Summary
Denne protokol beskriver den på hinanden følgende implantation af en osmotisk pumpe for at inducere abdominal aortaaneurisme ved angiotensin II-frigivelse i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulde mus og af en vaskulær adgangsport med et jugular venekateter til gentagen lægemiddelbehandling. Overvågning af aneurismeudvikling ved 3D-ultralyd udføres effektivt på trods af dorsale implantater.
Abstract
Da der mangler farmaceutiske behandlingsmuligheder i den kliniske styring af abdominal aortaaneurisme (AAA), anvendes dyremodeller, især musemodeller, til at fremme forståelsen af sygdomspatogenesen og til at identificere potentielle terapeutiske mål. Test af nye lægemiddelkandidater for at blokere AAA-vækst i disse modeller kræver generelt gentagen lægemiddeladministration i løbet af eksperimentet. Her beskriver vi en kompileret protokol til AAA-induktion, indsættelse af et intravenøst kateter for at lette langvarig behandling og seriel AAA-overvågning ved 3D-ultralyd. Aneurismer induceres i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulde mus ved angiotensin II frigivelse over 28 dage fra osmotiske mini-pumper implanteret subkutant i musens ryg. Derefter udføres den kirurgiske procedure for ekstern jugular venekateterisering for at muliggøre daglig intravenøs lægemiddelbehandling eller gentagen blodprøvetagning via en subkutan vaskulær adgangsknap. På trods af de to dorsale implantater lettes overvågningen af AAA-udvikling let ved sekventiel halvautomatisk 3D-ultralydsanalyse, som giver omfattende information om udvidelsen af aortadiameter og volumen og om aneurismemorfologi, som illustreret af eksperimentelle eksempler.
Introduction
En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en patologisk dilatation af et kar på grund af inflammatoriske og vævsdestruktive processer i aortavæggen, der i sidste ende kan føre til brud og patientdød. På trods af betydelige resultater inden for kirurgisk AAA-reparation mangler en konservativ lægemiddelbehandling for at blokere progressionen af aneurismeudvidelse og potentielt sænke risikoen for brud til dato. Dyremodeller er udviklet til at belyse udløsere og mediatorer af sygdommen og til at teste nye tilgange til terapi. Musemodeller af AAA anvendes bredt og dækker de forskellige observationer fra humant væv. På grund af deres patomekanistiske forskelle anvendes ofte mere end en model til at undersøge molekylers / vejes særlige funktion eller effektiviteten af potentielle terapeutiske lægemidler 1,2. Blandt de mest almindeligt anvendte modeller af AAA-induktion er angiotensin-II (Ang-II) administration i apolipoprotein E-mangelfuld (ApoE KO) mus3, som har mere kronisk-lignende patogenese sammenlignet med modeller, der er afhængige af aneurismedannelse fra en akut fornærmelse mod aortavæggen 4,5. Ang-II-modellen synes således særligt velegnet til overvågning af sygdomsprogression og har for nylig vist sig at ligne human AAS-sygdom meget med hensyn til metaboliske og inflammatoriske reaktioner6. Især indeholder Ang-II-modellen ikke kun AAA-udvikling, men også thoraxaneurismedannelse samt aortadissektion med intramural trombosedannelse.
Behandlinger, der sigter mod at målrette udviklingen af allerede etableret AAS snarere end at forhindre initiering af sygdommen, kan have højere translationel værdi, da patienter har en allerede eksisterende tilstand, der kræver behandling 7,8. For et sammenligneligt eksperimentelt design skal aortastørrelsen overvåges før og efter AAS-induktion for at definere en tærskel for sygdomsudvikling og potentielt stratificere mus i behandlingsgrupper.
Lægemiddeladministrationsmåden afhænger af optagelsen og stabiliteten af det pågældende stof. Intraperitoneale (i.p.) injektioner anvendes oftest på grund af deres lette anvendelse, ikke kræver bedøvelsesmiddel og manglen på injektionsvolumenbegrænsninger9. Farmakokinetik skal dog tages i betragtning ved valg af indgivelsesvej, da stoffer, der indgives i.p., primært absorberes gennem leverportalcirkulationen og kan gennemgå levermetabolisme, inden de når cirkulation, hvilket kan resultere i varierende plasmakoncentrationer afhængigt af den første passeffekt10. Intravenøs (i.v.) injektion giver den højeste biotilgængelighed af stoffer, og udfordringen med gentagen i.v.-adgang kan omgås ved brug af katetre og vaskulære adgangsporte til daglig administration 11,12,13. Med hensyn til AAS-indstillingen letter lægemiddeldistribution i omløb direkte eksponering for aneurisme ved definerede koncentrationer.
Her beskriver vi en arbejdsgang for inducering af AAA i Ang-II-musemodellen via subkutan implantation af en osmotisk pumpe, til daglig i.v. lægemiddelbehandling via en vaskulær adgangsport forbundet til et kateter indsat i den eksterne jugular vene samt til overvågning af aneurismestørrelse via 3D ultralyd14 på trods af tilstedeværelsen af to dorsale implantater.
Protocol
Dyreforsøg blev godkendt af den lokale etiske komité og det østrigske videnskabsministerium (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016) i overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, og den østrigske lov om dyreforsøg fra 2012. Humane endepunkter blev indstillet som følger: tab af ≥15% kropsvægt, undgåelse af mad og / eller vandindtag, reduceret aktivitet (hypokinesi) eller dyskinesi eller langvarig rysten, ridser, besværet åndedræt eller bøjet kropsholdning på trods af smerte / symptombehandling. Om nødvendigt aflives et dyr under dyb bedøvelse, dvs. en overdosiscocktail af ketamin (ca. 100 mg/kg) og xylazin (ca. 5 mg/kg) eller ved cervikal dislokation. Til kirurgiske procedurer anvendes aseptisk teknik og sterile / rene handsker overalt.
1. Implantation af pumpe
- Anæstesi
- Hold ApoE-mangelfulde mus (B6.129P2-Apoetm1Unc/J) på en normal diæt og inkluder helst 12-14 uger gamle handyr i forsøgene for at repræsentere den mandlige overvægt i human sygdom3.
- 1 dag før operationen (d-1, pre-OP) forberedes og fyldes de osmotiske pumper med den ønskede koncentration af angiotensin II i henhold til musens vægt efter producentens protokol, og pumperne inkuberes i saltvand ved 37 °C natten over15.
Eksempel: For en 25 g mus opløses 1,8 mg Ang-II ved hjælp af osmotiske pumper (se materialetabel) med en leveringshastighed på 1000 ng/kg/min og en pumpehastighed på 0,25 μL/h i 28 dage i 300 μL saltvand (6000 ng/μL koncentration til levering af 1500 ng/h Ang-II). Læg opløsningen med den stumpe påfyldningsnål i pumpen, og indsæt derefter flowmoderatoren for at lukke pumpen. - Anbring musen i anæstesikammeret ved 3% -4% isofluran blandet med 2 L / min O2 , indtil den er bevidstløs. Flyt musen til et opvarmet bord (37 °C) i en udsat position, og hold isofluranbedøvelse ved 1,8%-2% gennem en næsekegle.
- Påfør øjensmøremiddel på begge øjne for at forhindre tørhed.
- Injicer musen med 2,5% buprenorphin i saltvand ved 10 μL/g mus subkutant, og anæstesidybden kontrolleres ved en tåspids.
- Barber et lille område øverst til venstre på musen tilbage over skulderbladet. Påfør 10% (w/ v) povidon-jodopløsning til desinfektion af det barberede område.
- Pumpeindsættelse (5-7 min, udført uden mikroskop)
- Kontroller, at musen er fuldstændig bedøvet ved tåspids og lav et 1 cm tværgående snit i huden på den øvre ryg med en skalpel mellem midspinal og venstre scapular linje.
- Hold huden op med tang og brug stump, buet saks til at lave en subkutan lomme ved at skubbe mod venstre bagben. Åbn saksen, træk den åbnede saks ud af klippet og gentag for at udvide lommen.
- Indsæt forsigtigt pumpen i lommen med flowmoderatoren mod halen (for at minimere potentiel interferens af Ang-II-frigivelse fra snitstedet).
BEMÆRK: Lommen skal ikke kun være bred nok til, at pumpen indsættes, men også til, at huden ikke er tæt omkring pumpen, og der skal være mindst 5 mm mellem pumpen og snitstedet for at muliggøre optimal sårheling. - Luk såret med 4-0 absorberbare afbrudte suturer.
- Injicer musen med 10% glucose i saltvand ved 10 μL/g mus subkutant.
- Påfør povidon-jod sårspray på det lukkede sår og lad musen genvinde bevidstheden under en varmelampe, og returner den derefter til buret med 7,5 mg piritramid (til udvidet smertebehandling) og 20 ml 5% glucose i 200 ml drikkevand i 3 dage efter operationen.
- Kontroller musene flere gange om dagen for tegn på smerte eller nød.
BEMÆRK: Da aortabrud forekommer med en hastighed på 20% -40% og overvejende inden for de første 3-10 dage efter operationen, skal risikoen for langvarig alvorlig smerte eller nød minimeres ved hyppig dyreovervågning. De vigtigste indikationer for forestående brud inkluderer: adskillelse fra gruppen, bøjet kropsholdning, nedsat mobilitet (i tilfælde af lammelse af bagbenene) og nedsat eller ikke-lydhørhed under håndtering.
2. Jugular venekateterisering
BEMÆRK: Denne kirurgiske procedure kræver et mikroskop med 8x-10x forstørrelse.
- Brug det vaskulære adgangssystem (se Materialetabel) til at forberede kateteret ved at skære 3Fr-siden til den ønskede længde (~ 5-7 mm før silikoneankeret) og skubbe kateteret over 22 G metalstikket i det vaskulære adgangssystem (VAS) med mindst 3 mm overlapning. Placer aluminiumshætten på knappen for at beskytte porten.
- Forbered 1-1,5 cm lange 6-0 silke ligaturer.
- Anbring musen i anæstesikammeret ved 3% -4% isofluran blandet med 2 L / min O2 , indtil den er bevidstløs.
- Flyt musen til et opvarmet bord (37 °C) i liggende stilling og hold isofluranbedøvelse ved 1,8%-2% gennem en næsekegle.
- Påfør øjensmøremiddel på begge øjne for at forhindre tørhed.
- Injicer musen med 2,5% buprenorphin i saltvand ved 10 μL/g mus subkutant.
- Barber pelsen fra højre side af nakken på den ventrale side og på højre side af den øvre del af ryggen (venstre side vil have den implanterede osmotiske pumpe).
- Påfør povidon-jodopløsningen til desinfektion af det barberede område.
- Kontroller, at musen er fuldstændig bedøvet ved tåspids.
- Jugular vene forberedelse (5-10 min, udført under mikroskopet)
- Lav et 0,5 cm tværgående supraklavikulært hudsnit i højre side af nakken over højre kraveben.
- Brug stump mikrokirurgisk pincet til at adskille bindevæv og fedt og udsætte den ydre halsvene. Undgå at rive små blodkar i fedt fra hinanden.
- Isoler mindst 5 mm af karret tæt på brystmusklerne.
- Stump dissekere væv under venen ved hjælp af bøjet mikropincet og passere gennem 2-3 af 6-0 ligaturerne.
BEMÆRK: Hvis der identificeres sidegrene i interesseområdet, skal ligaturen enten indsættes for at være kaudal til sidegrenen, eller sidegrenen skal permanent ligeres ved at isolere og binde med en 6-0 ligatur. - Tag ligaturerne ind og tilsæt en dråbe saltvand til stedet.
- Knapimplantation (5-7 min, udført uden mikroskop)
- Vend musen om og placer den i den udsatte position; Kontroller dybden af anæstesi ved en tåspids og påfør povidon-jodopløsningen for at desinficere det barberede område.
- Lav et 1 cm sagittal snit på øvre ryg med en skalpel mellem midspinal og højre scapular linjer.
- Brug stump buet saks til at gøre en cirkulær lomme kun lidt større end størrelsen på VAS omkring snitstedet ved stump dissektion.
- Brug den stumpe buede saks til at tunnelere kranialt over højre skulder mod det ventrale snit i nakken ved at åbne saksen let, derefter trække den åbne saks ud og gentage handlingen, når den skubbes længere ind.
BEMÆRK: Musen kan drejes på venstre side for dette trin. - Når tunnelen har nået det ventrale snit, skal du passere gennem kirurgiske klemmer fra det ventrale til det dorsale snit.
- Fastgør 3Fr-enden af kateteret til klemmen, og træk kateteret gennem tunnelen, så det er ude af det ventrale halssnit, og VAS er på plads ved dorsal snittet.
- Indsæt VAS's kirurgiske filtskive subkutant ved snittet på bagsiden.
- Fjern kateteret og skyl med saltvand eller fosfatbufferet saltvand uden calcium og magnesium (PBS-/-), kontroller for patency ved at bruge gaffelenden af håndteringsværktøjet til at fjerne den beskyttende aluminiumshætte, og brug derefter den magnetiske ende til at holde knappen nede og injicere med en 1 ml sprøjte fastgjort til den tilsvarende injektor, indtil væsken lækker fra 1Fr-enden.
BEMÆRK: Kateterskylning kan alternativt udføres i trin 2.1. - Tryk forsigtigt på knappen i lommen, og luk huden over VAS's filtskive under VAS'ens flange med mindst to 4-0 afbrudte suturer kranialt.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er spændinger på huden omkring knappen.
- Venekateterisering (7-10 min, udført under mikroskopet)
- Vend musen tilbage til liggende position, kontroller dybden af anæstesi med en tåspids, og tilsæt en dråbe saltvand til skærestedet.
- Bind den første ligatur omkring kateteret og halsvenen med 2-3 knuder så langt som muligt for at ligate venen og forankre kateteret udefra. Flyt den anden ligatur så tæt som muligt på brystmusklerne.
- Forkort kateteret til den krævede længde, så ~ 3-5 mm af kateteret er i venen ved at skære med mikrosaks i en diagonal vinkel for at skabe en skarp ende.
- Gennembor et hul i venen ved hjælp af en 27 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte fyldt med saltvand ved at trække i den sikrede kraniale ligatur og skubbe nålen parallelt med venen.
BEMÆRK: Hvis blod fra tilbagestrømning lækker fra venen, skal du bruge en vatpind til at lægge pres på, indtil blødningen stopper. - Indsæt kateteret i venen på samme måde ved at trække i den sikrede kraniale ligatur og skubbe kateteret ind i venen ved hjælp af den bøjede pincet. Skub kateteret, indtil det er justeret med venen.
- Bind den anden ligatur over regionen, hvor kateteret indsættes i venen med 2-3 knuder, og kontroller, at der ikke er blodlækage. En tredje ligatur og noget af det lokale fedtvæv kan bruges til yderligere at sikre kateteret.
- Skær den overskydende ende af begge ligaturer af med mikrosaks og tilsæt en dråbe saltvand.
- Luk huden med 4-0 absorberbare afbrudte suturer.
- Injicer musen med 10% glucose i saltvand ved 10 μL/g mus subkutant.
- Injicer musen med det ønskede volumen inhibitor eller PBS/saltvand ved at bruge gaffelenden af håndteringsværktøjet til at fjerne den beskyttende aluminiumshætte og derefter den magnetiske ende til at holde knappen nede og injicere med en 1 ml sprøjte fastgjort til injektoren.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luft eller luftbobler i injektionssprøjten ved at trykke på stemplet, indtil der kommer en dråbe væske ud, før injektionen. Oprethold positivt tryk på stemplet, mens du frakobler sprøjten med injektoren fra VAS for at forhindre, at blod trækkes ind i kateterspidsen og forårsager kateterblokering. - Påfør en povidon-jod sårspray på det lukkede sår og lad musen genvinde bevidstheden under en varmelampe, og returner den derefter til buret med 7,5 mg piritramid (til udvidet smertebehandling) og 20 ml 5% glucose i 200 ml drikkevand i 3 dage efter operationen.
- Kontroller musene flere gange om dagen for tegn på smerte eller nød.
- Daglige injektioner (<5 min)
- Ved daglig injektion anbringes musen i anæstesikammeret ved 3%-4% isofluran blandet med 2 l/min O2 , indtil den er bevidstløs, og dens vejrtrækningshastighed er nedsat, og derefter injiceres som i trin 2.12.10. Kontroller nakken for tegn på hævelse efter injektion, hvilket ville indikere, at kateteret ikke længere indsættes i venen. Bemærk også, at injektion ikke er mulig, hvis kateteret er okkluderet.
BEMÆRK: En injektion på 10 μL/g musevægt 1x pr. dag tolereres godt af musene.
- Ved daglig injektion anbringes musen i anæstesikammeret ved 3%-4% isofluran blandet med 2 l/min O2 , indtil den er bevidstløs, og dens vejrtrækningshastighed er nedsat, og derefter injiceres som i trin 2.12.10. Kontroller nakken for tegn på hævelse efter injektion, hvilket ville indikere, at kateteret ikke længere indsættes i venen. Bemærk også, at injektion ikke er mulig, hvis kateteret er okkluderet.
3.3D ultralyd
- Forbered ultralydsbilleddannelsessystemet, varmebordet og gelvarmeren, fastgør transduceren til systemet og sæt op over scenen i en tværgående position (dvs. vinkelret på museryggen).
- Brug ultralydssoftwaren til at justere indstillingerne til forstærkning på 30 dB, billeddybde på 9,0 mm og billedbredde på 8,08 mm.
- Anbring musen i anæstesikammeret ved 3% -4% isofluran blandet med 2 L / min O2 , indtil den er bevidstløs. Flyt musen til et opvarmet bord (37 °C) i liggende stilling og hold isofluranbedøvelse ved 1,8%-2% gennem en næsekegle.
- Påfør øjensmøremiddel på begge øjne for at forhindre tørhed.
- Barber pelsen på musens mave. Påfør hårfjerningscreme i 1 minut, hvis det er nødvendigt, tør derefter af og rengør med fugtigt gasbind.
- Tilsæt en dråbe elektrodegel til hver af de fire elektrokardiogram (EKG) elektroder på scenen og tape musens ekstremiteter til dem.
- Spred varm ultralydsgel på musens mave og sænk senderen for at sætte den i kontakt med dyret.
- Identificer aorta som et cirkulært hurtigt pulserende fartøj.
BEMÆRK: Den ringere vena cava (IVC) vil være placeret ved siden af aorta, og hvis sonden presses fast ned, komprimeres IVC, mens aorta forbliver stabil. Bekræftelse af, at den analyserede beholder er aorta snarere end IVC, kan opnås ved hjælp af pulsbølgedoppleren (PW-tilstand) med en vinkel på 65 °. Aorta vil have en høj pulsbølgehastighed. - Find den venstre nyrearterie, og undersøg området manuelt op til 12 mm kranialt for at sikre, at der ikke er nogen interferens i interesseområdet (dvs. suprarenal aorta). Vend tilbage til venstre nyrearterie, og indstil derefter sonden til 6 mm kranialt fra venstre nyrearterie.
BEMÆRK: 3D-ultralydet registrerer den angivne længde (dvs. 12 mm) startende halvvejs (6 mm) kaudalt fra oprindelsesstedet og op ad den specificerede længde (12 mm) kranialt. Fejlfindingstrin for interferens inkluderer at trykke lidt ned med transduceren, løfte derefter sænke transduceren igen, anvende mere ultralydsgel og vippe trinnets vinkel. - 3D ultralyd erhvervelse
- Indstil respirationsgateringen til 25% forsinkelse og et vindue på 50% og EKG-udløseren (T1) til 50 ms (for at registrere maksimal systolisk udvidelse af aorta).
BEMÆRK: Åndedrætsgasning kan optimeres for hvert dyr baseret på respirationsfrekvensen og indsatsen for at sikre, at bevægelsesartefakter fjernes. - Fra 3D-indstillingerne skal du indstille scanningsafstanden til 11,96 mm med en trinstørrelse på 0,076 mm, hvilket resulterer i 157 rammer.
- Programmet henter automatisk de 157 rammer på ca. 1-2 min. Rul igennem for at kontrollere billedkvaliteten, gentag, hvis den er subpar, og gem derefter billedet.
- Indstil respirationsgateringen til 25% forsinkelse og et vindue på 50% og EKG-udløseren (T1) til 50 ms (for at registrere maksimal systolisk udvidelse af aorta).
- Erhvervelse af 2D-diameter
- Sluk for åndedrætsgatering og EKG-udløseren, og find manuelt området med den største diameter i 12 mm strækningen af suprarenal aorta.
- Få et billede i B-tilstand16.
- Uden at flytte transduceren skal du desuden erhverve et EKV-billede (EKV) (EKG-gated kilohertz) med systemets standardindstillinger på samme sted.
- Afslutning af scanningen
- Tør ultralydsgelen fra maven og returner musen til buret. Overvåg musen, indtil den kommer sig helt.
4. Ultralydsanalyse
- Analyse af volumen
- I analysesoftwaren skal du åbne billedet i 3D-tilstand, og under menuen Billedbehandling skal du trykke på Indlæs i 3D, som vil kompilere 157 2D-rammerne til et 3D-billede (dvs. terning).
- I menuen Volumenmåling skal du vælge Parallel - rotationsmetoder, og derefter viser softwaren 3D-billedet i en enkelt rude.
- Tryk på Start under Lydstyrke, og tegn den første kontur rundt om aortas indre væg ved at klikke for at tilføje det første punkt, flytte markøren rundt om aorta og derefter højreklikke for at fuldføre konturen.
- Spring over 9-10 rammer (0,75-1 mm), og tegn derefter en anden kontur på samme måde. Gentag disse trin, indtil det sidste billede er nået. Dette skal resultere i 16-17 konturer.
BEMÆRK: De første og sidste rammer skal have tegnet konturer, for at den korrekte volumen over 12 mm kan beregnes. - Vælg den første kontur i menuen, og vælg Afgræns. Dette vil starte kantdetekteringsalgoritmen for at passe linjen tæt på karvæggen. Flyt punkterne på konturen ved at trække dem til en ny position, så konturen nøjagtigt linjer aortas indre vægkant.
BEMÆRK: I Ang-II-modellen kan en intramural trombose være til stede. Da dette er et fælles træk ved denne model, bør volumenmåling omfatte tromben. - Finjuster alle konturerne, og tryk på Udfør for at gemme analysen. Den beregnede lydstyrke vises i nederste venstre hjørne.
- Analyse af diameter
BEMÆRK: Diametermålinger kan udføres indvendigt til indre væg, ydre til ydre væg eller indre til ydre væg, men skal være konsistente for alle målinger. I Ang-II-modellen kan der dog være en intramural trombose til stede, som bør indgå i analysen.- Fra billedet i 3D-tilstand: Evaluer de 157 billeder for at identificere den maksimale diameter ved visuel inspektion. Vælg derefter Lineær i menuen Måling, og tegn flere linjer på tværs af aorta for at bestemme den største diameter.
- Fra billedet B-mode eller EKV (EKG-gated kilohertz visualization): I cine loop skal du identificere den maksimale udvidelse af aorta (ved systole) ved visuel inspektion. Vælg derefter Lineær i menuen Måling, og tegn flere linjer på tværs af aorta for at bestemme den største diameter.
BEMÆRK: EKG kan bruges til at bestemme hjertecyklussen, men visuel identifikation giver nøjagtige resultater.
Representative Results
Repræsentative resultater viser udviklingen og progressionen af de suprarenale aneurismer som overvåget af ultralyd ved baseline, dag 8 og dag 27 (figur 1A). En trikrom plet (figur 1B) på dag 27 aorta i figur 1A illustrerer yderligere morfologien af den dannede aneurisme med vægdissektion og intramural trombose. Aortavolumen (mm3) blev bestemt over en strækning på 12 mm14, og maksimal aortadiameter blev desuden målt fra EKV-billederne. En tærskel på 125% volumenvækst fra baseline til dag 8 blev fastsat for at definere indledende aneurismeudvikling. Baseret på data indsamlet over 2 år (2020-2021, n = 157) undlod kun 9% af dyrene at danne en AAA i henhold til denne afskæring. Imidlertid oplevede 35% af musene aortabrud (thorax eller abdominal) før kateterimplantation på dag 9, hvilket resulterede i, at i alt 56% af de resterende dyr med etableret AAS-sygdom kunne stratificeres i behandlingsgrupper (figur 1C). Bemærk, at blandt vores historiske PBS-kontroller (n = 21) udviklede aneurismer sig i varierende grad (interval: 128% -314%, gennemsnit 199% ± 55% SD aortavolumenvækst på dag 8). Det er vigtigt, at der blev observeret en omvendt sammenhæng mellem den indledende ekspansion og yderligere sygdomsprogression, dvs. 55% af hurtigt fremadskridende aneurismer (>200% volumenvækst på dag 8) udviklede sig ikke yderligere før dag 27, mens 80% af de andre aneurismer (>125% og <200% volumenvækst på dag 8) fortsatte med at ekspandere indtil eksperimentets afslutning (figur 1D).
Som nyligt rapporteret 14,17 er de beskrevne metoder blevet etableret, valideret og implementeret, f.eks. for at dokumentere den terapeutiske virkning af en histoncitrullinationsinhibitor (GSK484, til hæmning af neutrofil ekstracellulær trapdannelse) ved blokering af progressionen af etableret AAS. ApoE-mangelfulde mus modtog Ang-II ved 1000 ng / kg / min ved subkutant implanterede osmotiske pumper over 28 dage. Dyrene blev stratificeret 1:1 til GSK484 (0,2 μg/g/dag) eller PBS-behandling baseret på aortavolumen målt på dag 8 og gennemgik halsvenekateteriseringsproceduren på dag 9. Lægemiddelinjektioner blev udført dagligt i et volumen på 10 μL/g musevægt indtil afslutningen af undersøgelsen17. Figur 2 viser eksemplariske (n = 2 / gruppe) ultralydsresultater (tidsforløb med absolut og relativ volumen- eller diameterudvidelse), hvilket afslører, at GSK484-behandling hæmmede AAA-progression, mens aneurismerne fortsatte med at forstørre i kontrolmus.
Figur 1: AAA-dannelse og progression i Ang-II-musemodellen som detekteret ved 3D-ultralyd. (A) Den suprarenale aorta blev overvåget af 3D-ultralyd ved baseline (BL), dag 8 (d8) og dag 27 (d27) efter Ang-II pumpeimplantation. Volumen blev målt over en 12 mm strækning af suprarenal aorta (157 billeder) baseret på et 3D rekonstrueret billede. Den maksimale aortadiameter blev bestemt ud fra EKV-billeder. (B) Trikrom plet af en tværgående del af dagen 27 aorta efter museofring og organindsamling. Tilstedeværelsen af en aorta dissektion er angivet med L1 / L2 (lumen 1 og lumen 2), og den intramurale trombose er betegnet med * i A og B. (C) Incidensrate for AAA (>125% aortavolumenvækst fra BL) på dag 8 og aortabrud inden for de første 9 dage (thorax eller abdominal) fra et datasæt indsamlet over 2 år (n = 157). (D) Progressionsfrekvens fra dag 8 til dag 27 af oprindeligt hurtigt dannende (>200% aortavolumenvækst fra BL til dag 8) versus moderat voksende (>125% og <200% aortavolumenvækst fra BL til dag 8) aneurismer i PBS-kontrolbehandlede mus (n = 21). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksemplariske resultater fra hæmning af histoncitrullination for at blokere AAA-progression i Ang-II-modellen ved intravenøs injektion af GSK484 eller PBS via vaskulær adgangsknap. (A) Aortavolumen (mm3) målt over en 12 mm strækning af suprarenal aorta. (B) Beregnet aortavolumenvækst fra baseline (BL = 100%). (C) Maksimal aortadiameter som bestemt ud fra EKV-billeder. (D) Beregnet vækst i aortadiameter fra BL. GSK484-data blev udtrukket fra en tidligere offentliggjort undersøgelse17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Ang-II-modellen er en af de mest almindeligt anvendte musemodeller af AAA på grund af dens lave tekniske krav og særlige egenskaber, der ligner menneskelig sygdom 3,6. Operationstiden er ca. 10 minutter pr. Dyr, og den subkutane pumpeimplantation tolereres godt af musene, hvis den subkutane lomme er tilstrækkelig bred og placeret lavt på dyrets ryg væk fra snitstedet for ikke at forstyrre sårheling. Når huden er tæt omkring pumpen, kan der opstå vævsirritation, som kan forårsage betændelse og skorpedannelse og potentielt forstyrre pumpens frigivelsesmekanisme ved osmotisk tryk. Måling af mængden af Ang-II, der er tilbage i pumpen på tidspunktet for dyreofring, giver indsigt i, om Ang-II blev frigivet med succes i løbet af de 28 dage.
Ang-II-modellen er for nylig blevet foreslået at være velegnet til at studere aortaaneurisme og dissektionsprogression, da den udviser lighed med menneskelige træk ved begge6. Det er vigtigt, at test af lægemiddelkandidater til at blokere aortaudvidelse og påvirke ombygning ville matche den nuværende kliniske efterspørgsel. I vores eksperimentelle indstilling blev der defineret en cutoff for aneurismedannelse før behandlingsstart baseret på 125% volumenvækst på dag 8 i forhold til baseline, hvilket tegner sig for den naturlige variation i absolut aortastørrelse hos mus. Tærsklen og tidspunktet blev afledt af et indledende tidsforløb, der bekræftede ødelæggelse af aortavæggen i histologi (data ikke vist) og resulterede i 35% brud og 56% observerede AAA'er før kateterimplantation. Mens en minimumstærskel for etableret sygdom blev anvendt til undersøgelsesinklusion, blev det efterfølgende observeret, at et højt omfang af indledende aortaudvidelse også kan begrænse eksperimentel anvendelighed. Aneurismer, der hurtigt udviklede sig til >200% volumen på dag 8, voksede ikke yderligere ud over denne størrelse i 55% af tilfældene (figur 1D). Dette skal tages i betragtning under eksperimentelt design og beregning af prøvestørrelse, da det kan maskere en behandlings sande effekt. En anden facet af denne model er de hyppige aortabrud (thorax eller abdominal), der forekommer med hastigheder på 20% -40% og for det meste inden for de første 10 dage efter Ang-II pumpeimplantation 3,18,19. Ved at vælge starten af behandlingen til at være dag 9 blev der således opnået en høj grad af etablerede aneurismer, og jugular venekateteriseringen blev i det væsentlige udført på mus, der forventedes at overleve til slutningen af eksperimentet (kun 3/24 mus i vores historiske kontrolgruppe bristede efter dag 9), hvilket sparer tid, kræfter, og omkostninger.
Bortset fra aortabruddene, som udgør en alvorlig tilstand, blev den samtidige implantation af kateteret med vaskulær adgangsknap og den osmotiske pumpe tolereret godt af musene uden nogen bemærkelsesværdig effekt på mobilitet eller adfærd efter genopretning efter operationen. Den jugular venekateteriseringsprocedure bør tage ca. 30 minutter for uddannede forskere. Varigheden af eksponering for (isofluran) anæstesi bør holdes på et minimum, og dyrets vejrtrækningshastighed skal overvåges nøje for at forhindre vejrtrækningsdepression, hvilket kan føre til et dødeligt udfald, hvis det ikke løses20. Blodtab efter punktering af halsvenen til kateterindsættelse - hvilket fører til dyredød, hvis større - kan potentielt forekomme, når halsvenen ikke er korrekt ligeret kranialt, eller en sidegren, der føres ind i det isolerede område af karret, ikke er lukket. I så fald skal trykket med en vatpind påføres punkteringsstedet, indtil blodlækagen sænkes eller stopper, så kateterindsættelsen og ligeringen skal udføres så hurtigt som muligt; et lille stykke af kollagen sårforbinding kan midlertidigt anvendes til at hjælpe med hæmostase.
Kateterpatency er en af de vigtigste faktorer, da kateterafbrydelse fra venen eller adgangsknappen resulterer i forkert lægemiddelafgivelse, hvor lægemidlet lækker ind i det subkutane rum. Efter producentens anbefaling om mindst 3 mm overlapning mellem kateteret og metalforbindelsen blev der kun registreret et tilfælde af kateterafbrydelse på knapsiden (angivet ved den injicerede væske, der lækker fra snitstedet ved knappen) over 3 år i denne model (2020-2021, n = 73), som blev fastgjort ved at åbne såret og genoprette forbindelsen i kirurgi. Derudover blev der oplevet en kateterpatencysvigtrate på omkring 10% i vores historiske PBS-kontrolgruppe (2/21) på grund af enten kateterokklusion (hvilket gør det umuligt at injicere), kateterafbrydelse fra venen (indikeret ved tilsyneladende hævelse i nakken under injektion) eller sårhelingskomplikationer. Disse problemer kan være forbundet med selvpåførte skader, dvs. museridser eller bid. Især kan lægemiddelbehandlinger, der forstyrrer sårheling, øge fejlfrekvensen. Fejlfindingstrin til forbedring af patencyhastigheden omfatter forøgelse af længden af kateteret indsat i venen, sikring af, at ligaturer er tæt knyttet omkring kateteret og venen, og påføring af positivtryksteknikken efter producentens anbefaling, som beskrevet i trin 2.12.10., under injektion. Kateterpatency bør desuden verificeres på tidspunktet for dyreofring ved dissektion og visuel inspektion under mikroskopet. Bemærk, at den daglige mængde injiceret lægemiddelopløsning skal overvejes nøje. Da plasmavolumen regulerer blodtrykket, kan injektionsvolumenet påvirke AAA-ekspansion, og derfor skal kontroldyr modtage sham-proceduren med bærervolumen. Baseret på vores erfaring (og upublicerede observationer) synes en daglig mængde på op til 250 μL PBS at være veltolereret. Endelig kan der i lighed med pumpeimplantationen forekomme hudirritation omkring den implanterede vaskulære adgangsknap. Hvis der observeres betændelse ledsaget af devitaliseret eller nekrotisk væv, skal sårdebridering udføres ved at fjerne ikke-levedygtigt væv (nekrotisk væv vil ofte adskille sig naturligt fra såret), og huden skal sutureres om nødvendigt; hvis inflammation og nekrose er omfattende, skal dyrets velfærd og humane endepunkter overvejes i henhold til retningslinjerne.
Enkelt og dobbelt dorsal implantation af den osmotiske pumpe og / eller VAS forstyrrede ikke ultralydssignalet eller med at fastgøre musen i en passende position på ultralydsstadiet. Den automatiserede erhvervelse af 157 billeder over 12 mm for at gengive et 3D-billede af aorta til volumenmåling er en enkel og hurtig procedure14, som kun kræver, at aorta er fri for interferens over interesseområdet. En faldgrube i denne sammenhæng er at lægge for meget pres på transduceren, mens man forsøger at rydde billedet af interferens, hvilket kan afbryde den automatiserede måling, hvis vejrtrækningshastigheden påvirkes af kompressionen af ribbenene, når billeder af kranialenden af abdominal aorta registreres. Diameter måles traditionelt i billeder erhvervet ved hjælp af B-tilstand af operatøren manuelt at søge efter området med maksimal diameter, mens han udfører ultralydsanalysen. Et fremskridt på B-mode-billederne er EKV-billederne, som kan løse små aortabevægelser for at producere et højkvalitets, bremset billede af den pulserende aorta. Desuden kan den maksimale aortadiameter bestemmes ud fra de erhvervede 3D-rammer, hvor de 157 billeder giver et omfattende overblik over aorta taget ved systole (på grund af den indstillede EKG-udløser).
Afslutningsvis giver den præsenterede kompilerede protokol en pålidelig og reproducerbar arbejdsgang til i.v. lægemiddeladministration i en musemodel af Ang-II-induceret AAS og til overvågning af aortastørrelse ved 3D-ultralyd. Tidspunkterne for overvågning og drift kan tilpasses de specifikke behov, og halsvenekateteriseringen kan udføres separat for enhver eksperimentel opsætning, der kræver levering af specifikke stoffer via i.v. injektioner. VAS kan alternativt anvendes til gentagen blodprøvetagning, hvis der anvendes en kateterlåsopløsning for at forhindre koagulering. Den beskrevne 3D ultralydsprocedure kan tilpasses til at måle den infrarenale aorta, hvor aneurismer udvikler sig ved akut fornærmelse i elastase eller CaCl2-baserede musemodeller af AAA. Mens 3D-ultralydsopsamling har fordelen ved at give et overblik over den berørte aorta-region og aneurismemorfologi, er billedoptagelsen mere tidskrævende og kan derfor være mere omkostningskrævende. En anden begrænsning af protokollen, der bør anerkendes, er behovet for, at dyrene bedøves kortvarigt til intravenøse injektioner, mens intraperitoneal administration generelt udføres på bevidste mus.
Disclosures
Forfatterne har ingen afsløringer.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke prof. Podessers og prof. Ellmeiers teams (afd. for biomedicinsk forskning og kernefacilitet for laboratoriedyravl og husdyrhold, Medical University of Vienna) for hjælp i dyreforsøgene. AAA trichrom farvning blev venligt udført af Monika Weiss og Prof. Peter Petzelbauer (Afd. for Dermatologi, Medical University of Vienna). Dette arbejde blev støttet af den østrigske videnskabsfond [SFB-projekt F 5409-B21]. Marc Bailey er personligt støttet af British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
References
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).
- Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Phillips, E. H., et al. Morphological and biomechanical differences in the elastase and AngII apoE -/- rodent models of abdominal aortic aneurysms. BioMed Research International. 2015, 413189 (2015).
- Gäbel, G., et al. Parallel murine and human aortic wall genomics reveals metabolic reprogramming as key driver of abdominal aortic aneurysm progression. Journal of the American Heart Association. 10 (17), 20231 (2021).
- Phie, J., Thanigaimani, S., Golledge, J. Systematic review and meta-analysis of interventions to slow progression of abdominal aortic aneurysm in mouse models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1504-1517 (2021).
- Lu, H. S., Owens, A. P., Liu, B., Daugherty, A. Illuminating the importance of studying interventions on the propagation phase of experimental mouse abdominal aortic aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1518-1520 (2021).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: Should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Research. 37 (1), 1-17 (2020).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Derde, S., et al. Use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness. Journal of Visualized Experiments. (123), e55553 (2017).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Waduud, M. A., et al. High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm. Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).
- Eilenberg, W., et al. Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms. Translational Research. 233, 32-46 (2021).
- Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).
- Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis. Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).
