Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة لحقن أجنة القراد. حقن الأجنة هو الأسلوب المفضل للتلاعب الجيني لتوليد خطوط معدلة وراثيا.
Abstract
يمكن للقراد أن ينقل العديد من مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والأولية ، وبالتالي يعتبر ناقلات ذات أهمية طبية وبيطرية. على الرغم من العبء المتزايد للأمراض التي تنقلها القراد ، فقد تخلفت الأبحاث على القراد عن ناقلات الأمراض الحشرية بسبب التحديات في تطبيق أدوات التحول الجيني للدراسات الوظيفية على البيولوجيا الفريدة للقراد. تحظى التدخلات الجينية بالاهتمام للحد من الأمراض التي ينقلها البعوض. ومع ذلك ، فإن تطوير مثل هذه التدخلات يتطلب تحولا مستقرا للخط الجرثومي عن طريق حقن الأجنة. مثل هذه التقنية لحقن الجنين غير موجودة في chelicerates ، بما في ذلك القراد. هناك عدة عوامل ، مثل طبقة الشمع السميكة الخارجية على أجنة القراد ، والمشيمية الصلبة ، والضغط العالي داخل البيضاوي ، هي بعض العقبات التي منعت سابقا تطور بروتوكول حقن الأجنة في القراد. لقد تغلب العمل الحالي على هذه العقبات ، ويتم وصف تقنية حقن الأجنة للقراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis ، هنا. يمكن استخدام هذه التقنية لتوصيل المكونات ، مثل CRISPR / Cas9 ، لتحويلات الخط الجرثومي المستقرة.
Introduction
القراد هي ناقلات ذات أهمية طبية وبيطرية ، قادرة على نقل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والبروتوزوان والديدان الخيطية1،2. في شرق الولايات المتحدة ، يعد القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis ، ناقلا مهما لمرض لايم (LD) الممرض ، اللولبي Borrelia burgdorferi. يتم الإبلاغ عن أكثر من 400000 حالة من LD كل عام في الولايات المتحدة ، مما يجعلها أكبر الأمراض المعدية المنقولة بالنواقل في الولايات المتحدة1. بالإضافة إلى B. burgdorferi ، تنتقل ستة كائنات دقيقة أخرى بواسطة I. scapularis - بما في ذلك أربعة بكتيريا (Anaplasma phagocytophilum و B. mayonii و B. miyamotoi و Ehrlichia muris eauclarensis) ، وطفيلي أولي واحد (Babesia microti) ، وفيروس واحد (فيروس Powassan) ، مما يجعل هذا النوع من القراد مصدر قلق كبيرللصحة العامة 3 . في حين أن الأمراض التي تنقلها القراد أصبحت أكثر انتشارا في السنوات الأخيرة ، فقد تراجعت الأبحاث على القراد عن ناقلات المفصليات الأخرى ، مثل البعوض ، بسبب البيولوجيا الفريدة للقراد والتحديات المرتبطة بتطبيق الأدوات الجينومية الجينية والوظيفية 4,5.
وقد جعلت تقنيات تحرير الجينات، وخاصة كريسبر/كاس9، الآن دراسات الجينوم الوظيفي ممكنة في الكائنات غير النموذجية. لإنشاء طفرات وراثية في الكائن الحي ، يظل حقن الجنين هو الطريقة المفضلة لتقديم تركيبات لتغيير الخط الجرثومي6،7،8،9. ومع ذلك ، حتى وقت قريب4 ، كان بيض القراد يعتبر صعبا للغاية أو حتى مستحيلا للحقن دون قتل الجنين10,11. كانت طبقة الشمع السميكة على البيض ، والمشيمية الصلبة ، والضغط العالي داخل البيضاوي بعض العقبات الرئيسية التي منعت حقن الجنين في القراد. يودع الكتفي البالغ الذي يتغذى على الدم مخلبا واحدا يصل إلى 2000 بيضة12 على مدار 3-4 أسابيع (حوالي 100 بيضة / يوم). يتم وضع البيض منفردا ، ويتم تغليف كل بيضة بالشمع الذي يفرزه نتوءات أو "قرون" عضو Gené الغدي13،14،15 من الأم. يحمي هذا الشمع البيض من الجفاف ويحتوي على مركبات مضادة للميكروبات15. لحقن بيض القراد بنجاح ، من المهم إزالة طبقة الشمع ، وتليين المشيم ، وتجفيف البيض لتقليل الضغط داخل البيضاوي حتى لا يؤدي الحقن إلى إتلاف البويضة بشكل لا رجعة فيه. فهم الأهمية الحاسمة لحقن الأجنة لنجاح تحويل الخط الجرثومي ، تم تطوير بروتوكول ل I. scapularis ، والذي يمكن استخدامه لتقديم بنية CRISPR / Cas9 وتوليد طفرات جرثومية مستقرة4. بالإضافة إلى مساهمته في أبحاث I. scapularis ، يمكن أيضا تحسين هذا البروتوكول لأنواع القراد الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء البالغين Ixodes scapularis إما من جامعة ولاية أوكلاهوما (OSU) أو تربيتهم في جامعة نيفادا ، رينو (UNR) (بروتوكول IACUC # 21-001-1118).
1. إعداد القراد الإناث لجمع الأجنة
ملاحظة: لجمع البيض من العمر المناسب ، من المهم مزامنة وضع البيض. على الرغم من أن إشارات وضع البيض في القراد لا تزال غير واضحة ، في ظل الظروف الحشرية القياسية (درجة حرارة 27 درجة مئوية ورطوبة نسبية >90٪ (RH)) ، تبدأ إناث I. scapularis في وضع البيض بعد حوالي 8 أيام من انفصال المضيف. يمكن إطالة هذا الجدول الزمني عن طريق تخزين الإناث المليئة عند 4 درجات مئوية. لقد قمنا بتخزين الإناث التي تتغذى على الدم في 4 درجات مئوية حتى 8 أسابيع دون أي تأثير سلبي على وضع البيض. قد تحتاج هذه الشروط إلى تعديل لكل حشرة.
- قم بتخزين جميع الإناث الممتلئة في درجة حرارة 4 درجات مئوية مع رطوبة نسبية >90٪ في صندوق بلاستيكي سعة 6 لتر مبطن بورق ترشيح رطب حتى يتم استخدامه للحقن المجهري.
- قبل أسبوع من الحقن ، انقل الإناث من 4 درجات مئوية إلى حاضنة 27 درجة مئوية لبدء وضع البيض.
- عندما تبدأ الإناث في وضع البيض (بعد 3-4 أيام من نقلها إلى 27 درجة مئوية) ، قم بإزالة أي بيض باستخدام فرشاة رسم ذات رؤوس دقيقة وقم بإعداد الإناث لاستئصال عضو Gené (غدة الشمع).
ملاحظة: يمتد عضو Gené من المنطقة الواقعة بين البلغم والرأس (القاعدة الظهرية لأجزاء الفم) ، وتنحني أجزاء الفم على سطح الجسم البطني (موازية للسطح) ، ويغلف عضو Gene الممتد البيض بمجرد وضع البيض (الشكل 1). البيض الذي يتم وضعه قبل إزالة عضو Gené أو إفراغه من الشمع سيكون له طلاء شمعي وغير مناسب للحقن ويجب التخلص منه. - لإزالة أو تفريغ عضو Gené ، استخدم الطين لوضع الأنثى المحتقنة على شريحة زجاجية تحت مجهر موجه بحيث تكون أجزاء الفم مرئية على الجانبين البطني والظهري (الشكل 1B ، C).
- قم بوخز المنطقة الواقعة بين البلغم وأجزاء الفم بعناية باستخدام ملقط دقيق وإبر تنغستن مصنوعة في المختبر باستخدام سلك التنغستن باتباع بروتوكول16 منشور مسبقا (يمكن أيضا شراء الإبر تجاريا ، وإرفاقها بمسبار تشريح دقيق ، انظر جدول المواد).
- العمل في الداخل بإبرة التنغستن ، اسحب غدة الشمع للخارج (الشكل 1D ، E). قد يستغرق الأمر عدة دقائق لإزالة الغدة. امسح أي إفراز شمعي سائل باستخدام مناديل المختبر.
ملاحظة: يمكن أيضا إزالة الغدة من الجانب البطني أسفل أجزاء الفم مباشرة. عن طريق الوصول إلى الخلف نحو scutum بإبرة وملقط. كما أن تطبيق غراء السيليكون حول أجزاء الفم يمنع انقلاب الأعضاء في جين ويمكن استخدامه بدلا من إزالة الشمع أو إفراغه (اتصال شخصي مع الدكتور لاديسلاف سيمو ، INRAE ، فرنسا). لن تبقى القراد المحتقنة على شريط على الوجهين. يساعد استخدام الطين "لقماط" القراد على إبقائها في مكانها أثناء التلاعب. استخدم ملقط لعقد إبرة القراد والتنغستن للتشريح. الجزء البطني أسهل في الاختراق بإبرة ويفضله المؤلفون.
- لتفريغ الغدة، رتب قراد الجاذبية كما هو مذكور في الخطوة 1.4. ثقب بعناية المنطقة خلف أجزاء الفم على الجانب الظهري والضغط على الجانب البطني باستخدام ملقط.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، ليس من الضروري إزالة غدة الشمع. إفراغ غدة الشمع سيستمر لعدة أيام. الإناث التي تضع البيض لديها منطقة بيضاء حول أجزاء الفم تشير إلى موقع غدة الشمع ويمكن استخدامها كمرجع.- ضع حافة مناديل معملية خالية من النسالة وأزل الشمع السائل الخارج من موقع البزل. تأكد من تجنب إفراز الدملمف ، وهو سائل صاف مقارنة بالشمع اللزج المصفر قليلا. قد يستغرق الأمر من 5 إلى 10 دقائق حتى تتم إزالة معظم الشمع.
- بعد التلاعب ، ضع الإناث في حاضنة عند 27 درجة مئوية (>90٪ رطوبة نسبية) واسمح لها بالتعافي لمدة 1-2 أيام.
ملاحظة: عادة ما تستغرق الإناث المعالجة 1-2 أيام للتعافي والبدء في وضع البيض مرة أخرى. - عندما تبدأ الإناث في وضع البيض مرة أخرى ، استخدم فرشاة رسم دقيقة لجمع البيض المترسب حديثا (0-18 ساعة بعد وضع البيض) ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
ملاحظة: في حالة استخدام بيض من نفس الأنثى بمرور الوقت ، يجب تكرار هذا الإجراء بعد 4-5 أيام من وضع البيض إذا لم تتم إزالة الغدد.
2. علاج الجنين للحقن المجهرية
- أضف ~ 200 ميكرولتر (أو حجم كاف لتغطية البيض ، اعتمادا على عدد البيض) من 5٪ (الوزن / الحجم) كلوريد البنزالكونيوم / الماء (انظر جدول المواد) في الأنبوب الذي يحتوي على بيض عمره 0-18 ساعة. حرك البيض برفق باستخدام فرشاة الرسم لمدة 5 دقائق لتجنب استقرار البيض في قاع الأنبوب (لمزيد من التفاصيل ، انظر شارما وآخرون 4). قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة ، تاركا البيض خلفها في أنبوب.
تنبيه: كلوريد البنزالكونيوم تآكل الجلد والعينين ، وارتداء القفازات وحماية العين. - أضف ~ 200 ميكرولتر من الماء المقطر (DI) إلى الأنبوب الذي يحتوي على البيض ، وقم بالدوران باستخدام فرشاة الرسم ، وقم بإزالة الماء من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام micropipette. كرر الغسيل بماء DI مرة أخرى.
- بعد الغسيل بماء DI ، أضف ~ 200 ميكرولتر من 5٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم (NaCl) وقم بتحريكه برفق باستخدام فرشاة الرسم لمدة 5 دقائق. أخرج المحلول من الأنبوب بعد 5 دقائق واغسل البيض مرتين بماء DI.
- أضف ~ 100 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 1٪ (وزن / حجم) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على البيض. احتفظ بالبيض في محلول كلوريد الصوديوم 1٪ (وزن / حجم) حتى يتم استخدامه للحقن.
- بدء الحقن المجهري بعد حوالي ساعة. يساعد هذا الجدول الزمني في تجفيف البيض بشكل صحيح ويمنعها من الانفجار.
ملاحظة: يمكن حفظ البيض في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 1٪ (وزن / حجم) لمدة 7-8 ساعات دون التأثير بشكل كبير على البقاء على قيد الحياة. إذا كان من الصعب حقن البيض أو انفجاره ، فلن يتم تجفيف البيض بدرجة كافية ويمكن معالجته مرة أخرى بنسبة 5٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم لمدة 5 دقائق إضافية.
3. إعداد إبر الحقن
- أدخل زجاجا شعريا من سيليكات الألومنيوم (مع خيوط ، انظر جدول المواد) في مجتذب الإبرة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- اضبط مجتذب الإبرة على الإعدادات التالية: الحرارة: 575 ، السحب: 20 ، السرعة: 50 ، الوقت: 200 ، والضغط: 700.
- قم بتنشيط وظيفة السحب لمجتذب الإبرة وكرر العملية للحصول على إبر إضافية.
- قم بتخزين الإبر المسحوبة عن طريق لصقها في خطوط من طين العارض في طبق بتري نظيف.
- قم بتحميل الإبرة بخليط الحقن باستخدام طرف اللودر الصغير (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يوضح الشكل 2 مقارنة الإبر المستخدمة في حقن جنين القراد والبعوض.
4. إعداد الشريحة للحقن المجهري
- باستخدام شريط على الوجهين ، قم بلصق شريحتين مجهريتين زجاجيتين معا ، تاركا فجوة تبلغ حوالي 0.5 سم لدعم محاذاة البيض ومنعها من التدحرج أثناء الحقن (الشكل 3 أ).
- ضع قطعة من ضمادة الفيلم الشفافة (انظر جدول المواد) على الشريط على الوجهين في الفجوة بين الشرائح. تأكد من محاذاة خلع الملابس الفيلم تماما مع الفجوة.
5. الحقن المجهرية للجنين
- قم بمحاذاة 8-10 بيضات في المرة الواحدة على إعداد الشريحة (أعلاه) باستخدام فرشاة طلاء أحادية الشعر.
ملاحظة: البيض المحاذي للمحور الأطول العمودي (الشكل 3B) على حافة الشريحة أسهل في الحقن من البيض الذي يتم محاذاة محوره الطولي بالتوازي مع الحافة (الشكل 3C). يمكن للبيض في الاتجاه العمودي (الشكل 3 ب) أن يتحمل الحقن بشكل أفضل مما يؤدي إلى زيادة البقاء على قيد الحياة. - ضع الشريحة مع البيض المحاذي على مرحلة المجهر المركب. استخدم قطعة من المناديل الخالية من النسالة لإزالة محلول كلوريد الصوديوم 1٪ الذي يتم تخزينها فيه.
- قم بتوصيل إبرة الحقن المملوءة بحاقن دقيق متصل بمناور دقيق (انظر جدول المواد).
- افتح الإبرة عن طريق فركها برفق على سطح البويضة باستخدام إعداد الضغط العالي على الحاقن الدقيق (>5000 هيكتوباسكال).
- بعد فتح الإبرة ، قلل الضغط (1000-2500 هيكتوباسكال) للحاقن الدقيق اعتمادا على فتحة الإبرة.
ملاحظة: تتطلب الفتحة الصغيرة ضغطا أعلى نسبيا ، بينما تتطلب الفتحة الأكبر ضغطا أقل. هذا هو التحكم في حجم البناء المحقونة. اعتمادا على حجم فتحة الإبرة ، سيختلف حجم الحقن من 1-5 pL. - قم بحقن كل البيض الموجود على الشريحة بزاوية 10 درجات -15 درجة في أسرع وقت ممكن وانقل الشريحة على الفور إلى ظروف الرطوبة العالية في طبق بتري مبطن بورق رطب. بمجرد حقن البيض ، يبدأون في الجفاف.
ملاحظة: حقن عدد صغير من البويضات في وقت واحد يزيد من نجاح الحقن واحتمال البقاء على قيد الحياة. تسد الإبر بسبب ارتجاع الجنين. إذا كان الطرف لا يزال حادا ، لإزالة الإبر المسدودة ، انقل الإبرة إلى قطرة صغيرة من 1٪ كلوريد الصوديوم تضاف إلى حافة الشريحة. سيؤدي العمل الشعري إلى إزاحة السدادة الصغيرة. إذا كانت الإبرة حادة بالفعل ، فقم بتغييرها.
6. رعاية الأجنة بعد الحقن
- ضع الشريحة التي تحتوي على أجنة محقونة في طبق بتري كبير مبطن بورق ترشيح رطب.
ملاحظة: من الأهمية بمكان عدم إزعاج البيض لمدة 5-6 ساعات على الأقل. هذا يسمح لجرح الحقن بالإغلاق بشكل صحيح. قد ينفتح جرح الحقن عند تحريكه ، وقد يبدأ السيتوبلازم في الخروج ، مما يؤدي إلى نفوق البويضات. - بعد 5-6 ساعات ، أضف قطرة صغيرة من ماء DI إلى ضمادة الفيلم الشفافة مع الأجنة المحقونة المرفقة. باستخدام فرشاة الرسم ، قم بإزاحة البيض برفق. انقل البيض إلى طبق بتري صغير (10 سم) واغمره في ماء DI.
ملاحظة: تسمح ضمادة الفيلم بإزالة البيض بسهولة بعد الحقن. في اللحظة التي تضاف فيها قطرة ماء إلى ضمادة الفيلم ، سيبدأ البيض في التحرك مع الماء. - احتفظ بالبيض مغمورا في الماء وضع طبق بتري في صندوق بلاستيكي سعة 6 لتر في حاضنة عند 27 درجة مئوية ورطوبة نسبية >90٪.
- افحص البيض بانتظام ، يوميا في الأيام القليلة الأولى ، ثم كل 3-4 أيام حتى تبدأ اليرقات في الفقس.
ملاحظة: في حالة تلف عدد كبير من البيض أثناء الحقن المجهري ، فإن تصريف ماء DI برفق بعد أسبوع سيمنع نمو الفطريات على البيض الميت. - عندما تبدأ اليرقات في الفقس من الأجنة المحقونة (بعد 21-25 يوما من الحقن لإعداد المختبر الحالي) ، افحصها يوميا وانقل أي يرقات فقس إلى قوارير زجاجية مع شاشة في الأعلى. يمكن أن تفقس اليرقات تحت الماء والبقاء على قيد الحياة لمدة ~ 1-2 أسابيع.
- افحص اليرقات4 إذا تم حقن البيض ببنية قد تؤدي إلى نمط ظاهري مرئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم وصف بروتوكول حقن الأجنة الناجح ل I. scapularis في هذه المقالة. تم الاحتفاظ بالإناث التي تضع البيض في رطوبة عالية لتجنب جفاف البيض المشمع جزئيا. تمت إزالة طبقة الشمع لحقن أجنة القراد عن طريق استئصال عضو الجين (غدة الشمع) للأنثى الجاذبة (الشكل 1A-E). استخدمنا إبر زجاجية من سيليكات الألومنيوم ذات رقبة أقصر (الشكل 2). كان هذا الشكل مثاليا لحقن بيض القراد لأنه يمكن أن يتحمل الضغط بشكل أفضل من الإبرة الطويلة (المدببة) المستخدمة في حقن بيض الحشرات. يتطلب الشكل الكروي لبيض القراد منصة منزلقة خلف الكواليس (الشكل 3 أ) لتجنب دحرجة البيضة من الشريحة أثناء إدخال الإبرة. التطور الجنيني المبكر ل I. scapularis غير معروف ، لذا فإن توقيت وموقع تكوين الخلايا الجرثومية غير معروفين أيضا. لذلك ، اخترنا حقن البيض في وقت مبكر من التطور (12-18 ساعة) ووجدنا أن محاذاة المحور الأطول للبيضة بشكل عمودي على حافة الشريحة يؤدي إلى بقاء أعلى (الشكل 3 ب ، ج). باستخدام هذا البروتوكول ، تم حقن عدة آلاف من البيض. من هذه البويضات المحقونة ، نجا ما يصل إلى 8.5 ٪ ، وفقست اليرقات (الجدول 1). كان للبويضات المعالجة ولكن غير المحقونة بقاء أعلى بكثير (تصل إلى 70٪) ، مما يشير إلى أن التحسن في الحقن (إما عن طريق التوقيت أو موقع الحقن أو الإبرة) قد يحسن بقاء البويضة. تم تطوير هذا البروتوكول لحقن البويضات في وقت مبكر من التطور الجنيني (12-18 ساعة) ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا للبيض حتى عمر 10 أيام مع علاج أطول باستخدام كلوريد الصوديوم وكلوريد البنزالكونيوم.
الشكل 1: التلاعب بعضو I. scapularis Gené . (أ) شكل عضو الجين. أعلى: عضو جين تحت البلغم. أسفل: الغدة المقطوعة وأجزاء الفم مطوية لأسفل. ب: أنثى ممتلئة تحت المجهر مؤمنة بالطين. (ج) تحرك أنثى أجزاء فمها على السطح البطني أثناء وضع البيض لتمديد عضو جين. تظهر الأسهم الصفراء بقعا بيضاء ويمكن استخدامها كمرجع لموقع عضو جين. هذه المناطق مرئية في الإناث التي تضع البيض لمدة 2-3 أسابيع. (د، ه) يمكن رؤية عضو الجين (فقاعة صغيرة في D وممتدة في E) بين البلغم والكابيتولوم. تمتد قرون عضو Gené مع انحناء أجزاء الفم لأسفل (E). يوضح السهم الأزرق موقع إدخال إبرة التنغستن لإزالة الغدة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مقارنة شكل إبر حقن الزجاج. يستخدم الأوسط لأجنة القراد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: محاذاة البويضة للحقن . (أ) إعداد منزلق زجاجي يستخدم لحقن الأجنة. يتم إرفاق شرائح زجاجية مجهرية ، مما يترك فجوة باستخدام شريط على الوجهين ، ويتم وضع ضمادة الفيلم الشفافة على الشريط. يتم محاذاة البيض على حافة الشريحة. ب: المحاذاة المثلى للبيض مع محور طويل عمودي على حافة الشريحة. ج: محاذاة أقل فعالية للبيض مع المحور الطويل الموازي لحافة إعداد الشريحة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| بناء حقن | الوقت بعد وضع البيض | عدد البويضات المحقونة | عدد اليرقات التي فقست | نسبة البقاء على قيد الحياة |
| sgRNA + كاس 9 | ≤12 ساعة | 2,396 | 147 | 6.14 |
| الجين 1 | ||||
| sgRNA + كاس 94 | ≤12 ساعة | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| الجين 2 | ||||
| sgRNA + كاس 94 | ≤12 ساعة | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| الجين 3 | ||||
| ولباخيا | ≥ 24 ساعة (24-36 ساعة) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + كاس 9 | 48-60 ساعة | 191 | 5 | 2.62 |
| الجين 2 |
الجدول 1: حقن البيض الناجح وفقس اليرقات في Ixodes scapularis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا هو البروتوكول الأول الذي تم تطويره لحقن أجنة القراد المبكرة بنجاح. تم تحقيق معدل البقاء على قيد الحياة ~ 4٪ -8٪ ، وهو ما يمكن مقارنته بحقن الجنين في نماذج الحشرات الراسخةالأخرى 5.
نظرا لأن هذا هو البروتوكول الأولي ، فمن المتوقع أن يتم تحسين هذا البروتوكول وتخصصه لأنواع القراد الفردية. على وجه الخصوص ، يختلف توقيت الحقن من نوع إلى آخر ، اعتمادا على التطور الجنيني ، وخاصة توقيت الخلوية. تشير البيانات الأولية إلى أن بيض I. scapularis لا يمر بتقسيم نووي سريع في أول 24 ساعة بعد وضعه ويحدث الخلوي بعد بضعة أيام (بيانات غير منشورة). لقد استخدمنا بالفعل هذا البروتوكول لتوصيل البلازميد 4 ، وخروج المغلوبالجيني بوساطة كريسبر4 ، وتوصيل البكتيريا (Wolbachia) (الجدول 1). من المتوقع أن يوفر بروتوكول حقن الأجنة هذا فرصا لتوليد القراد المعدل وراثيا وسيجعل دراسات الضربة القاضية الجينية والدراسات غير المباشرة ممكنة في أي مختبر. سيثبت هذا أنه ذو قيمة لتسريع الدراسات التي تستكشف بيولوجيا القراد وواجهات مضيف القراد الممرض.
الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول
من المهم جمع البيض في غضون 24 ساعة من وضع البيض لأن هذا البروتوكول قد تم توحيده للأجنة المبكرة. إذا تم جمع البيض بعد هذا الوقت ، فستكون هناك حاجة إلى علاج أطول لكلوريد البنزالكونيوم وكلوريد الصوديوم ، ويكون البقاء على قيد الحياة أقل في البيض الأكبر سنا (الجدول 1). يتصلب المشيم بمرور الوقت ، مما يجعل من الصعب القيام بتجفيف متحكم فيه للحقن المجهري في البويضات التي يزيد عمرها عن 24 ساعة. لوحظ أن حقن عدد أقل من البيض في وقت واحد يساعد على البقاء على قيد الحياة لأن البويضات المعالجة تميل إلى الجفاف بسرعة عند إزالتها من محلول كلوريد الصوديوم 1٪. إذا جفت البويضات كثيرا ، فسوف تموت ، لكنها ستنفجر أثناء الحقن المجهري إذا لم يتم تجفيفها بشكل مناسب. لذلك ، يعد تحسين وقت التجفيف المناسب ضروريا لأنواع أو سلالات القراد المختلفة. علاوة على ذلك ، فإن الحفاظ على البيض دون إزعاج بعد الحقن المجهري في ظروف الرطوبة العالية أمر بالغ الأهمية.
القيود والتوجهات المستقبلية
بمجرد إزالة الشمع من الأجنة ، فإنها تميل إلى الجفاف بسرعة ، لذلك يجب إجراء عملية محاذاتها على الشريحة وحقنها بسرعة. لا يمكن تحقيق التحسن السريع في السرعة والدقة إلا من خلال الممارسة المستمرة والصبر. سيركز عملنا المستقبلي على تحسين نسبة بقاء الأجنة على قيد الحياة بعد الحقن وتحديد توقيت تكوين الخلايا الجرثومية لضمان حدوث طفرات وراثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون ب Channa Aluvihare و Youns Gebermicale، ITF، UMD، للحصول على البصيرة والدعم خلال المرحلة الأولية من تطوير البروتوكول. كانت إبر التنغستن هدية سخية من ديفيد أوبروشتا، الITF، UMD. نحن ممتنون للدكتور لاديسلاف سيمو لاختبار هذا البروتوكول في I. ricinus وللمناقشات الثاقبة. تم تمويل هذا المشروع من قبل NIH-NIAID R21AI128393 ومؤسسة بليموث هيل ، نيويورك إلى MG-N ، وصناديق بدء التشغيل من جامعة نيفادا إلى AN، ومنحة المؤسسة الوطنية للعلوم رقم 2019609 إلى MG-N و AN، ومنحة نظير إلى نظير من IGTRCN إلى AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
