Den nuværende protokol beskriver de kontrollerede mikroblade ridser på overfladen af ledbrusk efter destabilisering af museknæet ved at skære det mediale miniscotibial ledbånd. Denne dyremodel præsenterer en accelereret form for slidgigt (OA), der er egnet til at studere osteofytdannelse, osteosklerose og smerter i det tidlige stadium.
Slidgigt er den mest udbredte muskuloskeletale sygdom hos mennesker over 45 år, hvilket fører til stigende økonomiske og samfundsmæssige omkostninger. Dyremodeller bruges til at efterligne mange aspekter af sygdommen. Den nuværende protokol beskriver destabiliserings- og bruskskrabemodellen (DCS) af posttraumatisk slidgigt. Baseret på den udbredte destabilisering af den mediale menisk (DMM) model introducerer DCS tre ridser på bruskoverfladen. Den nuværende artikel fremhæver trinene til at destabilisere knæet ved at transecting det mediale meniscotibial ledbånd efterfulgt af tre forsætlige overfladiske ridser på ledbrusk. De mulige analysemetoder ved dynamisk vægtleje, mikrocomputertomografi og histologi demonstreres også. Mens DCS-modellen ikke anbefales til studier, der fokuserer på effekten af slidgigt på brusk, muliggør den undersøgelse af slidgigtudvikling i et kortere tidsvindue med særligt fokus på (1) osteofytdannelse, (2) slidgigt og skadessmerter og (3) effekten af bruskskader i hele leddet.
Slidgigt (OA) er den mest udbredte muskuloskeletale sygdom hos mennesker over 45 år, hvor over 8,75 millioner søger behandling i Storbritannien1. Den stigende forekomst af sygdommen har ført til øgede økonomiske og samfundsmæssige omkostninger, er en stor bidragyder til handicap og reducerer livskvaliteten for patienter1. Uden tilgængelige behandlinger er der et presserende behov for at fremskynde forskningen for at forstå sygdommens udvikling og progression. Sygdommen er kompleks og også multifaktoriel i sin natur. De vigtigste kliniske målinger af sygdommen er smerte og ledmobilitet2, og OA påvirker alle væv i leddet, ikke kun brusk3. En af de største udfordringer ved at forstå OA er, at det kan tage år, nogle gange årtier, fra den første præsentation / skade til symptomatisk sygdomsprogression med smerte og immobilitet.
Modellering af slidgigt hos gnavere har forbedret vores viden om OA patofysiologi ved at give os mulighed for at forstå initiering og progression i en meget kortere tidsramme og med en detaljeret undersøgelse af de involverede væv. Der er mange murine modeller af slidgigt, fra genetisk modificerede dyr til kirurgiske indgreb modeller. Den mest anvendte murinemodel af posttraumatisk OA er destabiliseringen af den mediale menisk (DMM)4,5. En advarsel ved modellen er variabiliteten mellem forskellige operatører. Erfarne kirurger kan udføre proceduren med minimal ledskade, mens uerfarne operatører udsætter ledkapslen i længere tid og forårsager skade på brusk. Denne variation i processen påvirker sværhedsgraden af modellen, med mere indledende skade, der fører til øget bruskskadescore og osteofytdannelse. Med det formål at reducere variationen mellem operatører og efterligne bruskskader fra klinisk intervention udvikles en modificeret version af denne model, hvorved kontrolleret yderligere skade på bruskoverfladen i form af tre overfladiske ridser påføres6. Dette tillader også modellering af OA-progressionen som følge af bruskskader forårsaget af nogle kliniske interventioner. Sammenlignet med standard DMM-modellen resulterer den direkte inducerede bruskskade i konsekvent accelereret fremspringende osteofytdannelse, øget bruskskader og betændelse og målbare surrogatsmerter hos hanmus.
Denne model er særligt velegnet til undersøgelse af posttraumatisk OA i tidlig fase med fokus på osteofytdannelse, smertepræsentation (hos hanmus), synovitis og tidlige ændringer i knogleparametre. Konsistensen af osteofytdannelse i denne model gør det relevant at studere knoglereparation og endokondral ossifikation, da osteofytdannelse er en reparationsproces via endokondral ossifikation7. Modellen efterligner også skader, der indføres direkte på brusken under kliniske indgreb, såsom artroskopiske kirurgiske indgreb, og den er derfor også velegnet til undersøgelse af bruskskaders virkning på hele leddet.
For at udføre kirurgisk induktion af posttraumatisk slidgigt (PTOA) anbefales det kraftigt at støtte fra en assistent (f.eks. til at forberede musene, mens operatøren fokuserer på operationen). Dette letter aseptisk kirurgi og derved reducerer risikoen for infektioner og gør interventionen mere effektiv i store eksperimenter. Det er let at miste fokusplanet under operationen, så et mikroskop, der inkluderer pedaler til fokusering, er en værdifuld funktion til at hjælpe med at opretholde sterilitet under hele operationen. Musens og knæets position er afgørende. Knæet skal vende opad og tilstrækkeligt bøjet til at maksimere åbningen af knæleddet, hvilket letter lettere adgang til ledbåndet for at introducere mikrobladet til at ridse kondyleoverfladen. Det kan være udfordrende at identificere MMTL, især når fedtpuden er større end normalt, eller der er en lille blødning. For at undgå blødninger skal du skubbe fedtpuden opad for at forhindre tårer og efterfølgende blødning. Hvis fedtpuden er stor, kan det tage lidt længere tid, men fortsæt tålmodigt med at skubbe den opad.
MMTL er ret tæt på tibial condyle, så man skal passe på ikke at skade brusk, når man placerer det nederste blad på den buede fjedersaks under MMTL. De buede knive skal pege mod den mediale side og lidt opad, parallelt med kondylen. For den bedste sektionering af MMTL skal du sikre dig, at saksen er skarp. Kontroller, at menisken kan bevæge sig medialt efter at have skåret ledbåndet, da der nogle gange er en lille vedhæftning tilbage, der skal skæres yderligere. Når mikrobladet introduceres for at ridse kondylen, skal det være vinkelret på kondylen. Lav den første ridse tættere på midten af leddet, men pas på ikke at beskadige det forreste korsbånd. Flyt derefter mod den mediale side og derefter bag menisken. Ridserne kan være synlige som svage hvide streger på brusk. Fordi vi normalt bruger klip, udføres det indledende snit på den laterale side, så klemmerne placeres på siden af benet efter lukning af såret. Dette undgår klemmerne, der gnider knæet, når musen genvinder bevægelsen. Ved brug af suturer anbefales det kraftigt at bruge subdermale sting. Hvis du bruger eksterne sting, vil musene sandsynligvis gnave i stingene og åbne deres sår, hvilket vil øge chancerne for infektion. Når det gøres rigtigt, må denne operation ikke tage mere end 5-10 minutter fra snit til sårlukning, hvilket minimerer eksponeringen af brusk og eventuelle yderligere ukontrollerede skader, der måtte opstå. Efter operationen kommer musene sig meget hurtigt og kan næsten øjeblikkeligt klatre ind i buret og bevæge sig normalt rundt. Hvis musene ikke er aktive, skal den relevante ekspert i enheden konsulteres.
Til adfærdsmæssig evaluering af smerte blev dynamisk vægtbærende vurderet. Denne metode kan dog betragtes som mindre følsom end andre fremkaldte smertetest, såsom von Frey-test15. Det anbefales, at mere end én metode bruges til at overvåge og vurdere smerte. De ændringer, der blev observeret 2 uger efter intervention i DCS, selvom de er forbigående, indikerer en generelt nedsat belastning af OA-benet sammenlignet med det sunde ben. Derfor kan 2 uger efter DCS-intervention bruges til at evaluere tidlig osteoarthritisk eller skadessmerter i musemodeller. Visualisering af mineraliserede osteofytter ved μCT giver mulighed for tredimensionel kvantificering, som også kan matches med de histologiske afsnit12, hvilket tilføjer en anden dimension til undersøgelsen af osteofyts fremkomst og evolution. I vores gruppe var osteofytforekomsten variabel i DMM-modellen mellem og inden for operatører (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), mens induktion af DCS robust førte til osteofytgenerering i alle tilfælde uanset operatøren (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Der er også betydeligt flere og større osteofytter i DCS-modellen sammenlignet med DMM. DCS er således en ideel model til undersøgelse af osteofytdannelse. Kvantificering af osteosklerose begrænset til belastningsområdet for den subkondrale knogle er også en forbedring i påvisning af små ændringer. Sammenligning af det mediale rum i det opererede ben med det kontralaterale ben giver også en måde at normalisere mod den iboende knoglefænotype af den pågældende mus12. Tilsætningen af bruskridridserne i DCS-modellen er et kontrolleret middel til at fremkalde fokuseret bruskskade under operationen, der fremskynder mange af sygdommens aspekter. En af konsekvenserne af forsøgsproceduren, der involverer forsætlig skade på selve brusken, er, at denne artefaktskade skal udelukkes eller justeres i bruskklassificeringssystemet. På grund af denne begrænsning anbefaler vi ikke denne model, hvis undersøgelsens hovedformål er at forstå effekten af slidgigt på selve brusk. Endelig anbefales det også kraftigt at få mindst to blindede scorere til at bedømme bruskskader og synovitis-score. Dette validerer og forbedrer standardiseringen af scoringssystemerne.
En begrænsning ved denne undersøgelse er, at omfanget af variabilitet på tværs af alle parametre, der sammenligner DCS- og DMM-modellerne, ikke blev evalueret fuldt ud. Dette vil blive behandlet i fremtiden med mere omfattende undersøgelser, som også kunne omfatte en vurdering af variabiliteten mellem operatører fra forskellige institutioner.
Afslutningsvis tillader den accelererede OA-patogenese i den nuværende DCS-model repræsentation af posttraumatisk OA og giver et kraftfuldt og robust forskningsværktøj til at undersøge og belyse underliggende OA-patofysiologiske mekanismer, der driver denne kronisk svækkende ledsygdom. Derudover gør det det muligt at udforske OA i et kortere tidsvindue med fokus på osteophytogenese, OA-smerter og effekten af bruskskader på hele leddet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende Gemma Charlesworth og Mandie Priors arbejde ved University of Liverpool, der erhvervede μCT-billederne, der blev brugt i denne publikation. Arbejdet blev finansieret af Versus Arthritis (tilskud 20199 og 22483). Lynette Dunning er finansieret af Versus Arthritis (bevilling 20199). Kendal McCulloch blev finansieret af et UWS ph.d.-stipendium. Carmen Huesa blev finansieret af Versus Arthritis (tilskud 20199 og 22483).
#11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | – | alternative method to close wound |
Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | – | |
Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | – | To sterilise surgical skin area |
Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
Balance | Generic (many different suppliers) | – | To weigh mouse |
Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | Analgesia |
CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
Ethanol | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | |
Mice | Charles river | – | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | – | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | – | To ensure sterility of surgical area |
Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | To cover mouse and expose leg |
Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | – | maintain sterile environment for surgical tools |
Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | cover the mouse and keep leg through key hole |
Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | – | Adjustable focus. |
Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
Xylene | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |