura e alla morte del paziente. Nonostante i notevoli risultati nella riparazione chirurgica dell'AAA, ad oggi manca un trattamento farmacologico conservativo per bloccare la progressione dell'espansione dell'aneurisma e potenzialmente ridurre il rischio di rottura. Sono stati sviluppati modelli animali per chiarire i fattori scatenanti e i mediatori della malattia e per testare nuovi approcci alla terapia. I modelli murini di AAA sono ampiamente applicati e coprono le diverse osservazioni dal tessuto umano. A causa delle loro differenze pathomemeccanicistiche, spesso viene applicato più di un modello per indagare la particolare funzione di molecole/vie o l'efficacia di potenziali farmaci terapeutici 1,2. Tra i modelli più comunemente usati di induzione AAA c'è la somministrazione di angiotensina-II (Ang-II) in topi con deficit di apolipoproteina E (ApoE KO)3, che ha più patogenesi cronica rispetto ai modelli che si basano sulla formazione di aneurisma da un insulto acuto alla parete aortica 4,5. Pertanto, il modello Ang-II sembra particolarmente adatto per monitorare la progressione della malattia e recentemente è stato dimostrato che assomiglia molto alla malattia umana AAA per quanto riguarda le risposte metaboliche e infiammatorie6. In particolare, il modello Ang-II presenta non solo lo sviluppo di AAA, ma anche la formazione di aneurisma toracico, nonché la dissezione aortica con formazione di trombo intramurale.
I trattamenti volti a mirare alla progressione dell'AAA già stabilita piuttosto che prevenire l'inizio della malattia possono avere un valore traslazionale più elevato in quanto i pazienti presentano una condizione preesistente che richiede il trattamento 7,8. Per un disegno sperimentale comparabile, la dimensione aortica deve essere monitorata prima e dopo l'induzione di AAA per definire una soglia di sviluppo della malattia e potenzialmente stratificare i topi in gruppi di trattamento.
La modalità di somministrazione del farmaco dipende dall'assorbimento e dalla stabilità della rispettiva sostanza. Le iniezioni intraperitoneali (i.p.) sono più spesso utilizzate a causa della loro facilità di applicazione, non richiede anestetico e della mancanza di vincoli di volume di iniezione9. La farmacocinetica deve essere considerata, tuttavia, quando si sceglie la via di somministrazione, poiché le sostanze somministrate per via endovenosa vengono assorbite principalmente attraverso la circolazione portale epatica e possono subire un metabolismo epatico prima di raggiungere la circolazione, il che potrebbe comportare concentrazioni plasmatiche variabili a seconda dell'effetto di primo passaggio10. L'iniezione endovenosa (e.v.) produce la massima biodisponibilità delle sostanze e la sfida dell'accesso ripetitivo per via endovenosa può essere aggirata mediante l'uso di cateteri e porte di accesso vascolare per la somministrazione quotidiana11,12,13. Per quanto riguarda l'impostazione AAA, la distribuzione del farmaco in circolazione facilita l'esposizione diretta all'aneurisma a concentrazioni definite.
Qui, descriviamo un flusso di lavoro per indurre AAA nel modello murino Ang-II tramite l'impianto sottocutaneo di una pompa osmotica, per il trattamento farmacologico quotidiano e.v. tramite una porta di accesso vascolare collegata a un catetere inserito nella vena giugulare esterna, nonché per il monitoraggio delle dimensioni dell'aneurisma tramite ecografia 3D14 nonostante la presenza di due impianti dorsali.
Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico locale e dal Ministero della Scienza austriaco (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), conformi alla direttiva europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e all'Austrian Animal Experiment Act 2012. Gli endpoint umani sono stati fissati come segue: perdita del ≥15% del peso corporeo, evitare l'assunzione di cibo e / o acqua, ridotta attività (ipocinesia) o discinesia, o agitazione prolungata, graffi, respiro affannoso o postura curva nonostante la gestione del dolore / dei sintomi. Se necessario, un animale viene sottoposto a eutanasia in anestesia profonda, cioè un cocktail di sovradosaggio di ketamina (circa 100 mg/kg) e xilazina (circa 5 mg/kg), o per lussazione cervicale. Per le procedure chirurgiche, la tecnica asettica e i guanti sterili / puliti vengono utilizzati ovunque.
1. Impianto della pompa
- Anestesia
- Mantenere topi carenti di ApoE (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) su una dieta normale e preferibilmente includere animali maschi di 12-14 settimane negli esperimenti per rappresentare la predominanza maschile nella malattia umana3.
- 1 giorno prima dell'intervento (d-1, pre-OP), preparare e riempire le pompe osmotiche con la concentrazione desiderata di angiotensina II in base al peso del topo seguendo il protocollo del produttore e incubare le pompe in soluzione salina a 37 °C durante la notte15.
Esempio: Per un topo da 25 g, utilizzando pompe osmotiche (vedi Tabella dei materiali) con una velocità di erogazione di 1000 ng/kg/min e una velocità di pompaggio di 0,25 μL/h per 28 giorni, sciogliere 1,8 mg di Ang-II in 300 μL di soluzione salina (concentrazione di 6000 ng/μL per erogare 1500 ng/h di Ang-II). Caricare la soluzione con l'ago di riempimento smussato nella pompa e quindi inserire il moderatore di flusso per chiudere la pompa. - Posizionare il topo nella camera di anestesia al 3%-4% di isoflurano miscelato con 2 L/min O2 fino a quando non è cosciente. Spostare il mouse su un tavolo riscaldato (37 °C) in posizione prona e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1,8%-2% attraverso un cono nasale.
- Applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
- Iniettare nel topo buprenorfina al 2,5% in soluzione salina a 10 μL/g di topo per via sottocutanea e verificare la profondità dell'anestesia con un pizzico del dito del piede.
- Radere una piccola area sul lato superiore sinistro del mouse sulla scapola. Applicare una soluzione di povidone-iodio al 10% (p/v) per la disinfezione dell'area rasata.
- Inserimento della pompa (5-7 min, eseguito senza microscopio)
- Controllare che il topo sia completamente anestetizzato dal pizzicamento della punta e fare un'incisione trasversale di 1 cm nella pelle della parte superiore della schiena con un bisturi tra la linea scapolare media e sinistra.
- Tenere la pelle con una pinza e usare forbici smussate e curve per creare una tasca sottocutanea spingendo verso l'arto posteriore sinistro. Apri le forbici, estrai le forbici aperte dal taglio e ripeti per allargare la tasca.
- Inserire delicatamente la pompa nella tasca con il moderatore di flusso verso la coda (per ridurre al minimo la potenziale interferenza del rilascio di Ang-II dal sito di incisione).
NOTA: La tasca non solo deve essere abbastanza larga per l'inserimento della pompa, ma anche per la pelle non stretta attorno alla pompa, e ci devono essere almeno 5 mm tra la pompa e il sito di incisione per consentire una guarigione ottimale della ferita. - Chiudere la ferita con suture interrotte riassorbibili 4-0.
- Iniettare il topo con il 10% di glucosio in soluzione salina a 10 μL/g di topo per via sottocutanea.
- Applicare lo spray per ferite povidone-iodio sulla ferita chiusa e consentire al topo di riprendere conoscenza sotto una lampada riscaldante, quindi riportarlo nella gabbia con 7,5 mg di piritramide (per una gestione prolungata del dolore) e 20 ml di glucosio al 5% in 200 ml di acqua potabile per 3 giorni dopo l'operazione.
- Controlla i topi più volte al giorno per segni di dolore o angoscia.
NOTA: Poiché le rotture aortiche si verificano ad un tasso del 20% -40% e prevalentemente entro i primi 3-10 giorni dopo l'operazione, il rischio di dolore o angoscia prolungata deve essere ridotto al minimo con un frequente monitoraggio degli animali. Le principali indicazioni per la rottura imminente includono: separazione dal gruppo, postura curva, diminuzione della mobilità (nella misura della paralisi degli arti posteriori) e diminuzione o non reattività durante la manipolazione.
2. Cateterismo della vena giugulare
NOTA: Questa procedura chirurgica richiede un microscopio con ingrandimento 8x-10x.
- Utilizzando il sistema di accesso vascolare (vedere Tabella dei materiali), preparare il catetere tagliando il lato 3Fr alla lunghezza desiderata (~5-7 mm prima dell'ancoraggio in silicone) e spingendo il catetere sul connettore metallico da 22 G del sistema di accesso vascolare (VAS) con almeno 3 mm di sovrapposizione. Posizionare il cappuccio in alluminio sul pulsante per proteggere la porta.
- Preparare legature di seta 6-0 lunghe 1-1,5 cm.
- Posizionare il topo nella camera di anestesia al 3%-4% di isoflurano miscelato con 2 L/min O2 fino a quando non è cosciente.
- Spostare il mouse su un tavolo riscaldato (37 °C) in posizione supina e mantenere l'anestesia isoflurana all'1,8%-2% attraverso un cono nasale.
- Applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
- Iniettare nel topo buprenorfina al 2,5% in soluzione salina a 10 μL/g di topo per via sottocutanea.
- Rasare la pelliccia dal lato destro del collo sul lato ventrale e sul lato destro della parte superiore della schiena (il lato sinistro avrà la pompa osmotica impiantata).
- Applicare la soluzione di povidone-iodio per la disinfezione dell'area rasata.
- Controllare che il mouse sia completamente anestetizzato dal pizzico della punta.
- Preparazione della vena giugulare (5-10 min, eseguita al microscopio)
- Praticare un'incisione cutanea sopraclavicolare trasversale di 0,5 cm sul lato destro del collo sopra la clavicola destra.
- Utilizzare pinzette microchirurgiche smussate per separare il tessuto connettivo e il grasso, esponendo la vena giugulare esterna. Evitare di strappare piccoli vasi sanguigni nel grasso.
- Isolare almeno 5 mm della nave, vicino ai muscoli pettorali.
- Smussare il tessuto sotto la vena usando micro pinzette piegate e passare attraverso 2-3 delle legature 6-0.
NOTA: Se nell'area di interesse vengono identificati dei rami laterali, la legatura deve essere inserita per essere caudale al ramo laterale o il ramo laterale deve essere legato in modo permanente isolando e legando con una legatura 6-0. - Infilare le legature e aggiungere una goccia di soluzione salina al sito.
- Impianto di bottoni (5-7 min, eseguito senza microscopio)
- Capovolgere il mouse e posizionarlo in posizione prona; Verificare la profondità dell'anestesia con un pizzico del dito del piede e applicare la soluzione di povidone-iodio per disinfettare l'area rasata.
- Fai un'incisione sagittale di 1 cm sulla parte superiore della schiena con un bisturi tra le linee scapolari mediospinali e destre.
- Utilizzare forbici curve smussate per creare una tasca circolare solo leggermente più grande della dimensione del VAS attorno al sito di incisione mediante dissezione smussata.
- Usa le forbici curve smussate per scavare un tunnel cranico sopra la spalla destra verso l'incisione ventrale al collo aprendo leggermente le forbici, quindi estraendo le forbici aperte e ripetendo l'azione mentre viene spinta più dentro.
NOTA: il mouse può essere ruotato sul lato sinistro per questo passaggio. - Una volta che il tunnel ha raggiunto l'incisione ventrale, passare attraverso i morsetti chirurgici dall'incisione ventrale a quella dorsale.
- Attaccare l'estremità 3Fr del catetere al morsetto e tirare il catetere attraverso il tunnel in modo che sia fuori dall'incisione ventrale del collo e il VAS sia in posizione sull'incisione dorsale.
- Inserire il disco di feltro chirurgico del VAS per via sottocutanea all'incisione sul retro.
- Sblocca il catetere e sciacqua con soluzione salina o tampone fosfato senza calcio e magnesio (PBS-/-), controlla la pervietà usando l'estremità della forcella dello strumento di manipolazione per rimuovere il cappuccio protettivo in alluminio, quindi usa l'estremità magnetica per tenere premuto il pulsante e iniettare con una siringa da 1 mL attaccata all'iniettore corrispondente fino a quando il liquido fuoriesce dall'estremità 1Fr.
NOTA: il lavaggio del catetere può essere eseguito in alternativa nella fase 2.1. - Premere il pulsante caudalmente in tasca e chiudere la pelle sopra il disco di feltro del VAS, sotto la flangia del VAS, con almeno due suture interrotte 4-0 cranialmente.
NOTA: Assicurarsi che non ci sia tensione sulla pelle intorno al pulsante.
- Cateterismo venoso (7-10 min, eseguito al microscopio)
- Capovolgere il mouse in posizione supina, verificare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta e aggiungere una goccia di soluzione salina al sito di taglio.
- Legare la prima legatura attorno al catetere e alla vena giugulare con 2-3 nodi il più lontano possibile cranicamente per legare la vena e ancorare il catetere all'esterno. Spostare la seconda legatura il più vicino possibile ai muscoli pettorali.
- Accorciare il catetere alla lunghezza richiesta in modo che ~ 3-5 mm del catetere sia nella vena tagliando con micro-forbici ad angolo diagonale per creare un'estremità affilata.
- Forare un foro nella vena usando un ago da 27 G collegato a una siringa da 1 mL riempita di soluzione salina tirando la legatura cranica fissata e spingendo l'ago parallelamente alla vena.
NOTA: Se il sangue dal riflusso fuoriesce dalla vena, utilizzare un batuffolo di cotone per applicare pressione fino a quando l'emorragia si ferma. - Inserire il catetere nella vena allo stesso modo tirando la legatura cranica fissata e facendo scorrere il catetere nella vena usando le pinzette piegate. Spingere il catetere fino a quando non è allineato con la vena.
- Legare la seconda legatura sulla regione in cui il catetere viene inserito nella vena con 2-3 nodi e controllare che non vi siano perdite di sangue. Una terza legatura e parte del tessuto adiposo locale possono essere utilizzati per fissare ulteriormente il catetere.
- Tagliare l'estremità in eccesso di entrambe le legature con micro-forbici e aggiungere una goccia di soluzione salina.
- Chiudere la pelle con suture interrotte riassorbibili 4-0.
- Iniettare il topo con il 10% di glucosio in soluzione salina a 10 μL/g di topo per via sottocutanea.
- Iniettare nel mouse il volume desiderato di inibitore o PBS/soluzione salina utilizzando l'estremità della forcella dell'utensile di manipolazione per rimuovere il cappuccio protettivo in alluminio e quindi l'estremità magnetica per tenere premuto il pulsante e iniettare con una siringa da 1 mL collegata all'iniettore.
NOTA: Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria o d'aria nella siringa per iniezione premendo lo stantuffo fino a quando non fuoriesce una goccia di liquido prima dell'iniezione. Mantenere una pressione positiva sullo stantuffo mentre si scollega la siringa con l'iniettore dal VAS per evitare di tirare sangue nella punta del catetere e causare il blocco del catetere. - Applicare uno spray per ferite povidone-iodio sulla ferita chiusa e consentire al topo di riprendere conoscenza sotto una lampada riscaldante, quindi riportarlo nella gabbia con 7,5 mg di piritramide (per una gestione prolungata del dolore) e 20 ml di glucosio al 5% in 200 ml di acqua potabile per 3 giorni dopo l'operazione.
- Controlla i topi più volte al giorno per segni di dolore o angoscia.
- Iniezioni giornaliere (<5 min)
- Per l'iniezione giornaliera, posizionare il topo nella camera di anestesia al 3%-4% di isoflurano miscelato con 2 L/min O 2 fino a quando non è incosciente e la sua frequenza respiratoria è rallentata, quindi iniettare come al punto 2.12.10. Controllare il collo per segni di gonfiore post-iniezione, che indicherebbe che il catetere non è più inserito nella vena. Inoltre, si noti che l'iniezione non sarà possibile se il catetere è occluso.
NOTA: Un'iniezione di 10 μL/g di peso del topo 1x al giorno è ben tollerata dai topi.
- Per l'iniezione giornaliera, posizionare il topo nella camera di anestesia al 3%-4% di isoflurano miscelato con 2 L/min O 2 fino a quando non è incosciente e la sua frequenza respiratoria è rallentata, quindi iniettare come al punto 2.12.10. Controllare il collo per segni di gonfiore post-iniezione, che indicherebbe che il catetere non è più inserito nella vena. Inoltre, si noti che l'iniezione non sarà possibile se il catetere è occluso.
3.3D ecografia
- Preparare il sistema di imaging a ultrasuoni, il tavolo riscaldante e lo scalda gel, collegare il trasduttore al sistema e posizionarlo sopra il palco in posizione trasversale (cioè perpendicolare alla colonna vertebrale del topo).
- Utilizzando il software a ultrasuoni, regolare le impostazioni per ottenere un guadagno di 30 dB, una profondità dell'immagine di 9,0 mm e una larghezza dell'immagine di 8,08 mm.
- Posizionare il topo nella camera di anestesia al 3%-4% di isoflurano miscelato con 2 L/min O2 fino a quando non è cosciente. Spostare il mouse su un tavolo riscaldato (37 °C) in posizione supina e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1,8%-2% attraverso un cono nasale.
- Applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
- Rasare la pelliccia sull'addome del topo. Applicare la crema depilatoria per 1 minuto se necessario, quindi pulire e pulire con una garza umida.
- Aggiungere una goccia di gel elettrodo a ciascuno dei quattro elettrocardiogrammi (ECG) sul palco e fissare le estremità del mouse su di essi.
- Stendere gel caldo per ultrasuoni sull'addome del topo e abbassare il trasmettitore per metterlo in contatto con l'animale.
- Identificare l'aorta come un vaso pulsante veloce circolare.
NOTA: La vena cava inferiore (IVC) si troverà vicino all'aorta e, se la sonda viene premuta saldamente, l'IVC verrà compresso mentre l'aorta rimane stabile. La conferma che il vaso analizzato è l'aorta piuttosto che l'IVC può essere ottenuta utilizzando il Doppler ad onda di impulso (PW-mode), con un angolo di 65°. L'aorta avrà un'alta velocità d'onda dell'impulso. - Localizzare l'arteria renale sinistra e sorvegliare manualmente l'area fino a 12 mm cranialmente per assicurarsi che non vi siano interferenze nell'area di interesse (cioè aorta surrenale). Tornare all'arteria renale sinistra, quindi impostare la sonda a 6 mm cranialmente dall'arteria renale sinistra.
NOTA: L'ecografia 3D registrerà la lunghezza specificata (cioè 12 mm) a partire da metà strada (6 mm) caudalmente dal punto di origine e fino alla lunghezza specificata (12 mm) cranialmente. I passaggi per la risoluzione dei problemi di interferenza includono la pressione leggermente verso il basso con il trasduttore, il sollevamento e l'abbassamento del trasduttore, l'applicazione di più gel per ultrasuoni e l'inclinazione dell'angolo del palco. - Acquisizione ecografica 3D
- Impostare il gating respiratorio al 25% di ritardo e una finestra del 50% e il trigger ECG (T1) a 50 ms (per registrare la dilatazione sistolica di picco dell'aorta).
NOTA: il gating respiratorio può essere ottimizzato per ogni animale in base alla frequenza respiratoria e allo sforzo per garantire che gli artefatti di movimento vengano rimossi. - Dalle opzioni 3D, impostare la distanza di scansione su 11,96 mm con una dimensione del passo di 0,076 mm, che si traduce in 157 fotogrammi.
- Il programma acquisirà automaticamente i 157 fotogrammi in circa 1-2 minuti. Scorri per verificare la qualità dell'immagine, ripeti se scadente, quindi salva l'immagine.
- Impostare il gating respiratorio al 25% di ritardo e una finestra del 50% e il trigger ECG (T1) a 50 ms (per registrare la dilatazione sistolica di picco dell'aorta).
- Acquisizione diametro 2D
- Spegnere il gating respiratorio e il grilletto ECG e individuare manualmente l'area con il diametro maggiore nel tratto di 12 mm dell'aorta surrenale.
- Acquisire un'immagine B-mode16.
- Inoltre, senza spostare il trasduttore, acquisire un'immagine di visualizzazione kilohertz (EKV) ECG-gated con le impostazioni standard del sistema nello stesso sito.
- Terminare la scansione
- Pulire il gel ad ultrasuoni dall'addome e riportare il mouse nella sua gabbia. Monitorare il mouse fino a quando non si ripristina completamente.
4. Analisi ecografica
- Analisi dei volumi
- Nel software di analisi, apri l'immagine in modalità 3D e, nel menu Elaborazione immagini , premi su Carica in 3D, che compilerà i 157 fotogrammi 2D in un'immagine 3D (cioè cubo).
- Nel menu Misurazione volume , scegliere Metodi paralleli e rotazionali, quindi il software visualizzerà l'immagine 3D in un unico riquadro.
- In Volume premere Start e disegnare il primo contorno attorno alla parete interna dell'aorta facendo clic per aggiungere il primo punto, spostando il cursore attorno all'aorta e quindi facendo clic con il pulsante destro del mouse per completare il contorno.
- Salta 9-10 fotogrammi (0,75-1 mm), quindi disegna un altro contorno nello stesso modo. Ripetete questi passaggi fino a raggiungere l'ultimo fotogramma. Ciò dovrebbe comportare 16-17 contorni.
NOTA: il primo e l'ultimo fotogramma devono avere contorni disegnati per poter calcolare il volume corretto oltre 12 mm. - Selezionate il primo contorno dal menu e scegliete Perfeziona. Questo avvierà l'algoritmo di rilevamento dei bordi per adattare da vicino la linea alla parete del serbatoio. Sposta i punti sul contorno trascinandoli in una nuova posizione in modo che il contorno allinei accuratamente il bordo della parete interna dell'aorta.
NOTA: Nel modello Ang-II, potrebbe essere presente un trombo intramurale. Poiché questa è una caratteristica comune di questo modello, la misurazione del volume dovrebbe includere il trombo. - Perfezionate tutti i contorni e premete Fine per salvare l'analisi. Il volume calcolato verrà visualizzato nell'angolo in basso a sinistra.
- Analisi del diametro
NOTA: le misurazioni del diametro possono essere condotte da parete interna a interna, parete da esterno a parete esterna o parete da interno a esterno, ma devono essere coerenti per tutte le misurazioni. Tuttavia, nel modello Ang-II, potrebbe essere presente un trombo intramurale, che dovrebbe essere incluso nell'analisi.- Dall'immagine in modalità 3D: valuta i 157 fotogrammi per identificare il diametro massimo mediante ispezione visiva. Quindi, dal menu Misura , scegliere Lineare e disegnare più linee attraverso l'aorta per determinare il diametro maggiore.
- Dall'immagine B-mode o EKV (ECG-gated kilohertz visualization): Nel cine loop, identificare la massima espansione dell'aorta (a sistole) mediante ispezione visiva. Quindi, dal menu Misura , scegliere Lineare e disegnare più linee attraverso l'aorta per determinare il diametro maggiore.
NOTA: L'ECG può essere utilizzato per determinare il ciclo cardiaco, ma l'identificazione visiva produce risultati accurati.
Representative Results
I risultati rappresentativi mostrano lo sviluppo e la progressione degli aneurismi surrenali monitorati mediante ultrasuoni al basale, giorno 8 e giorno 27 (Figura 1A). Una colorazione tricroma (Figura 1B) dell'aorta del giorno 27 nella Figura 1A illustra ulteriormente la morfologia dell'aneurisma formato con dissezione della parete e trombo intramurale. Il volume aortico (mm3) è stato determinato su un tratto di 12 mm14 e il diametro aortico massimo è stato ulteriormente misurato dalle immagini EKV. È stata fissata una soglia di crescita del volume del 125% dal basale al giorno 8 per definire lo sviluppo iniziale dell'aneurisma. Sulla base dei dati raccolti nell'arco di 2 anni (2020-2021, n = 157), solo il 9% degli animali non è riuscito a formare un AAA secondo questo limite. Tuttavia, il 35% dei topi ha subito rotture aortiche (toraciche o addominali) prima dell'impianto del catetere il giorno 9, risultando così in un totale del 56% degli animali rimanenti con malattia AAA accertata suscettibile di stratificazione in gruppi di trattamento (Figura 1C). Da notare che, tra i nostri controlli PBS storici (n = 21), gli aneurismi si sono sviluppati a vari livelli (intervallo: 128% -314%, crescita media del volume aortico SD del 199% ± 55% al giorno 8). È importante sottolineare che è stata osservata una relazione inversa tra l'espansione iniziale e l'ulteriore progressione della malattia, cioè il 55% degli aneurismi a progressione rapida (crescita del volume del >200% al giorno 8) non è progredito ulteriormente fino al giorno 27, mentre l'80% degli altri aneurismi (crescita del volume >125% e <200% al giorno 8) ha continuato ad espandersi fino alla fine dell'esperimento (Figura 1D).
Come recentemente riportato 14,17, i metodi descritti sono stati stabiliti, validati e implementati con successo, ad esempio, per documentare l'effetto terapeutico di un inibitore della citrullinazione istonica (GSK484, per l'inibizione della formazione di trappole extracellulari per neutrofili) nel bloccare la progressione dell'AAA stabilita. I topi carenti di ApoE hanno ricevuto Ang-II a 1000 ng / kg / min da pompe osmotiche impiantate per via sottocutanea per 28 giorni. Gli animali sono stati stratificati da 1:1 a GSK484 (0,2 μg/g/die) o trattamento PBS in base al volume aortico misurato il giorno 8 e sono stati sottoposti alla procedura di cateterismo della vena giugulare il giorno 9. Le iniezioni di droga sono state condotte quotidianamente in un volume di 10 μL/g di peso del topo fino alla fine dello studio17. La Figura 2 mostra risultati ecografici esemplari (n = 2 / gruppo) (decorso temporale di espansione assoluta e relativa del volume o del diametro), rivelando che il trattamento con GSK484 ha inibito la progressione dell'AAA, mentre gli aneurismi hanno continuato ad ingrandirsi nei topi di controllo.
Figura 1: Formazione e progressione di AAA nel modello murino Ang-II rilevato mediante ecografia 3D. (A) L'aorta surrenale è stata monitorata mediante ecografia 3D al basale (BL), giorno 8 (d8) e giorno 27 (d27) dopo l'impianto della pompa Ang-II. Il volume è stato misurato su un tratto di 12 mm dell'aorta surrenale (157 fotogrammi) sulla base di un'immagine ricostruita in 3D. Il diametro aortico massimo è stato determinato dalle immagini EKV. (B) Colorazione trica di una sezione trasversale dell'aorta del giorno 27 dopo il sacrificio di topo e la raccolta di organi. La presenza di una dissezione dell'aorta è indicata da L1/L2 (lume 1 e lumen 2), e il trombo intramurale è indicato con * in A e B. (C) Tasso di incidenza di AAA (crescita del volume aortico >125% da BL) al giorno 8 e rotture aortiche entro i primi 9 giorni (toracico o addominale) da un set di dati raccolti nell'arco di 2 anni (n = 157). (D) Frequenza di progressione dal giorno 8 al giorno 27 di aneurismi inizialmente a formazione rapida (crescita del volume aortico del >200% da BL al giorno 8) rispetto a crescita moderata (crescita del volume aortico del >125% e <200% da BL al giorno 8) in topi trattati con PBS (n = 21). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Risultati esemplari dall'inibizione della citrullinazione istonica per bloccare la progressione di AAA nel modello Ang-II mediante iniezione endovenosa di GSK484 o PBS tramite pulsante di accesso vascolare . (A) Volume aortico (mm3) misurato su un tratto di 12 mm dell'aorta surrenale. (B) Crescita del volume aortico calcolata rispetto al basale (BL = 100%). (C) Diametro aortico massimo determinato dalle immagini EKV. (D) Crescita calcolata del diametro aortico da BL. I dati GSK484 sono stati estratti da uno studio precedentemente pubblicato17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Il modello Ang-II è uno dei modelli murini più comunemente usati di AAA a causa delle sue basse esigenze tecniche e delle caratteristiche particolari che ricordano la malattia umana 3,6. Il tempo di intervento è di circa 10 minuti per animale e l'impianto della pompa sottocutanea è ben tollerato dai topi se la tasca sottocutanea è sufficientemente ampia e posizionata in basso sulla schiena dell'animale, lontano dal sito di incisione, in modo da non interferire con la guarigione della ferita. Quando la pelle è tesa intorno alla pompa, può verificarsi irritazione dei tessuti, che può causare infiammazione e croste e potenzialmente interrompere il meccanismo di rilascio della pompa dalla pressione osmotica. Misurare il volume di Ang-II rimasto nella pompa al momento del sacrificio animale fornisce informazioni sul fatto che l'Ang-II sia stato rilasciato con successo nei 28 giorni.
Il modello Ang-II è stato recentemente proposto per essere adatto per studiare l'aneurisma aortico e la progressione della dissezione in quanto mostra somiglianza con le caratteristiche umane di entrambi6. È importante sottolineare che testare farmaci candidati per bloccare l'espansione aortica e influenzare il rimodellamento corrisponderebbe all'attuale domanda clinica. Nel nostro contesto sperimentale, un cutoff per la formazione di aneurisma è stato definito prima dell'inizio del trattamento sulla base di una crescita del volume del 125% al giorno 8 rispetto al basale, che spiega la variazione naturale delle dimensioni assolute dell'aorta nei topi. La soglia e il punto temporale sono stati derivati da un decorso temporale iniziale che ha confermato la distruzione della parete dell'aorta in istologia (dati non mostrati) e ha provocato rotture del 35% e il 56% di AAA osservati prima dell'impianto del catetere. Mentre una soglia minima di malattia stabilita è stata applicata per l'inclusione nello studio, è stato successivamente osservato che un'elevata estensione dell'espansione iniziale dell'aorta può anche limitare l'applicabilità sperimentale. Gli aneurismi che progredivano rapidamente al >200% del volume entro il giorno 8 non crescevano ulteriormente oltre quella dimensione nel 55% dei casi (Figura 1D). Questo deve essere preso in considerazione durante la progettazione sperimentale e il calcolo delle dimensioni del campione, in quanto potrebbe mascherare il vero effetto di un trattamento. Un altro aspetto di questo modello sono le frequenti rotture aortiche (toraciche o addominali), che si verificano a tassi del 20% -40% e per lo più entro i primi 10 giorni dopo l'impianto della pompa Ang-II 3,18,19. Pertanto, scegliendo l'inizio del trattamento per il giorno 9, è stato raggiunto un alto tasso di aneurismi stabiliti, e il cateterismo della vena giugulare è stato essenzialmente eseguito su topi che avrebbero dovuto sopravvivere fino alla fine dell'esperimento (solo 3/24 topi nel nostro gruppo di controllo storico si sono rotti dopo il giorno 9), risparmiando così tempo, sforzo, e costi.
A parte le rotture dell'aorta, che costituiscono una condizione grave, l'impianto concomitante del catetere con pulsante di accesso vascolare e della pompa osmotica è stato ben tollerato dai topi, senza effetti degni di nota sulla mobilità o sul comportamento dopo il recupero dall'intervento chirurgico. La procedura di cateterismo della vena giugulare dovrebbe richiedere circa 30 minuti per i ricercatori addestrati. La durata dell'esposizione all'anestesia (isoflurano) deve essere ridotta al minimo e la frequenza respiratoria animale deve essere attentamente monitorata per prevenire la depressione respiratoria, che può portare a un esito fatale se non risolta20. La perdita di sangue dopo aver perforato la vena giugulare per l'inserimento del catetere - che porta alla morte dell'animale se grave - potrebbe potenzialmente verificarsi quando la vena giugulare non è adeguatamente legata cranicamente o un ramo laterale che alimenta l'area isolata del vaso non è chiuso. In tal caso, la pressione con un batuffolo di cotone deve essere applicata al sito di puntura fino a quando la perdita di sangue rallenta o si ferma, quindi l'inserimento del catetere e la legatura devono essere eseguiti il più rapidamente possibile; Un piccolo pezzo della medicazione della ferita di collagene può essere temporaneamente utilizzato per aiutare con l'emostasi.
La pervietà del catetere è uno dei fattori più importanti, poiché la disconnessione del catetere dalla vena o dal pulsante di accesso provoca una consegna impropria del farmaco in cui il farmaco fuoriesce nello spazio sottocutaneo. Seguendo la raccomandazione del produttore di una sovrapposizione minima di 3 mm tra il catetere e il connettore metallico, solo un caso di disconnessione del catetere sul lato del pulsante (indicato dal liquido iniettato che fuoriesce dal sito di incisione sul pulsante) è stato registrato in 3 anni in questo modello (2020-2021, n = 73), che è stato risolto aprendo la ferita e ristabilendo la connessione in chirurgia. Inoltre, è stato riscontrato un tasso di fallimento della pervietà del catetere di circa il 10% nel nostro storico gruppo di controllo PBS (2/21) a causa dell'occlusione del catetere (che rende impossibile l'iniezione), della disconnessione del catetere dalla vena (indicata da apparente gonfiore del collo durante l'iniezione) o di complicazioni di guarigione della ferita. Questi problemi possono essere collegati a lesioni autoinflitte, cioè graffi o morsi di topo. In particolare, i trattamenti farmacologici che interferiscono con la guarigione delle ferite possono aumentare i tassi di fallimento. Le procedure di risoluzione dei problemi per migliorare il tasso di pervietà includono l'aumento della lunghezza del catetere inserito nella vena, assicurando che le legature siano strettamente annodate attorno al catetere e alla vena e applicando la tecnica della pressione positiva seguendo le raccomandazioni del produttore, come descritto al punto 2.12.10., durante l'iniezione. La pervietà del catetere deve inoltre essere verificata al momento del sacrificio animale mediante dissezione e ispezione visiva al microscopio. Da notare, il volume giornaliero della soluzione di farmaco iniettato deve essere attentamente considerato. Poiché il volume plasmatico regola la pressione sanguigna, il volume di iniezione può influenzare l'espansione dell'AAA e, quindi, gli animali di controllo devono ricevere la procedura fittizia con il volume del vettore. Sulla base della nostra esperienza (e di osservazioni non pubblicate), una quantità giornaliera fino a 250 μL di PBS sembra essere ben tollerata. Infine, simile all'impianto della pompa, l'irritazione della pelle può verificarsi intorno al pulsante di accesso vascolare impiantato. Se si osserva un'infiammazione accompagnata da tessuto devitalizzato o necrotico, lo sbrigliamento della ferita deve essere effettuato rimuovendo il tessuto non vitale (il tessuto necrotico spesso si separa naturalmente dalla ferita) e la pelle deve essere suturata se necessario; Se l'infiammazione e la necrosi sono estese, il benessere dell'animale e gli endpoint umani devono essere considerati secondo le linee guida.
L'impianto dorsale singolo e doppio della pompa osmotica e/o del VAS non ha interferito con il segnale ecografico né con il fissaggio del mouse in una posizione appropriata sullo stadio ecografico. L'acquisizione automatica di 157 fotogrammi su 12 mm per rendere un'immagine 3D dell'aorta per la misurazione del volume è una procedura semplice e veloce14, che richiede solo di garantire che l'aorta sia libera da interferenze sull'area di interesse. Una trappola in questo contesto è applicare troppa pressione con il trasduttore mentre si tenta di cancellare l'immagine dall'interferenza, che può interrompere la misurazione automatica se la frequenza respiratoria è influenzata dalla compressione delle costole quando vengono registrate le immagini dell'estremità cranica dell'aorta addominale. Il diametro viene tradizionalmente misurato nelle immagini acquisite utilizzando la modalità B dall'operatore che ricerca manualmente l'area di diametro massimo durante l'esecuzione dell'analisi ecografica. Un progresso rispetto alle immagini B-mode sono le immagini EKV, che possono risolvere piccoli movimenti aortici per produrre un'immagine rallentata di alta qualità dell'aorta pulsante. Inoltre, il diametro massimo dell'aorta può essere determinato dai fotogrammi 3D acquisiti, dove le 157 immagini offrono una panoramica completa dell'aorta prelevata a sistole (a causa del trigger ECG impostato).
In conclusione, il protocollo compilato presentato fornisce un flusso di lavoro affidabile e riproducibile per la somministrazione di farmaci per via endovenosa in un modello murino di AAA indotta da Ang-II e per il monitoraggio delle dimensioni aortiche mediante ultrasuoni 3D. I punti temporali di monitoraggio e funzionamento possono essere adattati alle esigenze specifiche e il cateterismo della vena giugulare può essere eseguito separatamente per qualsiasi configurazione sperimentale che richieda la somministrazione di sostanze specifiche tramite iniezioni endovenose. Il VAS può essere utilizzato in alternativa per ripetuti prelievi di sangue se viene utilizzata una soluzione di blocco del catetere per prevenire la coagulazione. La procedura ecografica 3D descritta può essere adattata per misurare l'aorta infrarenale, dove gli aneurismi si sviluppano su insulto acuto in elastasi o modelli murini basati su CaCl2 di AAA. Mentre l'acquisizione ecografica 3D ha il vantaggio di fornire una panoramica della regione dell'aorta interessata e della morfologia dell'aneurisma, l'acquisizione delle immagini richiede più tempo e, quindi, potrebbe essere più costosa. Un'altra limitazione del protocollo che dovrebbe essere riconosciuta è la necessità che gli animali vengano anestetizzati brevemente per iniezioni endovenose, mentre la somministrazione intraperitoneale viene generalmente eseguita su topi coscienti.
Disclosures
Gli autori non hanno rivelazioni.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i team del Prof. Podesser e del Prof. Ellmeier (Dipartimento di ricerca biomedica e Core Facility for Laboratory Animal Breeding and Husbandry, Medical University of Vienna) per l'assistenza negli esperimenti sugli animali. La colorazione tricromatica AAA è stata gentilmente eseguita da Monika Weiss e dal Prof. Peter Petzelbauer (Dipartimento di Dermatologia, Università di Medicina di Vienna). Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo austriaco per la scienza [progetto SFB F 5409-B21]. Marc Bailey è personalmente supportato dalla British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
References
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