Summary
We hebben eerder protocollen ontwikkeld voor Caenorhabditis elegans om associatieve herinneringen op korte en lange termijn te vormen door respectievelijk massale en gespreide training. Hier worden gedetailleerde protocollen beschreven voor de conditionering van C. elegans door 1-propanol en zoutzuur te koppelen als respectievelijk geconditioneerde en ongeconditioneerde stimuli om een aversief associatief geheugen te vormen.
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om leren en geheugen op moleculair en cellulair niveau te bestuderen vanwege de eenvoud van het zenuwstelsel, waarvan de chemische en elektrische bedradingsschema's volledig werden gereconstrueerd uit seriële elektronenmicrografieën van dunne secties. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor de conditionering van C. elegans door massale en gespreide training voor de vorming van respectievelijk kortetermijngeheugen (STM) en langetermijngeheugen (LTM). Door respectievelijk 1-propanol en zoutzuur te koppelen als geconditioneerde en ongeconditioneerde stimuli, werd C. elegans met succes getraind om aversieve associatieve STM en LTM te vormen. Terwijl naïeve dieren zich aangetrokken voelden tot 1-propanol, werden de getrainde dieren niet langer of zeer zwak aangetrokken tot 1-propanol. Net als bij andere organismen zoals Aplysia en Drosophila spelen "leer- en geheugengenen" een essentiële rol bij de vorming van het geheugen. Met name NMDA-type glutamaatreceptoren, uitgedrukt in slechts zes paren interneuronen in C. elegans, zijn nodig voor de vorming van zowel STM als LTM, mogelijk als toevalsfactor. Daarom kan het geheugenspoor zich tussen de interneuronen bevinden.
Introduction
Leren en geheugen zijn van vitaal belang voor dieren om te overleven en zich voort te planten door efficiënt te navigeren in veranderende omgevingen. C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om leren en geheugen op moleculair en cellulair niveau te bestuderen vanwege de eenvoud van zijn zenuwstelsel, waarvan de chemische en elektrische bedradingsschema's volledig werden gereconstrueerd uit seriële elektronenmicrografieën van dunne secties 1,2,3.
C. elegans leert teelttemperatuur te associëren met uithongering en migreert weg van zijn groeitemperatuur met een aversief geheugen dat enkele uren duurt 4,5. Conditionering van C. elegans met natriumchloride (NaCl) in afwezigheid van voedsel leidt tot een vermindering van chemotaxis in de richting van NaCl 6,7,8. In combinatie met voedsel wordt de aantrekkingskracht van butanone verbeterd als gevolg van appetitief leren 9,10,11. Hoewel deze verschijnselen worden geïnterpreteerd als associatief leren en geheugen10,12, is het onderscheid tussen associatief leren en niet-associatieve sensibilisatie, gewenning en aanpassing niet duidelijk in het C. elegans leer- en geheugenparadigma13,14. Inderdaad, dieren geconditioneerd met butanone en voedseldeprivatie (aversieve conditionering) vertoonden een depressieve koppeling van het butanone sensorische neuron AWCON om neuronen te targeten door insulinesignalen van andere neuronen, waaronder AIA-interneuronen, terwijl dieren geconditioneerd met butanone en voedsel (appetitieve conditionering) een verbeterde koppeling van AWCON vertoonden om neuronen 15 te targeten15 . De insulinesignalering veroorzaakt genexpressieveranderingen geïnduceerd door nucleaire EGL-4 en andere transcriptionele regulatoren16,17. Dit aversieve en appetitieve leren en geheugen heeft dus analogieën met niet-associatieve gewenning en sensibilisatie, respectievelijk, van presynaptische sensorische neuronen in de kieuwontwenningsreflex in Aplysia 18,19.
Door twee chemicaliën te koppelen als de geconditioneerde stimulus (CS) en ongeconditioneerde stimulus (VS), hebben wij en anderen protocollen ontwikkeld voor de conditionering van C. elegans om associatief leren en geheugen te vormen zonder voedsel of honger te gebruiken als de US 20,21,22,23. In de huidige studie zijn de protocollen aangepast om dieren te conditioneren met 1-propanol en zoutzuur (HCl, pH 4,0) als respectievelijk de CS en us, voor aversief leren en kortetermijngeheugen (STM) en langetermijngeheugen (LTM). Naïeve C. elegans wordt aangetrokken door 1-propanol24 en afgestoten door zuur25. Bij geconditionering met een mengsel van 1-propanol en HCl (pH 4,0) werd C. elegans niet langer of zeer zwak aangetrokken tot 1-propanol.
Protocol
1. Recepten
- NGM-agarplaten (stap 2.1.)
- Om NGM-platen van 6 cm te bereiden, lost u 2,5 g pepton, 3 g NaCl en 17 g agar op in 850 ml dubbel gedeïoniseerd H2O (ddH2O). Breng het totale volume op 972 ml met ddH2O.
- Koel na het autoclaveren af tot ~65 °C en voeg 1 ml 5 mg/ml cholesterol opgelost in ethanol, 1 ml elk van 1 M CaCl2 en 1 M MgSO4 en 25 ml kaliumfosfaat (pH 6,0) toe. Na goed mengen, doseer 8 ml elk tot 6 cm (in diameter) petrischalen.
- Bewaar de borden met deksels op een bank bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 dag en bewaar ze vervolgens in plastic in een koude ruimte tot gebruik.
- Bereid Luria-Bertani (LB) medium (stap 2.1.) door 10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g NaCl op te lossen in 1 L ddH2O. Pas de pH aan op 7,0 met 5 N NaOH (enkele druppels) en steriliseer door autoclaveren.
- Bereid LB-platen door 15 g agar toe te voegen aan LB-medium. Koel na het autoclaveren af tot ~60 °C en doseer 12 ml elk tot 9 cm (in diameter) petrischalen. Bewaar borden in plasticgoed in een koude ruimte tot gebruik.
- Om een dierenverzamelaar te maken (stap 2.4.), bevestigt u nylon gaas (30 μm maaswijdte) aan de onderkant van een heldere acryl cilindrische buis (3,5 cm lang, 3 cm in uitwendige diameter, 2 mm in wanddikte) met lijm.
- Om 0,25% waterige gelatine-oplossing te maken (stap 2.4.), Lost u 0,25 g gelatine op in 100 ml ddH2O. Steriliseren door autoclaveren.
- Chemotaxis-testplaten (stap 5.1.)
- Om agarplaten voor chemotaxistest te maken, lost u 15 g agar op in 993 ml ddH2O door autoclaveren en koelt u de oplossing af tot ~ 65 °C.
- Voeg vervolgens 5 ml geautoclaveerd 1 M kaliumfosfaat (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2 en 1 ml 1 M MgSO4 toe aan de agaroplossing. Al deze oplossingen worden afzonderlijk gesteriliseerd door autoclaveren.
- Doseer 10 ml van de gemengde oplossing op een petrischaaltje van 6 cm. Leg deze borden met deksels twee dagen op een bankje bij RT en leg ze vervolgens op natte papieren handdoekjes in plastic bij RT tot gebruik. Deze platen kunnen tot 10 dagen worden gebruikt.
- Om chemotaxistestbuffer te maken (stap 5.4.), meng 5 ml 1 M kaliumfosfaat (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 en 993 ml ddH2O. Steriliseer al deze oplossingen afzonderlijk door autoclaveren.
- Om een 40 ml CS/US-mengseloplossing (1% waterig 1-propanol en HCl [pH 4,0]) (stap 3.1. en stap 4.1. te maken), voegt u 0,4 ml absolute 1-propanol en 4 μL 5 M HCl (0,1 mM bij eindconcentratie) toe aan 39,6 ml ddH2O. Houd de oplossing op RT.
- Om ddH2O te maken, behandelt u kraanwater 2x met waterzuiveringssystemen (zie materiaaltabel).
- Bereid een vloeibare cultuur (OD600 = ~0,7) van Escherichia coli OP50 door een verse kolonie met een tandenstoker in 10 ml LB medium te inenten en gedurende 7-8 uur bij 37 °C te broeden. Bacteriën die voor een langere periode worden gekweekt, kunnen de uitkomst van conditionering beïnvloeden, misschien als gevolg van secundaire metabolieten.
2. Bereiding van gesynchroniseerde C. Elegans
- Gebruik standaardmethoden26 om dieren te kweken op NGM-platen van 6 cm (stap 1.1.). NGM-platen worden bereid door 0,2 ml van een E. coli OP50 vloeibare cultuur in LB-medium te verspreiden (zie stap 1.9.) en te broeden bij RT gedurende niet meer dan 24 uur (oude bacteriën kunnen de uitkomst van conditionering beïnvloeden).
OPMERKING: C. elegans leren en geheugen zijn extreem gevoelig voor mechanische, chemische en temperatuurspanningen. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om dieren te kweken, alle reagentia inclusief water te onderhouden en alle testen uit te voeren bij RT tussen 17 °C en 20 °C. Fysieke en mechanische stimulatie zoals vortexing, ruw pipetteren en centrifugatie moeten worden vermeden. Verse 1-propanol moet om de 3 maanden het langst worden gebruikt om een onbekende reden. Belangrijk is dat dieren moeten worden gecultiveerd met veel voedsel, omdat honger de uitkomst van conditionering ernstig kan beïnvloeden. - Pluk en plaats op dag 1 vijf goed gevoede gravid-dieren (leg meer gemuteerde dieren die langzaam eieren leggen) op elk van de vier 6 cm NGM-platen met een platina wormenplukker en laat ze ~ 50 eieren leggen gedurende 3 uur bij RT om een gesynchroniseerde populatie volwassen dieren te verkrijgen. Stop het leggen van eieren door ouderdieren van de borden te verwijderen met een platina wormenplukker.
OPMERKING: Gezaaide platen moeten op RT worden gehouden om stress voor de dieren te minimaliseren. - Cultiveer de dieren bij RT gedurende ongeveer 5 dagen, wat de tijd is die nodig is voor dieren om hun volwassen volwassen stadium te bereiken, niet het jongvolwassen stadium.
OPMERKING: De teeltperiode tussen 4,5 dagen en 5,5 dagen moet worden aangepast afhankelijk van de omstandigheden, omdat jongere volwassen dieren gevoeliger zijn voor de chemicaliën die worden gebruikt voor conditionering dan volwassen volwassen dieren (aanvullende figuur 1). Na conditionering kunnen jongere volwassen dieren lagere chemotaxisindex (C.I.) waarden vertonen. - Verzamel ~200 volwassen dieren in een dierenverzamelaar (zie stap 1.4.) door elke plaat te wassen met 1 ml 0,25% waterige gelatine (stap 1.4.) Deze waterige gelatine voorkomt hechting van de dieren aan het oppervlak van kunststoffen zoals pipetpunten.
- Was de dieren in de collector met ddH2O (stap 1.8.) door de collector heel voorzichtig op en neer te bewegen 2x in ~10 ml ddH2O. Herhaal dit proces 2x meer (3x in totaal) met ~10 ml ddH2O per stuk om bacteriële besmetting te voorkomen.
OPMERKING: Bacteriële besmetting heeft ernstige invloed op de chemotaxis van dieren.
3. Massatraining voor kortdurend associatief leren en geheugen
OPMERKING: Zie figuur 1 voor de massale trainingsworkflow.
- Dompel de dierenverzamelaar met ~200 dieren voorzichtig onder in 40 ml van een mengsel van 1% 1-propanol en HCl (pH 4,0 na menging met 1-propanol; zie stap 1.7.) in een kristalliserende schaal gedurende ~1 s.
OPMERKING: Voor de controledieren, doe hetzelfde, maar dip alleen in 1% waterige 1-propanol. Het zou beter zijn om dieren met HCl (pH 4,0) alleen als een andere controle te behandelen. - Was de dieren in de collector door de collector heel voorzichtig 1x in 10 ml ddH2O onder te dompelen in een putje van een 6-well weefselkweekplaat.
OPMERKING: Deze wasstap moet zeer zacht zijn en slechts 1x worden gedaan, omdat uitgebreid wassen het leren kan voorkomen. - Herhaal stap 3.1. en 3.2. 10x zonder onderbreking (inter-trial interval [ITI], 0 min).
OPMERKING: Gebruik elke keer verse ddH2O bij RT. - Plaats de collector op een E. coli OP50 gazon op een 6 cm NGM plaat gedurende 10 min bij RT zodat de dieren kunnen rusten.
- Was de dieren in de collector met ddH2O door de collector heel voorzichtig op en neer te bewegen 2x in ~10 ml ddH2O. Herhaal dit proces 2x meer (3x in totaal) met ~10 ml ddH2O per stuk om bacteriële besmetting te voorkomen.
- Ga verder met de chemotaxistest zoals hieronder beschreven (stap 5).
4. Gespreide training voor langdurig associatief leren en geheugen
OPMERKING: Zie figuur 2 voor de workflow voor gespreide training.
- Dompel een dierenverzamelaar met ~200 dieren voorzichtig onder in 40 ml van een mengsel van 1% 1-propanol en HCl (pH 4,0 na menging met 1-propanol; zie stap 1.7.) in een kristalliserende schaal gedurende ~1,0 s.
OPMERKING: Doe hetzelfde met 1% waterig 1-propanol alleen als controle. Het zou beter zijn om dieren met HCl (pH 4,0) alleen als een andere controle te behandelen. - Was de dieren in de collector door de collector heel kort 1x onder te dompelen in 10 ml ddH2O in een putje van een 6-well weefselkweekplaat.
OPMERKING: Dit wassen moet zeer kort zijn, omdat uitgebreid wassen het leren kan voorkomen. - Plaats de collector op een E. coli OP50 gazon op een NGM agar plaat in een petrischaaltje van 6 cm (in diameter) gedurende 10 minuten bij RT zodat de dieren kunnen rusten.
OPMERKING: Dit rusten gedurende 10 minuten als ITI is cruciaal voor de dieren om herinneringen te consolideren voor de vorming van LTM. - Herhaal stap 4.1.-4.3. 10x.
- Was de dieren in de collector met ddH2O door de collector heel voorzichtig op en neer te bewegen 2x in ~10 ml ddH2O, die wordt gehouden op RT. Herhaal dit proces 2x meer (3x in totaal) met ~10 ml ddH2O elk om bacteriële besmetting te voorkomen.
- Ga verder met de chemotaxistest zoals hieronder beschreven (stap 5.).
5. Chemotaxis-test
- Bereid agarplaten voor chemotaxistest in plastic petrischalen van 6 cm (zie stap 1.5.).
- Breng dieren over in de collector (stap 2.5.), die op een plat oppervlak van een plastic petrischaaldeksel wordt geplaatst, naar een microcentrifugebuis van 2 ml met 1 ml waterige gelatine met behulp van een afgezaagde pipetpunt met een opening van >1 mm (binnendiameter).
OPMERKING: Het is belangrijk om een afgezaagde pipetpunt te gebruiken om de schuifspanning bij dieren te minimaliseren. - Verwijder het supernatant uit de buis nadat de dieren zich gedurende ~ 1 minuut door de zwaartekracht op de bodem van de buis hebben gevestigd (niet centrifugeren).
- Resuspenseer de dieren voorzichtig in 1 ml chemotaxis-testbuffer (zie stap 1.6.) en laat ze door de zwaartekracht gedurende ~ 1 minuut op de bodem van de buis zakken (niet centrifugeren). Verwijder zoveel mogelijk supernatant door te pipetteren.
- Spot ondertussen diagonaal 4 μL elk van 5% waterig 1-propanol op twee plaatsen en spot 4 μL elk van ddH2O op twee andere plaatsen op dezelfde manier, zoals weergegeven in figuur 3A. Voor chemotaxistest van mutanten die een lagere gevoeligheid voor 1-propanol hebben, spot hogere concentraties waterig 1-propanol die resulteren in ~ 0,6 chemotaxisindex (C.I.) waarden van naïeve mutanten, zoals weergegeven in aanvullende tabel 1.
OPMERKING: Het is belangrijk om de spotting procedures zo snel mogelijk te voltooien. Spot 5% waterig 1-propanol omdat 1% waterig 1-propanol te zwak is om dieren aan te trekken in de chemotaxistest. Gebruik daarentegen 1% waterig 1-propanol voor conditionering, aangezien dieren die worden behandeld met hogere concentraties waterig 1-propanol dan 1% lagere C.I.-waarden vertonen. - Spot 6 μL-porties van de dierlijke suspensie in chemotaxis-assaybuffer (stap 5.4.) met ~60 dieren in het midden van drie platen voor chemotaxis-assay met behulp van een afgezaagde pipetpunt met een opening van ~ 1,0 mm (binnendiameter). Verwijder vloeistof zoveel mogelijk met een laboratoriumweefsel lont zonder de dieren aan te raken en plaats een deksel op de plaat.
OPMERKING: Het is belangrijk om deze procedures zo snel mogelijk te voltooien. - Laat de dieren 10 minuten vrij bewegen op de plaat bij RT en breng de plaat vervolgens gedurende 3 minuten over in een glazen petrischaal op ijs om chemotaxis te stoppen. Bewaar het bord vervolgens in een koelkast totdat u het aantal dieren op het bord telt.
- Tel het aantal dieren in vier secties, behalve die in de middelste cirkel, onder een stereomicroscoop en bereken de chemotaxis-index (C.I.) met behulp van de vergelijking in figuur 3B. Bereken op basis van de C.I.-waarden de leerindexwaarden (L.I.) als het verschil tussen de C.I.-waarde van de referentiedieren en de C.I.-waarde van de geconditioneerde dieren (L.I. = C.I.-referentie- C.I.-geconditioneerd).
OPMERKING: De C.I.-waarde van de referentiedieren (C.I.-referentie) is de gemiddelde waarde van de C.I.-waarden van dieren die uitsluitend met 1% waterig 1-propanol zijn geconditioneerd.
Representative Results
C. elegans werd geconditioneerd door massale training om kortdurend aversief associatief geheugen te vormen door 1% waterig 1-propanol en HCl (pH 4,0) te koppelen als respectievelijk de CS en de VS. Volgens het hierboven beschreven protocol werden gesynchroniseerde dieren gedurende 5 dagen op een bank gekweekt bij een RT van 18 °C en werden ze zeer voorzichtig 2x gewassen met ddH2O bij een RT van 18 °C. Vervolgens werden de dieren geconditioneerd met een mengsel van 1% waterig 1-propanol en HCl (pH 4,0) gedurende 1 s. We trainden ook dieren met alleen ddH2O, alleen 1% waterig 1-propanol en HCl (pH 4,0) alleen als referenties. Na de conditionering werden de dieren 1x gewassen met ddH2O. We herhaalden de conditionering 10x zonder onderbreking (geen ITI's). Succesvolle conditionering werd bereikt door de procedure meer dan 7x tot 10x te herhalen. Conditionering van meer dan 10x resulteerde in minder efficiënt leren21. Na de training rustten de dieren 10 minuten op bacterieel voedsel bij RT (18 °C). Na te zijn gewassen met ddH2O 3x, werden de dieren overgebracht naar een microcentrifugebuis door 0,25% waterige gelatine te suspenseren en door de zwaartekracht naar de bodem te zakken. Nadat het supernatant zoveel mogelijk was verwijderd, werden de dieren voorzichtig geresuspendeerd in chemotaxis-testbuffer en vervolgens door de zwaartekracht naar de bodem van de buis laten zakken.
Na het verwijderen van zoveel mogelijk supernatant, werd de dierlijke suspensie gespot op de middelste cirkel van een chemotaxis-testplaat, die op een RT van 18 ° C werd gehouden, en vervolgens mochten dieren gedurende 10 minuten vrij op de plaat bewegen bij een RT van 18 ° C. C.I.-waarden werden berekend met behulp van de vergelijking in figuur 3B. Zoals te zien is in figuur 4A, werden dieren die geconditioneerd waren met het mengsel van 1% 1-propanol en HCl niet langer aangetrokken tot 5% 1-propanol gespot op agarplaten voor chemotaxistest, terwijl naïeve en referentiedieren op dezelfde manier werden aangetrokken door 5% 1-propanol. Na de massale training (stap 3.) werd het geheugen niet meer waargenomen binnen 3 h20. Bovendien was het geheugen gevormd door de massale training gevoelig voor koude schok20. Deze resultaten tonen aan dat C. elegans met succes aversieve STM hebben gevormd door massale training.
Dieren werden ook geconditioneerd door 10x gespreide training met een ITI van 10 minuten tussen de trainingsstappen (stap 4.). Tijdens de ITI werd de collector met dieren op een bacterieel gazon geplaatst op een 6 cm NGM plaat bij een RT van 18 °C. Dieren die geconditioneerd waren door de gespreide training met een mengsel van 1% waterig 1-propanol en HCl (pH 4,0) werden niet langer aangetrokken door 5% 1-propanol in vergelijking met dieren die werden behandeld met alleen 1% 1-propanol, alleen HCl (pH 4,0) of alleen ddH2O (figuur 4B). Na de gespreide training behielden de dieren het geheugen meer dan 12 uur 20,21. Bovendien vormde het geheugen zich niet wanneer dieren werden behandeld met translatie- of transcriptieremmers en was het bestand tegen koude shock 20,21. Daarom hebben C. elegans met succes aversieve LTM gevormd door middel van spaced training.
We onderzochten ook de effecten van mutaties in "leer- en geheugengenen" op de vorming van STM en LTM. Het crh-1-gen codeert voor de alomtegenwoordige transcriptiefactor cAMP-response element-binding protein (CREB), glr-1 en nmr-1 coderen respectievelijk α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)-type en N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-type glutamaatreceptorsubeenheden, en stau-1 codeert voor het dubbelstrengs RNA-bindende eiwit Staufen isoform. Deze genen spelen een essentiële rol in de klassieke conditionering bij C. elegans, Drosophila, Aplysia en muizen. Met behulp van een mengsel van 1% waterig 1-propanol en HCl (pH 4,0) was de vorming van STM en LTM afhankelijk van alle genen (figuren 5A,B).
Figuur 1: Experimenteel schema van massale training. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Experimenteel schema van gespreide training. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Chemotaxis assay en chemotaxis index. (A) Schematische weergave van een chemotaxis assay plaat. Petrischalen (6 cm in diameter) werden gescheiden in vier gebieden zoals afgebeeld, en 4 μL elk van 5% waterig 1-propanol of ddH2O werden diagonaal gespot op twee plaatsen elk, 2 cm verwijderd van het midden. (B) Chemotaxis-indexwaarden werden berekend op basis van de aangegeven vergelijking door het aantal dieren in de gebieden "a" en "b" na voltooiing van de chemotaxis te tellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Chemotaxis indexwaarden van dieren geconditioneerd met chemicaliën. Gesynchroniseerde wild-type N2-dieren werden geconditioneerd met chemicaliën aangegeven door (A) massed training 10x of (B) spaced training 10x. Stroomdiagrammen van de gebruikte massed en spaced trainingsprotocollen zijn weergegeven in respectievelijk figuur 1 en figuur 2. Na de conditionering konden de dieren gedurende 10 minuten bewegen op een agarplaat van 6 cm voor chemotaxistest bij een RT van 18 °C. C.I.-waarden werden berekend met behulp van de vergelijking in figuur 3B. De gegevens voor dit cijfer zijn opgenomen in aanvullende tabel 1. Gegevens van de naïeve dieren werden in beide figuurpanelen herhaald. Staafdiagram toont het 1e kwartiel, de mediaan en het 3e kwartiel. Sterretjes (*P < 0,05) geven statistisch significante verschillen aan die worden bepaald door eenrichtings-ANOVA gevolgd door dunnett's meervoudige vergelijkingstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Leren van indexwaarden van geconditioneerde mutante dieren. Gesynchroniseerde wildtype N2 en gemuteerde dieren werden geconditioneerd met een mengsel van 1% waterige 1-propanol en HCl (pH 4,0) door (A) massale training 10x of (B) gespreide training 10x. Stroomdiagrammen van de gebruikte massed en spaced trainingsprotocollen zijn weergegeven in respectievelijk figuur 1 en figuur 2. Na de conditionering konden de dieren gedurende 10 minuten bewegen op een agarplaat van 6 cm voor chemotaxistest bij een RT van 18 °C. De gegevens voor dit cijfer zijn opgenomen in aanvullende tabel 2. Staafdiagram toont het 1e kwartiel, de mediaan en het 3e kwartiel. Sterretjes (*P < 0,05) geven statistisch significante verschillen aan die worden bepaald door eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Jongvolwassen dieren zijn gevoelig voor chemische behandeling. Dag 4 en dag 5 wild-type N2 dieren na het uitkomen werden massaal getraind 10x met HCl, pH 4,0, zonder onderbreking en werden vervolgens getest op chemotaxis tot 5% waterig 1-propanol. Staven zijn middelen ± S.E.M. (n = 19). Sterretjes (*P < 0,05) duiden op statistisch significante verschillen bepaald door tweerichtings-ANOVA gevolgd door de Tukey-Kramer post-hoc test. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Gegevens die overeenkomen met figuur 4. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Gegevens die overeenkomen met figuur 5. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
In deze studie werden alle reagentia gemiddeld op een RT van ~ 18 ° C gehouden en werden de dieren op een bank bij de RT gekweekt om stress voor de dieren te voorkomen. Bovendien werden alle experimentele procedures uitgevoerd bij de RT. De dieren werden aanvankelijk gekweekt in een broedmachine bij 20 °C en vervolgens geconditioneerd op een bank bij ~24 °C met behulp van reagentia bij de RT. Onder deze omstandigheden waren de uitkomsten van de conditionering zeer variabel. Bij de lage RT groeit C. elegans langzaam en moeten ze langer dan bij 20 °C worden gekweekt totdat de dieren het volwassenheidsstadium bereiken, omdat jongere volwassen dieren gevoeliger zijn voor de chemicaliën die worden gebruikt voor conditionering dan volwassen volwassen dieren en lagere C.I.-waarden kunnen vertonen.
De meest kritische stap voor een succesvolle conditionering is het wassen van dieren met ddH2O onmiddellijk na elke chemische behandeling. Daarom moeten mechanische en temperatuurspanningen worden geminimaliseerd door afgezaagde pipetpunten te gebruiken, reagentia op RT te houden en de dieren heel voorzichtig te wassen door de dierencollector heel langzaam op en neer te bewegen in ddH2O. Grondig wassen van de dieren elke keer na conditionering kan het leren en het geheugen beïnvloeden. De omstandigheden van de chemotaxis-testplaten hebben ook een ernstige invloed op de uitkomsten. Te droge of te natte platen voorkomen een soepele voortbeweging van de dieren. Platen werden bereid zoals beschreven in stap 1.; een goede plaat is er een waarvoor de 4 μL vlekken van ddH2O of 5% waterig 1-propanol in ongeveer 5 minuten na het spotten volledig door de agar worden geabsorbeerd. Zoals hierboven beschreven, zijn dierleeftijden ook van cruciaal belang voor succesvolle conditionering. Jongvolwassen dieren zijn gevoelig voor mechanische en chemische behandeling, wat resulteert in variabele uitkomsten, hoewel zeer oude dieren mogelijk ook niet geschikt zijn voor conditionering.
De houdbaarheid van 1-propanol is afhankelijk van merken en partijen en is minder dan 3 maanden bij RT. Wanneer de C.I.-waarden van naïeve dieren slechter worden, wordt aanbevolen om verse 1-propanol te gebruiken voor de conditionering en chemotaxistest.
De vorming van geheugen door massale training werd niet beïnvloed door de behandeling van dieren met translatieremmers (cycloheximide en anisomycine) en een transcriptieremmer (actinomycine D), terwijl de vorming van geheugen door de gespreide training duidelijk werd geremd door de remmers20,21. Bovendien verviel het eerste geheugen door koude shock, terwijl het laatste langer werd bewaard dan het eerste en bestand was tegen koude schokken. Deze resultaten tonen aan dat de eerste STM is en de laatste LTM, respectievelijk 20,21. Het geheugen gevormd door de massale training kan echter bestaan uit STM en middellange termijn (middellange termijn) geheugen, aangezien STM zwak afhankelijk is van de CREB transcriptiefactor (figuur 5A). Dit komt overeen met het resultaat dat de STM langer dan 1 h20,21 werd vastgehouden. De vorming van zowel STM als LTM is sterk afhankelijk van nmr-1, dat alleen tot expressie komt in zes paren neuronen (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG en PVC) in C. elegans27,28. In deze neuronen kunnen NMDA-receptoren daarom fungeren als een moleculaire toevalsdetector van 1% waterige 1-propanol- en HCl-signalen (pH 4,0) voor synaptische plasticiteit, waarbij de synaptische versterking die nodig is voor zowel STM als LTM het gevolg kan zijn van toevallige afvuren van pre- en post-synaptische neuronen 29,30,31,32,33. Daarom kan het aversieve associatieve geheugen zich vormen tussen de interneuronen.
De in deze studie beschreven methoden moeten toepasbaar zijn voor appetitief olfactorisch leren en associatief geheugen op korte en lange termijn met behulp van 1-nonanol als cs en kaliumchloride als de US21. Het is interessant om de neuronale circuits te vergelijken die betrokken zijn bij de vorming van appetitieve en aversieve herinneringen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We zijn Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang en Hitomi Ohtaki dankbaar voor hun technische assistentie en commentaar op het manuscript. Stammen werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door het NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dit werk werd ondersteund door financiering van Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
| 10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
| 0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
| 1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
| 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
| 50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
| 6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
| Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
| Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
| Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
| C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
| Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
| Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
| Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
| Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
| Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
| Incubator | SANYO | MIR-553 | |
| Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
| Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
| Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
| Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
| Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
| Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
| Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
| Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
| Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
| Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
| 1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
| Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tooth picks | |||
| Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
| Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
| Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
| Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
- Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
- Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
- Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
- Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
- Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
- Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
- Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
- Bargmann, C. I.
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Cho, C. E., Brueggemann, C., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
- Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
- Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
- Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
- Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
- Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
- Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
- Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
- Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
- Brenner, S.
- Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
- Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
- Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
- Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
- Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
- Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).
