Summary
Mevcut protokol, kene embriyolarının enjekte edilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Embriyo enjeksiyonu, transgenik çizgiler oluşturmak için genetik manipülasyon için tercih edilen tekniktir.
Abstract
Keneler çeşitli viral, bakteriyel ve protozoan patojenleri iletebilir ve bu nedenle tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörler olarak kabul edilir. Kene kaynaklı hastalıkların artan yüküne rağmen, keneler üzerindeki araştırmalar, fonksiyonel çalışmalar için genetik dönüşüm araçlarının kenelerin benzersiz biyolojisine uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle böcek hastalığı vektörlerinin gerisinde kalmıştır. Genetik müdahaleler sivrisinek kaynaklı hastalıkları azaltmak için dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, bu tür müdahalelerin gelişimi, embriyoların enjekte edilmesiyle stabil germline transformasyonu gerektirir. Böyle bir embriyo enjeksiyon tekniği, keneler de dahil olmak üzere şeliseratlar için eksiktir. Kene embriyoları üzerinde harici kalın balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç gibi çeşitli faktörler, daha önce kenelerde embriyo enjeksiyon protokolü gelişimini engelleyen bazı engellerdir. Mevcut çalışma bu engellerin üstesinden gelmiştir ve siyah bacaklı kene için bir embriyo enjeksiyon tekniği olan Ixodes skapularis burada anlatılmaktadır. Bu teknik, kararlı germ hattı dönüşümleri için CRISPR/Cas9 gibi bileşenler sunmak için kullanılabilir.
Introduction
Keneler, çeşitli viral, bakteriyel, protozoan patojenleri ve nematodları 1,2 iletebilen tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörlerdir. Doğu Amerika Birleşik Devletleri'nde, siyah bacaklı kene, Ixodes scapularis, Lyme hastalığı (LD) patojeni olan spiroket Borrelia burgdorferi'nin önemli bir vektörüdür. Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 400.000'den fazla LD vakası bildirilmektedir ve bu da onu ABD'deki en iyi vektör kaynaklı bulaşıcı hastalık haline getirmektedir1. B. burgdorferi'ye ek olarak, dört bakteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi ve Ehrlichia muris eauclarensis), bir protozoan parazit (Babesia microti) ve bir virüs (Powassan virüsü) dahil olmak üzere altı mikroorganizma daha I. skapularisis tarafından bulaşır, bu da bu kene türünü önemli bir halk sağlığı sorunu haline getirir3 . Kene kaynaklı hastalıklar son yıllarda daha yaygın hale gelirken, keneler üzerine yapılan araştırmalar, kenelerin benzersiz biyolojisi ve genetik ve fonksiyonel genomik araçların uygulanmasıyla ilgili zorluklar nedeniyle sivrisinekler gibi diğer eklembacaklı vektörlerin gerisinde kalmıştır 4,5.
Gen düzenleme teknikleri, özellikle CRISPR / Cas9, artık fonksiyonel genomik çalışmaları model olmayan organizmalarda uygulanabilir hale getirmiştir. Bir organizmada kalıtsal mutasyonlar oluşturmak için, embriyo enjeksiyonu, germ çizgisi 6,7,8,9'u değiştirmek için yapılar sunmak için tercih edilen yöntem olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar4, kene yumurtalarının embriyoyu öldürmeden enjekte edilmesinin çok zor veya hatta imkansız olduğu düşünülüyordu10,11. Yumurtalar üzerinde kalın bir balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç, kenelerde embriyo enjeksiyonunu engelleyen ana engellerden bazılarıydı. Yetişkin, kanla beslenen I. skapularis, 3-4 hafta boyunca 12 yumurtaya kadar (yaklaşık100 yumurta / gün) 2.000 yumurtadan oluşan tek bir kavrama biriktirir. Yumurtalar tek tek serilir ve her yumurta, glandüler Gené'nin organının çıkıntıları veya "boynuzları" tarafından salgılanan balmumu ile kaplanır13,14,15 annenin. Bu balmumu yumurtaları kurumaya karşı korur ve antimikrobiyal bileşikler içerir15. Kene yumurtalarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için, balmumu tabakasını çıkarmak, koryonu yumuşatmak ve enjeksiyonun yumurtaya geri dönüşümsüz olarak zarar vermemesi için oval içi basıncı azaltmak için yumurtaları kurutmak önemlidir. Başarılı germline transformasyonu için embriyo enjeksiyonlarının kritik önemini anlayarak, bir CRISPR / Cas9 yapısı sunmak ve kararlı germline mutasyonları üretmek için kullanılabilecek I. scapularis için bir protokol geliştirilmiştir4. I. scapularis araştırmasına katkısına ek olarak, bu protokol diğer kene türleri için de optimize edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ixodes scapularis yetişkinleri ya Oklahoma Eyalet Üniversitesi'nden (OSU) satın alındı ya da Nevada Üniversitesi, Reno'da (UNR) yetiştirildi (IACUC protokolü #21-001-1118).
1. Embriyo toplama için dişi kenelerin hazırlanması
NOT: Uygun yaştaki yumurtaları toplamak için, yumurtlamayı senkronize etmek önemlidir. Kenelerde yumurtlama ipuçları belirsizliğini korusa da, standart böcek koşulları altında (27 ° C sıcaklık ve% >90 bağıl nem (RH)), I. scapularis dişileri, konakçı ayrılmasından yaklaşık 8 gün sonra yumurta bırakmaya başlar. Bu zaman çizelgesi, dolu dişileri 4 ° C'de depolayarak uzatılabilir. Kanla beslenen dişileri 4 ° C'de 8 haftaya kadar yumurtlama üzerinde herhangi bir olumsuz etkisi olmadan sakladık. Bu koşulların her böcek için değiştirilmesi gerekebilir.
- Tüm dolu dişileri, mikroenjeksiyonlar için kullanılana kadar nemli filtre kağıdı ile kaplanmış 6 litrelik plastik bir kutuda% >90 RH ile 4 ° C'de saklayın.
- Enjeksiyonlardan bir hafta önce, yumurtlamanın başlatılması için dişileri 4 ° C'den 27 ° C'lik bir inkübatöre aktarın.
- Dişiler yumurta bırakmaya başladığında (onları 27 ° C'ye taşıdıktan 3-4 gün sonra), ince uçlu bir boya fırçası kullanarak yumurtaları çıkarın ve dişileri Gené'nin organ (balmumu bezi) ablasyonu için hazırlayın.
NOT: Gené'nin organı, scutum ve capitulum (ağız kısımlarının dorsal tabanı) arasındaki alandan uzanır, ağız kısımları ventral vücut yüzeyi üzerinde bükülür (yüzeye paralel) ve genişletilmiş Gen'in organı, yumurtalar serilir serilmez yumurtaları kaplar (Şekil 1). Gené'nin organının çıkarılmasından veya balmumunun boşaltılmasından önce bırakılan yumurtalar balmumu kaplamasına sahip olacaktır ve enjeksiyonlar için uygun değildir ve atılmalıdır. - Gené'nin organını çıkarmak veya boşaltmak için, engorged dişiyi mikroskop altında yönlendirilmiş bir cam slayt üzerine konumlandırmak için kil kullanın, böylece ağız kısımları hem ventral hem de dorsal taraflarda görülebilir (Şekil 1B, C).
- Daha önce yayınlanmış bir protokol16'yı takiben tungsten teli kullanılarak laboratuarda yapılan ince forseps ve tungsten iğneleri kullanarak scutum ve ağız kısımları arasındaki alanı dikkatlice dürtün (iğneler ticari olarak da satın alınabilir ve bir mikro diseksiyon probuna tutturulabilir, bkz.
- Tungsten iğnesi ile içeri girmeye çalışarak, balmumu bezini dışarı çekin (Şekil 1D, E). Bezin çıkarılması birkaç dakika sürebilir. Laboratuvar mendilleri kullanarak sıvı balmumu salgılarını silin.
NOT: Bez, ağız kısımlarının hemen altındaki ventral taraftan da çıkarılabilir; arkadan scutuma doğru bir iğne ve forseps ile uzanarak. Ağız kısımlarının etrafına silikon yapıştırıcı uygulanması da Gene'in organ eversiyonunu engeller ve balmumunu çıkarmak veya boşaltmak yerine kullanılabilir (Dr. Ladislav Simo, INRAE, Fransa ile kişisel iletişim). Engorged keneler çift taraflı bantta kalmayacaktır. Keneyi "kundaklamak" için kil kullanmak, manipülasyon sırasında onları yerinde tutmaya yardımcı olur. Diseksiyon için kene ve tungsten iğnesini tutmak için forseps kullanın. Ventral kısmın iğne ile delinmesi daha kolaydır ve yazarlar tarafından tercih edilir.
- Bezi boşaltmak için, gravid kenesini adım 1.4'te belirtildiği gibi düzenleyin. Dorsal taraftaki ağız kısımlarının arkasındaki alanı dikkatlice delin ve forseps kullanarak ventral tarafa baskı uygulayın.
NOT: Alternatif olarak, balmumu bezinin çıkarılması gerekli değildir; balmumu bezinin boşaltılması birkaç gün sürecektir. Yumurtlayan dişiler, ağız kısımlarının etrafında, balmumu bezinin yerini gösteren ve referans olarak kullanılabilecek beyaz bir alana sahiptir.- Tüy bırakmayan bir laboratuvar mendilinin kenarını yerleştirin ve delinme bölgesinden çıkan sıvı balmumunu çıkarın. Hafif sarımsı viskoz balmumu ile karşılaştırıldığında berrak bir sıvı olan hemolenf sekresyonundan kaçındığınızdan emin olun. Balmumunun çoğu çıkarılana kadar 5-10 dakika sürebilir.
- Manipülasyondan sonra, dişileri 27 ° C'de (% >90 RH) bir inkübatöre yerleştirin ve 1-2 gün boyunca iyileşmelerine izin verin.
NOT: Tedavi edilen dişilerin iyileşmesi ve tekrar yumurta bırakmaya başlaması genellikle 1-2 gün sürer. - Dişiler tekrar yumurta bırakmaya başladığında, taze birikmiş yumurtaları toplamak için ince bir boya fırçası kullanın (yumurtlamadan 0-18 saat sonra) ve bunları 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Zamanla aynı dişiden yumurta kullanılıyorsa, bezler çıkarılmamışsa, bu prosedür yumurtlamadan 4-5 gün sonra tekrarlanmalıdır.
2. Mikroenjeksiyonlar için embriyo tedavisi
- 0-18 saat eski yumurta içeren tüpe ~ 200 μL (veya yumurta sayısına bağlı olarak yumurtaları örtmek için yeterli hacim) % 5 (ağırlık / hacim) benzalkonyum klorür / su (bkz. Yumurtaların tüpün dibine yerleşmesini önlemek için yumurtaları boya fırçasıyla 5 dakika boyunca yavaşça döndürün (ayrıntılar için Sharma ve ark.4'e bakınız). Süpernatantı bir mikropipet kullanarak çıkarın ve yumurtaları tüp içinde geride bırakın.
DİKKAT: Benzalkonyum klorür cilt ve gözler için aşındırıcıdır, eldiven giyin ve göz koruması kullanın. - Yumurta içeren tüpe ~ 200 μL damıtılmış (DI) su ekleyin, bir boya fırçasıyla döndürün ve bir mikropipet kullanarak suyu mikrosantrifüj tüpünden çıkarın. DI su ile yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
- DI suyu ile yıkadıktan sonra, ~ 200 μL% 5 (w / v) sodyum klorür (NaCl) ekleyin ve 5 dakika boyunca bir boya fırçası ile hafifçe döndürün. Çözeltiyi 5 dakika sonra tüpten çıkarın ve yumurtaları iki kez DI suyuyla yıkayın.
- Yumurta içeren mikrosantrifüj tüpüne ~100 μL% 1 (w / v) NaCl çözeltisi ekleyin. Yumurtaları enjeksiyonlar için kullanılana kadar% 1 (w / v) NaCl çözeltisinde tutun.
- Yaklaşık bir saat sonra mikroenjeksiyonlara başlayın. Bu zaman çizelgesi, yumurtaların uygun şekilde kurutulmasına yardımcı olur ve patlamalarını önler.
NOT: Yumurtalar, sağkalımı önemli ölçüde etkilemeden 7-8 saat boyunca% 1 (w / v) NaCl çözeltisinde tutulabilir. Yumurtaların enjekte edilmesi veya patlaması zorsa, yumurtalar yeterince kurutulmaz ve 5 dakika daha% 5 (w / v) NaCl ile muamele edilebilir.
3. Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması
- Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çektiricisine bir alüminosilikat kılcal cam (filamentli, Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
- İğne çektiricisini şu ayarlara ayarlayın: Isı: 575, Çekme: 20, Hız: 50, zaman: 200 ve Basınç: 700.
- İğne çektiricisinin çekme işlevini etkinleştirin ve ek iğneler için işlemi tekrarlayın.
- Çekilen iğneleri, temiz bir Petri kabında modelleyicinin kil hatlarına yapıştırarak saklayın.
- İğneyi bir mikro yükleyici ucu kullanarak enjeksiyon karışımıyla doldurun (bkz.
NOT: Kene ve sivrisinek embriyosu enjeksiyonu için kullanılan iğnelerin karşılaştırılması Şekil 2'de gösterilmiştir.
4. Mikroenjeksiyonlar için slayt kurulumu
- Çift taraflı bant kullanarak, iki cam mikroskop slaytını birbirine yapıştırın, yumurtaların hizalanmasını desteklemek ve enjeksiyonlar sırasında yuvarlanmalarını önlemek için yaklaşık 0,5 cm'lik bir boşluk bırakın (Şekil 3A).
- Slaytlar arasındaki boşluktaki çift taraflı bant üzerine bir parça şeffaf film pansuman uygulayın (bkz. Film pansuman boşluğuyla mükemmel bir şekilde hizaladığınızdan emin olun.
5. Embriyo mikroenjeksiyonları
- Tek saçlı bir boya fırçası kullanarak slayt kurulumunda (yukarıda) bir seferde 8-10 yumurtayı hizalayın.
NOT: Kızak kenarına dik olarak daha uzun eksenle hizalanmış yumurtaların (Şekil 3B), uzunlamasına ekseni kenara paralel olarak hizalanmış yumurtalara göre enjekte edilmesi daha kolaydır (Şekil 3C). Dik yöndeki yumurtalar (Şekil 3B) enjeksiyona daha iyi dayanabilir ve bu da daha yüksek hayatta kalma ile sonuçlanabilir. - Slaytı hizalanmış yumurtalarla bileşik mikroskop sahnesine yerleştirin. Depolandıkları %1 NaCl çözeltisini çıkarmak için bir parça tüy bırakmayan mendil kullanın.
- Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini bir mikromanipülatöre bağlı bir mikroenjektöre takın (bkz.
- İğneyi, mikroenjektör üzerinde yüksek basınç ayarı kullanarak yumurta yüzeyine nazikçe sürtünerek açın (>5.000 hPa).
- İğne açıldıktan sonra, iğnenin açılmasına bağlı olarak mikroenjektörün basıncını (1.000-2.500 hPa) azaltın.
NOT: Küçük bir açıklık nispeten daha yüksek basınç gerektirirken, daha büyük bir açıklık daha düşük bir basınç gerektirecektir. Bu, enjekte edilen yapının hacmini kontrol etmek içindir. İğne açıklığının boyutuna bağlı olarak, enjeksiyon hacmi 1-5 pL arasında değişecektir. - Slayttaki tüm yumurtaları mümkün olduğunca çabuk 10°-15° açıyla enjekte edin ve slaytı nemli kağıtla kaplı bir Petri kabında hemen yüksek nem koşullarına getirin. Yumurtalar enjekte edilir edilmez kurumaya başlarlar.
NOT: Bir seferde az sayıda yumurta enjekte etmek, enjeksiyon başarısını ve hayatta kalma olasılığını arttırır. İğneler embriyo reflü tarafından tıkanır. Uç hala keskinse, tıkanmış iğneleri temizlemek için, iğneyi slaytın kenarına eklenen% 1'lik küçük bir NaCl damlacığına hareket ettirin. Kılcal hareket, küçük tıkanıklığı yerinden çıkaracaktır. İğne zaten kör ise, değiştirin.
6. Embriyoların enjeksiyon sonrası bakımı
- Enjekte edilen embriyoları içeren slaytı, nemli filtre kağıdı ile kaplı büyük bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Yumurtaları en az 5-6 saat rahatsız etmemek çok önemlidir. Bu, enjeksiyon yarasının düzgün bir şekilde kapatılmasını sağlar. Enjeksiyon yarası çalkalandığında açılabilir ve sitoplazma sızmaya başlayabilir ve yumurta mortalitesine neden olabilir. - 5-6 saat sonra, enjekte edilen embriyolar eklenmiş şeffaf film pansumanına küçük bir damla DI suyu ekleyin. Bir boya fırçası kullanarak, yumurtaları yavaşça yerinden oynatın. Yumurtaları küçük bir Petri kabına (10 cm) aktarın ve DI suyuna batırın.
NOT: Film pansumanı, enjeksiyonlardan sonra yumurtaların kolayca çıkarılmasını sağlar. Film sosuna bir su damlası eklendiği anda, yumurtalar su ile birlikte hareket etmeye başlayacaktır. - Yumurtaları suya batırın ve Petri kabını 27 ° C ve% >90 RH'de bir inkübatörde 6 litrelik plastik bir kutuya yerleştirin.
- Yumurtaları düzenli olarak, ilk birkaç gün boyunca günlük olarak ve daha sonra larvalar yumurtadan çıkmaya başlayana kadar her 3-4 günde bir kontrol edin.
NOT: Mikroenjeksiyonlar sırasında çok sayıda yumurta hasar görürse, bir hafta sonra DI suyunun nazikçe boşaltılması, ölü yumurtalarda mantar büyümesini önleyecektir. - Larvalar enjekte edilen embriyolardan yumurtadan çıkmaya başladığında (mevcut laboratuvar kurulumu için enjeksiyondan 21-25 gün sonra), günlük olarak kontrol edin ve yumurtadan çıkmış larvaları üstte bir ekran bulunan cam şişelere aktarın. Larvalar su altında yumurtadan çıkabilir ve ~ 1-2 hafta hayatta kalabilir.
- Yumurtalara görünür bir fenotiple sonuçlanabilecek bir yapı enjekte edilirse larvaları4 kez tarayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede I. scapularis için başarılı bir embriyo enjeksiyon protokolü anlatılmaktadır. Yumurtlayan dişiler, kısmen mumlanmış yumurtaların kurumasını önlemek için yüksek nemde tutuldu. Balmumu tabakası, gravid dişinin Gen'in organını (balmumu bezi) ablatarak kene embriyolarını enjekte etmek için çıkarıldı (Şekil 1A-E). Daha kısa boyunlu alüminosilikat cam iğneler kullandık (Şekil 2). Bu şekil, bölü yumurta enjeksiyonları için kullanılan uzun boyunlu (konik) iğneden daha iyi tolere edebildiği için kene yumurtası enjeksiyonu için idealdi. Kene yumurtalarının küresel şekli, iğne yerleştirme sırasında yumurtanın slayttan yuvarlanmasını önlemek için sahne arkasında bir slayt platformu gerektirir (Şekil 3A). I. skapularis'in erken embriyonik gelişimi bilinmemektedir, bu nedenle germ hücresi oluşumunun zamanlaması ve yeri de bilinmemektedir. Bu nedenle, gelişimin erken dönemlerinde (12-18 saat eski) yumurta enjekte etmeyi seçtik ve yumurtanın daha uzun eksenini slaytın kenarına dik olarak hizalamanın daha yüksek sağkalım ile sonuçlandığını gördük (Şekil 3B, C). Bu protokol kullanılarak birkaç bin yumurta enjekte edildi. Bu enjekte edilen yumurtaların% 8.5'ine kadarı hayatta kaldı ve larvalar yumurtadan çıktı (Tablo 1). Tedavi edilen ancak enjekte edilmeyen yumurtaların hayatta kalma oranı çok daha yüksekti (% 70'e kadar), enjeksiyonlardaki iyileşmenin (zamanlama, enjeksiyon yeri veya iğne ile) yumurta sağkalımını artırabileceğini düşündürmektedir. Bu protokol, embriyogenezin erken dönemlerinde (12-18 saat yaşlı) yumurta enjekte etmek için geliştirilmiştir; Bununla birlikte, bu, NaCl ve benzalkonyum klorür ile daha uzun süre tedavi edilen 10 güne kadar olan yumurtalar için kullanılabilir.
Resim 1: I. scapularis Gené'nin organının manipülasyonu. (A) Gen'in organının diyagramı. Üst: Scutum'un altındaki genin organı. Alt: Everted bezi ve ağız kısımları aşağı katlanmış. (B) Kil ile sabitlenmiş mikroskop altında dolu bir dişi. (C) Bir dişi, Gene'in organını genişletmek için yumurtlama sırasında ağız kısımlarını ventral yüzeyde hareket ettirir. Sarı oklar beyaz lekeler gösterir ve Gene'in organ konumu için referans olarak kullanılabilir. Bu alanlar 2-3 hafta boyunca yumurta bırakan kadınlarda görülür. (D,E) Genin organı (D'de küçük bir kabarcık ve E'de uzanmış) scutum ve capitulum arasında görülebilir. Gené'nin organının boynuzları, ağız kısımları aşağı doğru büküldükçe uzanır (E). Mavi ok, bezi çıkarmak için bir Tungsten iğnesinin yerleştirileceği yeri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Cam enjeksiyon iğnelerinin şeklinin karşılaştırılması. Ortadaki kene embriyoları için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Enjeksiyonlar için yumurta hizalaması . (A) Embriyo enjeksiyonları için kullanılan cam slayt kurulumu. Mikroskop cam slaytları, çift taraflı bant kullanılarak bir boşluk bırakılarak tutturulur ve şeffaf film pansumanı bant üzerine yerleştirilir. Yumurtalar slaytın kenarına hizalanır. (B) Kızağın kenarına dik uzun bir eksene sahip yumurtaların optimum hizalaması. (C) Yumurtaların slayt düzeneğinin kenarına paralel uzun eksenle daha az etkili hizalanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yapı enjekte edildi | Yumurtlamadan sonraki zaman | Enjekte edilen yumurta sayısı | Yumurtadan çıkan larva sayısı | Hayatta kalma yüzdesi |
| sgRNA + Cas9 | ≤12 saat | 2,396 | 147 | 6.14 |
| Gen 1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 saat | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| Gen 2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 saat | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| Gen 3 | ||||
| Wolbachia Belediyesi | ≥ 24 saat (24-36 saat) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + Cas9 | 48-60 saat | 191 | 5 | 2.62 |
| Gen 2 |
Tablo 1: Ixodes scapularis'te başarılı yumurta enjeksiyonu ve larva yumurtadan çıkma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu, erken kene embriyolarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için geliştirilen ilk protokoldür. Diğer köklü böcek modellerinde embriyo enjeksiyonu ile karşılaştırılabilir olan ~% 4 -% 8'lik bir hayatta kalma oranı elde edilmiştir5.
Bu ilk protokol olduğundan, bu protokolün bireysel kene türlerine göre daha da rafine edileceği ve uzmanlaşacağı tahmin edilmektedir. Özellikle, enjeksiyon zamanlaması, embriyogeneze, özellikle de selülizasyonun zamanlamasına bağlı olarak türlerden türlere değişecektir. Ön veriler, I. scapularis yumurtalarının yumurtlamadan sonraki ilk 24 saat içinde hızlı nükleer bölünmeden geçmediğini ve hücreselleşmenin birkaç gün sonra gerçekleştiğini göstermektedir (yayınlanmamış veriler). Bu protokolü plazmid dağıtımı 4, CRISPR aracılı gen nakavtı4 ve bakteri dağıtımı (Wolbachia) için zaten kullandık (Tablo 1). Bu embriyo enjeksiyon protokolünün transgenik keneler üretmek için fırsatlar sağlaması ve gen nakavt ve nakavt çalışmalarını herhangi bir laboratuarda mümkün kılması beklenmektedir. Bu, kene biyolojisini ve kene-patojen-konakçı arayüzlerini araştıran çalışmaları hızlandırmak için değerli olacaktır.
Protokol içindeki kritik adımlar
Yumurtlamadan sonraki 24 saat içinde yumurta toplamak önemlidir, çünkü bu protokol erken embriyolar için standartlaştırılmıştır. Bu süreden sonra yumurta toplanırsa, benzalkonyum klorür ve NaCl'nin daha uzun bir tedavisine ihtiyaç vardır ve yaşlı yumurtalarda sağkalım daha düşüktür (Tablo 1). Koryon zamanla sertleşir ve 24 saatten eski yumurtalarda mikroenjeksiyonlar için kontrollü kurutmanın yapılmasını zorlaştırır. Bir seferde daha az yumurta enjekte etmenin hayatta kalmaya yardımcı olduğu fark edildi, çünkü tedavi edilen yumurtalar% 1 NaCl çözeltisinden çıkarıldığında hızla kuruma eğilimindedir. Yumurtalar çok fazla kurursa, ölürler, ancak uygun şekilde kurutulmazlarsa mikroenjeksiyon sırasında patlarlar. Bu nedenle, farklı kene türleri veya suşları için uygun kuruma süresinin optimize edilmesi gereklidir. Ayrıca, mikroenjeksiyonlardan sonra yumurtaların yüksek nem koşullarında rahatsız edilmeden tutulması çok önemlidir.
Sınırlamalar ve gelecekteki talimatlar
Embriyolar mumdan arındırıldıktan sonra, hızlı bir şekilde kuruma eğilimindedirler, bu nedenle onları slayt üzerinde hizalama ve enjekte etme işlemi hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Hız ve doğruluktaki hızlı iyileşme ancak sürekli uygulama ve sabırla sağlanabilir. Gelecekteki çalışmalarımız, enjeksiyondan sonra embriyoların hayatta kalma yüzdesini iyileştirmeye ve kalıtsal mutasyonları sağlamak için germ hücresi oluşumunun zamanlamasını belirlemeye odaklanacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Channa Aluvihare ve Yonus Gebermicale, ITF, UMD'ye, protokol geliştirmenin ilk aşamasında içgörü ve destek için teşekkür eder. Tungsten iğneleri, David O'Brochta, ITF, UMD'den cömert bir hediyeydi. Bu protokolü I. ricinus'ta test ettiği ve anlayışlı tartışmalar için Dr. Ladislav Simo'ya minnettarız. Bu proje NIH-NIAID R21AI128393 ve Plymouth Hill Vakfı, NY'den MG-N'ye, Nevada Üniversitesi'nden AN'ye başlangıç fonları, MG-N ve AN'ye 2019609 Ulusal Bilim Vakfı Hibe ve IGTRCN'den AS'ye Peer-to-Peer Grant tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
