Summary
Mevcut protokol, medial miniskotibial ligamenti keserek fare dizinin dengesini bozduktan sonra eklem kıkırdağının yüzeyindeki kontrollü mikrobıçak çiziklerini tanımlamaktadır. Bu hayvan modeli, osteofit oluşumunu, osteosklerozu ve erken evre ağrıyı incelemek için uygun hızlandırılmış bir osteoartrit (OA) formu sunar.
Abstract
Osteoartrit, 45 yaşın üzerindeki kişilerde en yaygın kas-iskelet sistemi hastalığıdır ve artan ekonomik ve toplumsal maliyete yol açmaktadır. Hayvan modelleri, hastalığın birçok yönünü taklit etmek için kullanılır. Mevcut protokol, travma sonrası osteoartritin destabilizasyonu ve kıkırdak çizik modelini (DCS) tanımlamaktadır. Medial menisküs (DMM) modelinin yaygın olarak kullanılan destabilizasyonuna dayanarak, DCS kıkırdak yüzeyinde üç çizik oluşturur. Bu makalede, medial meniskotiyal ligamentin transeksiyonu ile dizin destabilize edilmesi ve ardından eklem kıkırdağında üç kasıtlı yüzeysel çizik vurgulanmaktadır. Dinamik ağırlık taşıma, mikrobilgisayarlı tomografi ve histoloji ile olası analiz yöntemleri de gösterilmiştir. DCS modeli, osteoartritin kıkırdak üzerindeki etkisine odaklanan çalışmalar için önerilmese de, (1) osteofit oluşumu, (2) osteoartritik ve yaralanma ağrısı ve (3) kıkırdak hasarının tüm eklemdeki etkisine özel olarak odaklanarak osteoartrit gelişiminin daha kısa sürede incelenmesini sağlar.
Introduction
Osteoartrit (OA), 45 yaşın üzerindeki kişilerde en yaygın kas-iskelet sistemi hastalığıdır ve İngiltere'de tedavi arayan 8.75 milyondan fazlakişi 1. Hastalığın artan prevalansı, ekonomik ve toplumsal maliyetin artmasına neden olmuş, engelliliğe önemli bir katkıda bulunmakta ve hastalar için yaşam kalitesini düşürmektedir1. Mevcut tedaviler olmadan, hastalığın gelişimini ve ilerlemesini anlamak için araştırmayı hızlandırmak için acil bir ihtiyaç vardır. Hastalık karmaşık ve aynı zamanda doğası gereği çok faktörlüdür. Hastalığın ana klinik ölçümleri ağrı ve eklem hareketliliği2'dir ve OA sadece kıkırdak3'ü değil, eklemdeki tüm dokuları etkiler. OA'nın anlaşılmasındaki temel zorluklardan biri, ilk sunum / yaralanmadan ağrı ve hareketsizlik ile semptomatik hastalık ilerlemesine kadar yıllar, bazen on yıllar alabilmesidir.
Kemirgenlerde osteoartritin modellenmesi, OA patofizyolojisi hakkındaki bilgimizi, başlangıç ve ilerlemeyi çok daha kısa bir zaman diliminde ve ilgili dokuların ayrıntılı bir incelemesiyle anlamamızı sağlayarak geliştirmiştir. Genetiği değiştirilmiş hayvanlardan cerrahi müdahale modellerine kadar çok sayıda osteoartrit murin modeli vardır. Post-travmatik OA'nın en yaygın kullanılan murin modeli medial menisküsün (DMM) destabilizasyonudur4,5. Modelin bir uyarısı, farklı operatörler arasındaki değişkenliktir. Deneyimli cerrahlar prosedürü minimum eklem hasarı ile gerçekleştirebilirken, deneyimsiz operatörler eklem kapsülünü daha uzun süre maruz bırakır ve kıkırdakta hasara neden olur. Prosesteki bu değişkenlik, modelin ciddiyetini etkiler, daha fazla ilk hasar kıkırdak hasarı skorlarının artmasına ve osteofit oluşumuna yol açar. Operatörler arasındaki değişkenliği azaltmak ve klinik müdahaleden kaynaklanan kıkırdak hasarını taklit etmek amacıyla, bu modelin modifiye edilmiş bir versiyonu geliştirilmiştir, bu sayede kıkırdak yüzeyine üç yüzeysel çizik şeklinde kontrollü ek hasar verilir6. Bu aynı zamanda bazı klinik müdahalelerin neden olduğu kıkırdak hasarından kaynaklanan OA ilerlemesinin modellenmesine de izin verir. Standart DMM modeliyle karşılaştırıldığında, doğrudan indüklenen kıkırdak hasarı, sürekli olarak hızlandırılmış çıkıntılı osteofit oluşumuna, kıkırdak hasarının ve iltihabının artmasına ve erkek farelerde ölçülebilir vekil ağrıya neden olur.
Bu model özellikle osteofit oluşumu, ağrı sunumu (erkek farelerde), sinovit ve kemik parametrelerindeki erken değişikliklere odaklanan erken evre travma sonrası OA çalışması için uygundur. Bu modelde osteofit oluşumunun tutarlılığı, kemik onarımı ve endokondral ossifikasyonun incelenmesini uygun kılar, çünkü osteofit oluşumu endokondral ossifikasyon yoluyla bir onarım sürecidir7. Model ayrıca artroskopik cerrahi prosedürler gibi klinik müdahaleler sırasında doğrudan kıkırdağa verilen hasarı taklit eder ve bu nedenle kıkırdak hasarının tüm eklem üzerindeki etkisinin incelenmesi için de uygundur.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Glasgow Üniversitesi ve İskoçya Batı Üniversitesi Etik İnceleme Paneli tarafından onaylanmış ve Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 (İngiltere) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada yaklaşık 25 g ağırlığında 10 haftalık C57Bl6/J erkek fareler kullanılmıştır. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Hayvan hazırlığı
NOT: Travma sonrası OA modelleri cinsiyete bağlı olarak önemli farklılıklar gösterdiğinden çalışmanın amacı açısından fare cinsiyetini göz önünde bulundurun 8,9,10.
- Anestezik reaktifin (% 2 izofluran) hazır olduğundan emin olun.
NOT: Enjekte edilebilir anestezi de kullanılabilir11. Ameliyatın hızlı süresi göz önüne alındığında, inhalan anestezi kullanılması önerilir. - Cerrahi kontrol olarak sahte ameliyat edilen yaşa uygun ayrı bir grup kullanın.
NOT: Kontralateral diz cerrahi kontrol (kontralateral bacakta sahte operasyon) olarak kullanılmamalıdır. Bunun hayvan refahı açısından sorunları olabilir ve muhtemelen yürüyüş ve yürüyüş ölçümlerini etkileyecektir. Kontralateral diz, intrinsik kemik parametrelerini normalleştirir12 ve uyarılmış ağrı testleri13'te eşleştirilmiş bir karşılaştırma görevi görür. - Iskeletsel olarak olgun fareler kullanın.
NOT: Çoğu literatür OA'yı 8-12 haftalıkken indükler. Bu çalışmada, fareler 10 haftalıktır.
2. Ameliyat öncesi bakım (cerrahi asistan tarafından yürütülür)
- Farklı bir tesisten taşınırsa, farelerin yeni ortamlarına uyum sağlamaları için cerrahi müdahaleden en az 1 hafta önce bekleyin.
- Tüm yüzeylerin steril olduğundan emin olmak için uygun şekilde belirlenmiş steril bir odada ameliyat yapın (örneğin; ameliyat alanlarını örtmek için steril örtüler kullanın).
NOT: Ameliyat aseptiktir. - Steril aletleri steril perdeler üzerine yerleştirin ve yerleştirin.
- Fareyi tartın.
- Fareyi anestezik bir kafese sokarak ve daha sonra standart bir anestezik teçhizat kullanarak 15 dakikaya kadar% 2 izofloran ekleyerek anesteziyi teşvik edin (bkz.
NOT: Fareyi takmadan önce kafeste "kalıntı" anestezi olmamalıdır. - Anestezi uygulandıktan sonra, fareyi anestezi odasından çıkarın ve kürkü dizin üzerinden, ön ve yan taraflardan orta shin'den uyluğun ortasına kadar küçük saç kesme makineleri ile klipsleyin.
NOT: Arka bacak diz seçimi, operatörün ameliyatı hangi tarafta daha kolay bulduğu tercihine bağlıdır. Bu protokol sol bacakta çalışıyordu. - Farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olun (ayağın sıkışmasına yanıt vermez).
- Tıraş olmuş maruz kalmış cilde antibakteriyel cilt temizleyici (örneğin, klorheksidin veya iyodofor içeren, bakınız Malzeme Tablosu) uygulayarak cildi dezenfekte edin.
- Analjezi için, deri altından 0.05 mg / kg buprenorfin uygulayın.
- Fareyi sırt tarafına yerleştirin, dizini yukarı doğru ameliyat edilmek üzere bırakın ve fare burnunu anestezik teçhizata bağlı nozula yerleştirin.
- Fareyi küçük bir anahtar deliği açıklığına sahip steril bir örtüyle örtün.
- Ameliyat edilecek bacağı, diz 90°'den az bükülmüş, patellar bağ yukarı bakacak ve ayak cerrahi bantla hareketsiz olacak şekilde konumlandırın.
3. Medial menisküs prosedürünün destabilizasyonu ve ardından kıkırdak çiziği
- Patellar ligamente odaklanmak için mikroskopu ayarlayın.
- Diz derisini tırtıklı forseps ile lateral tarafta sıkıştırın (bakınız Malzeme Tablosu), cerrahi makas kullanarak distal patellar tendona paralel küçük bir kesim yapın, makası uygulayın ve kesimi yaklaşık 1 cm'ye genişletin. Cildi medial tarafa doğru hareket ettirin, patellar ligament ve proksimal tibial platoyu açığa çıkarın (Şekil 1).
- 11 numaralı bıçakla, patellar ligamentin medial tarafı boyunca, ligamentin üstünden altına doğru bir kesi yapın (Şekil 1A). Patellar ligamentin dibine ulaştığında, bıçağı 90 ° çevirin ve eklem kapsülüne erişmek için insizyonu patellar ligamentten medial tarafa doğru uzatın.
NOT: Bu veya sonraki adımlarda kanama meydana gelebilir. Kanama meydana gelirse steril bir pamuk tomurcuğu kullanın ve birkaç saniye (5 ila 30 sn) basınç uygulayın. - Patellar ligamenti künt uç forseps ile sıkıştırın ve patellar ligamenti lateral tarafa hareket ettirmek için bileği döndürün, sadece infrapatellar yağ yastığını (IFP) açığa çıkaracak kadar.
NOT: Patellar bağın zarar görmesini en aza indirmek için, cımbızı çok sıkı tutmayın, sadece bağı yana doğru tutmaya yetecek kadar sıkı tutun. - Patellar bağı hala hafifçe tutarken, IFP'yi mikro cımbızla sıkıştırın (bkz. Malzeme Tablosu) ve hafifçe yukarı doğru hareket ettirin. Bu, medial menisküs ligamentinin görselleştirilmesini sağlar.
- Medial menisküsün kraniyal boynuzunu anterior tibial platoya sabitleyen medial menisküsün medial meniskotiyal ligamentini (MMTL) tanımlayın (Şekil 1B).
- Tibial plato veya femoral kondilde hasar ve uzun süreli kıkırdak maruziyetinden kaçının.
- MMTL'yi küçük 2 mm'lik bıçaklı Vannas yaylı makasla dikkatlice ayırın, medial menisküs ve diğer bağları sağlam bırakın. Bu noktada DMM modeli için cerrahi işlem tamamlanmış olur (Şekil 1C).
- 3 mm'lik bir mikrocerrahi bıçakla, tibial eklem kıkırdağı üzerinde posteriordan ön kısma doğru bir yönde eşit aralıklı üç girinti işaretleyin.
NOT: Skorlar yaklaşık 1 mm uzunluğundadır ve sadece kıkırdağın yüzeyine zarar verir (Şekil 2D).- Bıçakla kıkırdak üzerine aşırı kuvvet kullanmayın (yani, çiziklerin yüzeysel olduğundan emin olun). Bu ek adım, DCS modelini indükleyerek kıkırdak hasarına neden olur.
- Cildi iki veya üç küçük 7 mm yara kapatma metal klipsi veya emilebilir 6-0 subdermal cerrahi dikişle kapatın (bkz.
NOT: Subdermal cerrahi dikişler, daha fazla müdahaleden kaçındıkları için daha iyidir, ancak ameliyat süresini uzatırlar. Dış dikişler, farelerin kemirilmesiyle yara açma riskini arttırır. - Sahte cerrahi için medial menisküsün medial meniskotibiyal ligamentini tanımlayın, ancak kopmayın.
- Sadece kıkırdak çizikleri alan fareler için, bağı kesmeden üç yüzeysel çizik yapın.
NOT: Her fare arasında, eldivenleri değiştirin ve aletleri otoklav ile sterilize edin. Yeniden kullanmadan önce cihazların soğuduğunu kontrol etmeyi unutmayın.
4. Ameliyat sonrası bakım
- Kanama meydana geldiyse (>50 uL), deri altından (farenin arkasına) 500 μL ılık steril salin enjekte edin.
NOT: Deneyimlerimize göre, farelerin küçük kanamaları olmasına rağmen, asla küçük bir damladan fazlası değildir ve bu nedenle sıvıların yenilenmesi gerekmez. - Ameliyattan sonra, fareyi temiz bir kağıt mendil üzerindeki bir iyileşme kafesine yerleştirin ve anesteziden kurtulmaya izin verin (5-10 dakika).
- Tam bilinçli fareleri ameliyattan sonra taze yataklarla temiz bir kafese aktarın.
- Cerrahi müdahaleden sonraki 72 saat içinde, herhangi bir ağrı veya sıkıntı belirtisi olup olmadığını izleyin. Şunlara dikkat edin:
- Vücut ağırlığındaki değişiklikler. Vücut ağırlığı birinci ve ikinci günde azalabilse de, bu genellikle ameliyat öncesi vücut ağırlığının% 5'inden fazla değildir.
- Genel olarak tımar eksikliği veya insizyon çevresinde aşırı tımar yapılması.
- Kambur duruş, yüz burkulması ve / veya anormal solunum gibi genel sağlık bozulması belirtileri.
- Yaranın herhangi bir şişmesi, boşalması veya açılması ile belirtildiği gibi yara enfeksiyonu.
NOT: Cerrahi yara açılırsa enfeksiyon oluşabilir. Cerrahi yara onarımı (örneğin, eksik metal klipslerin değiştirilmesi veya yeniden dikiş) düzenlenmiş bir prosedür olduğundan, onarımları gerçekleştirmeden önce ilgili onayın alındığından emin olun.
- Ameliyattan 5-7 gün sonra metal klipsleri çıkarın.
- Çalışma tasarımına bağlı olarak fareleri tipik olarak ameliyat sonrası 2-52 hafta boyunca koruyun.
- Çalışma sırasında herhangi bir noktada ağrı / yürüyüşü değerlendirin.
NOT: Bu çalışma, adım 5.1'de açıklandığı gibi dinamik ağırlık yatağını kullanmaktadır. - Hayvanı, ulusal lisans anlaşmalarına, yerel yönergelere ve deneysel onaya göre onaylanmış bir yöntemle ötenazileştirin.
NOT: Bu çalışmada, hayvanlar terminal anestezi altında ekssanguinasyon (kardiyak ponksiyon) yoluyla ötenazi yapıldı ve ardından servikal çıkık14.
5. Osteoartritik hastalığın değerlendirilmesi
- Aşağıdaki adımları izleyerek dinamik ağırlık taşımayı ağrının vekil ölçümü olarak ölçün.
NOT: Fareler av hayvanları olduklarından, ağrı davranışlarını gizleme eğilimindedirler. Bu, ağrının ölçülmesini zorlaştırır. Von Frey15 ve yürüyüş analizi16 gibi uyarılmış ağrıyı ölçmenin birçok yolu vardır. Bu çalışma, fare kafesteyken ameliyat edilen osteoartritik bacak ile ameliyat edilmemiş kontrol bacağı arasındaki diferansiyel yükü basınç paspası üzerinde ölçmüştür (bkz.- Fareyi tartın. Basınç paspasını üreticinin özel talimatlarına göre dara alın ve kalibre edin ( Malzeme Tablosundaki Dinamik ağırlık taşıyan ekipmana bakın). Fareyi kafese sok.
- Farenin hareketini ve pençe basıncını kafeste 5 dakika boyunca kaydedin. Üreticinin talimatlarını izleyerek 1 dakika doğrulamak için elde edilen verileri analiz edin.
NOT: Üreticinin DWB yazılımı üzerindeki otomatik analizi ( Malzeme tablosundaki dinamik ağırlık taşıyan ekipmana bakın), toplam vücut ağırlığı, her bir pençenin paspas üzerinde kaldığı doğrulanmış sürenin miktarı ve her pençenin kapladığı paspas alanının tahmini ile orantılı olarak her pençe üzerinde ölçümler sağlar. Bu, iki arka pençe arasındaki diferansiyel yükün, ön ve arka pençeler arasındaki diferansiyel yükün, ön pençe yüklemesinin artmasına (aynı fare belirli bir süre boyunca ölçülmüşse), OA ayağını kontralateral bacağa ve pençe yüzeyine kıyasla kaldırmak için harcanan sürenin hesaplanmasına izin verir.
- Mikrobilgisayarlı tomografi (μBT) ile kalsifiye dokuyu sayısallaştırın.
NOT: Subkondral kemik osteoskleroz ve osteofit oluşumu histolojik kesitlerde ölçülebilse de, μBT üç boyutlu olarak ölçme fırsatı sunar. 5 μm'de μCT'de görüntü yakalama çözünürlüğü yeterlidir, çünkü bu, osteofitler gibi daha küçük yapıların görselleştirilmesine izin verir, ancak çözünürlük ne kadar yüksek olursa o kadar iyidir.- Diz eklemlerini 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisinde sabitleyin, ardından% 70 EtOH'ye aktarın.
- Diz eklemlerini μCT tarayıcıda tarayın.
NOT: Bu çalışmada, numuneler 50 kV ve 200 μA'da ayarlanmış 0,5 alüminyum filtre ile bir μCT tarayıcıda (bakınız Malzeme Tablosu) taranmıştır. 2 μm, görüntüleme için 0,2° dönüş açısı ve niceleme için 0,5° dönüş açısı. - 3B görselleştirmeye izin vermek için taramaları yeniden oluşturun. Burada sunulan taramalar uyumlu yazılımlar kullanılarak yeniden oluşturulmuştur (bkz.
- Aşağıdaki adımları izleyerek subkondral kemik sklerozunu (Şekil 2B) analiz edin.
- Medial tibial plato17'nin yükünün merkezinde 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm arasında bir ilgi hacmi (VOI) seçin.
- Ameliyat edilmemiş bacağı analiz ederek farenin intrinsik kemik fenotipine karşı normalleştirin.
- CTan yazılımını kullanarak yığının iki boyutlu koronal görünümünde tibial epifiz, subkondral plaka veya toplam subkondral kemik içindeki trabeküler yapıyı tanımlayan bir ilgi bölgesi (ROI) seçerek subkondral kemik yoğunluğunu ve mikro-mimariyi belirleyin (bkz.
NOT: Hastalık ilerledikçe, subkondral plaka ve subkondral trabeküler bölge arasındaki ayrımı ayırt etmek daha zor hale gelir. Daha sonra eklem boşluğundan büyüme plakasına seçilen subkondral kemik alanının analiz edilmesi önerilir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek osteofitleri (Şekil 2C) sayısallaştırın.
- CTvol yazılımını kullanarak yeniden yapılandırılmış üç boyutlu görüntü yığınlarındaki osteofitleri tanımlayın (bkz.
NOT: Mineralize osteofitler, subkondral kemiğin medial tarafında görülebilen dokuma kemiğe benzer çıkıntılardır18. Bunlara bir örnek Şekil 2C'de sarı oklarla gösterilmiştir. - Diz ekleminin medial tarafında tanımlanan osteofitlerin sayısını manuel olarak sayın.
- 2D sıralı görüntü analizinde (BT analizörü kullanarak) osteofit hacmini, osteofitlerin kenarını manuel olarak tanımlayarak, subkondral plakadan analiz için ilgi alanı (ROI) olarak çıkıntı yaparak ölçün.
- BT analizör yazılımını kullanarak osteofit kemik yoğunluğunu, kemik hacminin osteofit hacmine oranı olarak hesaplayın (bkz.
- CTvol yazılımını kullanarak yeniden yapılandırılmış üç boyutlu görüntü yığınlarındaki osteofitleri tanımlayın (bkz.
- Parafin gömülü 6 μm kesitlerde kıkırdak hasarı ve sinovit skorunu OARSI kıkırdak hasar skoru19 ve sinovit skoru20'ye göre değerlendirin.
- Taradıktan sonra, diz eklemlerini en az 2 hafta boyunca 4 ° C'de% 10 EDTA'da dekalsifiye edin ve haftada iki kez çözeltiyi değiştirin.
- Örnekleri parafine gömün. Tedaviler ve kuluçka süreleri için Ek Dosya 1'e bakınız.
- Parafin gömülü numunelerin 5 μm koronal kesitini döner bir mikrotom üzerinde kesin (bkz.
- Tibial ve femoral kondillerin buluştuğu alanda bölümleri seçin (Şekil 2D). Eklemin eşit mesafeli üç bölgesinde iki bölüm seçin.
NOT: Bu çalışmada puanlanan kesitler 80-100 μm aralıklarla seçilmiştir. - Aşağıdaki adımları izleyerek Safranin-O ve Hızlı yeşil olan leke bölümleri ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Bölümleri 5 dakika (2x) boyunca Ksilen'e batırarak (belirtilen sırayla), 2 dakika boyunca% 100 etanol, 2 dakika için% 95 etanol, 2 dakika için% 80 etanol ve 2 dakika boyunca% 70 etanol batırarak deparafinize edin.
- 30 sn için filtrelenmiş Hematoksilin ile leke (bakınız Malzeme Tablosu). Daha sonra musluk suyunda 5 dakika (üç kez) durulayın.
- Scott tamponu (1 L damıtılmış suda 2 g sodyum bikarbonat ve 10 g magnezyum sülfat) ile 2 dakika boyunca yıkayın. 'Musluk suyunda' 5 dakika (üç kez) durulayın.
- % 0.2 Hızlı yeşil ile 4 dakika boyunca leke. % 1 buzul asetik asidine batırın, beş kez (her seansta taze olarak yapılır). Musluk suyunda hızlıca durulayın.
- % 0,5 Safranin-O ile 5 dakika boyunca leke. % 95 etanol içinde durulayın. Bölümleri 3 dakika boyunca% 100 etanolde kurutun, ardından Ksilen'de 3 dakika izleyin.
- Kıkırdak19 için Glasson ve ark.'da ve sinovit20 için Jackson ve ark.'da belirtildiği gibi skor bölümleri.
NOT: Pinamont ve ark.21'in bilgisayar tabanlı nicelleştirmesi gibi başka niceleme yöntemleri de mevcuttur. - Puanlama sistemini, denemeye kör olmuş iki farklı puanlayıcıyla doğrulayın.
Representative Results
Arka operasyonlu/OA bacağın toplam vücut ağırlığı başına düşen yüzde yükü, kontralateral/kontrol bacağı ile karşılaştırıldı. Cerrahi müdahaleden sonra ön pençe yükündeki artış gibi diğer parametreler de önemli farklılıklar gösterebilse de, arka pençe yükündeki tutarlı bir değişiklik, bir bacağın diğerine göre kullanılması tercihini gösterir ve OA gelişimi nedeniyle fare için önemli bir rahatsızlığın daha doğrudan bir göstergesidir. DMM modelinde indüksiyondan sonraki 8 hafta içinde arka bacak yükünde anlamlı bir değişiklik olmazken, DCS fareleri müdahaleden 2 hafta sonra kontralateral/kontrol bacağını önemli ölçüde desteklemektedir (Şekil 3A).
Subkondral kemik, tibial kondilin medial yüklü bölgesi altındaki hacme odaklanarak analiz edildi. Burada mineralize kemiğin ilgili bölgedeki yüzdesini belirleyerek bu bölgenin kemik yoğunluğunu değerlendirdik ve kontralateral ve ipsilateral bacak arasındaki oranı hesapladık. Bu oran, her iki modelin de indüksiyondan 4 hafta sonra etkilenen ekstremitede kemik yoğunluğunun arttığını (oran 1'in üzerinde) göstermektedir (Şekil 3B). Osteofitlerin ortaya çıkışı, müdahaleden 2 hafta sonra DMM modeline kıyasla sayı ve hacimde önemli bir artışın olduğu DCS modelinde daha belirgindir (Şekil 3C, D). DCS, indüksiyondan 4 hafta sonra medial tibial ve femoral kompartmanlarda ve sinovitte yüksek kıkırdak hasarı gösterir (Şekil 3E,F).
Şekil 1: Farda travma sonrası OA'yı indüklemek için cerrahi müdahale. Sıralı görüntüler prosedürün farklı aşamalarını temsil eder. (A) Patellar ligamentin medial tarafına ve ligamentten uzağa 11 numaralı neşter bıçağı yerleştirilerek diz çevresindeki yüzeysel zarı kesen eklem kapsülünün maruz kalması. Bu, infrapatellar yağ yastığını ortaya çıkaracaktır. (B) Medial meniskotibiyal ligamentin tanımlanması ve transeksiyonu. Ligamenti tanımlamak için, patellar ligamenti lateral tarafa doğru hareket ettirin ve ardından yağ yastığını yukarı doğru itin. Bu, ligamentin tibial kondilin hemen üzerinde küçük bir yatay beyaz çizgi olarak görselleştirilmesini sağlar (burada siyah bir okla gösterilir). Ligamenti kesmek için, yay makasının alt bıçağı, kıkırdağa zarar vermemeye özen göstererek bağın altına yerleştirilir. Tibial kondili görselleştirmek için menisküsü medial tarafa doğru hareket ettirin. (C) Açıkta kalan kıkırdağın yüzeyinin çizilmesi ve yaranın kapatılması. Kıkırdağı çizmek için, mikrobıçak arka tarafa doğru yerleştirilir, burada kıkırdakla temas eder ve daha sonra eklemin ön kısmına doğru ilerler. Çizikler yapıldıktan sonra, cildi dizin üzerinden çekin ve yarayı subdermal dikişle veya yara klipsleriyle kapatın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Faredeki osteoartritin değerlendirilmesi . (A) Dinamik ağırlık taşıma, bir basınç paspası üzerindeki yükün karşılık gelen pençe ile eşleştirilmesinden oluşur. Yük daha sonra toplam ağırlığın yüzdesi olarak ifade edilir. (B) Subkondral kemik, medial tibial kondilin yükleme bölgesinde bir ilgi hacmi seçilerek ve subkondral plaka veya trabeküler kemik seçilerek ölçülür. Bu görüntüler 4.5 μm çözünürlüktedir. (C) Osteofitler, elde edilen μCT görüntülerinin üç boyutlu bir görünümünde tanımlanır ve ölçülür. Osteofitlerin hacmi, osteofitin kenarını tanımlayan bir ROI seçilerek ölçülür. Kemik yoğunluğu, osteofit hacmi başına kemik hacmi olarak hesaplanır. Burada sunulan görüntüler 2 μm çözünürlükte çekilmiştir, ancak niceleme genellikle 4,5 μm çözünürlükte yapılır. (D) Kıkırdak ve sinovit skorları Safranin-O ve Fast green ile boyanmış 6 μm kesitten alınır. Fare dizinin, kara kutu ile işaretlenmiş tüm kadranların puanlama için görülebildiği ve medial tarafın büyütülmesinin gösterildiği koronal bir bölümü. Diz ekleminin medial tarafını çevreleyen sinovit, özellikle yer değiştirmiş menisküsün üstünde ve altında da görülebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DMM ve DCS modellerinde OA'nın temsili değerlendirmesi. (A) DWB, aynı uzman operatör tarafından gerçekleştirilen deneylerde indüksiyondan 8 hafta sonrasına kadar ölçülmüştür. Yük, çalıştırılan/OA yükü ile kontralateral/kontrol yükü arasındaki oran olarak ifade edilir. Her iki bacağın eşleştirilmiş t-testleri Sham (gri), DMM (mavi) ve DCS (pembe) modellerinde de gösterilmiştir. Cerrahi müdahaleden 4 hafta sonra μBT analizi. (B) Subkondral kemik cerrahi müdahaleden 4 hafta sonra analiz edildi ve ipsilateral %BV/TV yerine ipsilateral oranı olarak ifade edildi. (C) Osteofit sayısı ve (D) osteofit hacmi indüksiyondan 2 hafta sonra analiz edildi. Medial tibial ve femoral eklem kıkırdağının (E) kıkırdak hasarı ve (F) sinovitinin indüksiyonundan 4 hafta sonra yapılan histolojik değerlendirme standart yöntemlerle puanlandı19,20. Veriler ortalama ± standart sapma, n ≥ 5 olarak ifade edilir. Veriler, tekrarlanan ölçümler ANOVA ile bir Šídák test düzeltmesi (A), eşleştirilmiş t-testi (A) veya standart Student's t-testi (B-F) ile karşılaştırıldı. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = anlamlı değildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Parafin gömme için tedavi ve kuluçka durumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Travma sonrası osteoartritin (PTOA) cerrahi indüksiyonunu gerçekleştirmek için, bir asistandan destek alınması şiddetle tavsiye edilir (örneğin, operatör ameliyata odaklanırken fareleri hazırlamak için). Bu, aseptik cerrahiyi kolaylaştırır, böylece enfeksiyon risklerini azaltır ve müdahaleyi büyük deneylerde daha verimli hale getirir. Ameliyat sırasında odak düzlemini kaybetmek kolaydır, bu nedenle odaklanma için pedallar içeren bir mikroskop, ameliyat boyunca sterilitenin korunmasına yardımcı olmak için değerli bir özelliktir. Farenin ve dizin konumu çok önemlidir. Diz, diz eklemi boşluğunun açılmasını en üst düzeye çıkarmak için yukarı bakacak ve yeterince bükülmüş olmalı, bu da kondil yüzeyini çizmek için mikrobıçağın sokulması için bağa daha kolay erişimi kolaylaştırmalıdır. MMTL'yi tanımlamak, özellikle yağ yastığı normalden daha büyük olduğunda veya küçük bir kanama olduğunda zor olabilir. Kanamayı önlemek için, gözyaşlarını ve ardından kanamayı önlemek için yağ yastığını yukarı doğru itin. Yağ yastığı büyükse, bu biraz daha uzun sürebilir, ancak sabırla yukarı doğru itmeye devam edin.
MMTL, tibial kondille oldukça yakındır, bu nedenle kavisli yay makasının alt bıçağını MMTL'nin altına yerleştirirken kıkırdağa zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Kavisli bıçaklar medial tarafa doğru ve kondille paralel olarak hafifçe yukarı doğru işaret etmelidir. MMTL'nin en iyi şekilde kesilmesi için, makasın keskin olduğundan emin olun. Menisküsün bağı kestikten sonra medial olarak hareket edebildiğini kontrol edin, çünkü bazen daha fazla kesim gerektiren küçük bir ataşman kalır. Kondili çizmek için mikro bıçağı yerleştirirken, kondilin diline dik olmalıdır. İlk çiziği eklemin ortasına yaklaştırın, ancak ön çapraz bağa zarar vermemeye dikkat edin. Sonra medial tarafa doğru ve sonra menisküsün arkasına doğru ilerleyin. Çizikler kıkırdak üzerinde soluk beyaz çizgiler olarak görülebilir. Genellikle klips kullandığımız için ilk kesi lateral tarafta yapılır, bu nedenle klipsler yarayı kapattıktan sonra bacağın yan tarafına yerleştirilir. Bu, fare hareketi yeniden kazanırken klipslerin dizini ovalamasını önler. Dikiş kullanırken, subdermal dikişlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Dış dikişler kullanılıyorsa, farelerin dikişleri kemirmesi ve yaralarını açması muhtemeldir, bu da enfeksiyon olasılığını artıracaktır. Doğru yapıldığında, bu ameliyat kesiden yara kapanmasına kadar 5-10 dakikadan fazla sürmemeli, böylece kıkırdağın maruz kalmasını ve oluşabilecek kontrolsüz hasarları en aza indirgemelidir. Ameliyattan sonra, fareler çok hızlı bir şekilde iyileşir ve neredeyse hemen kafese tırmanabilir ve normal şekilde hareket edebilir. Fareler aktif değilse, ünitedeki uygun uzmana danışılmalıdır.
Ağrının davranışsal değerlendirmesi için, dinamik ağırlık taşıyan değerlendirildi. Bununla birlikte, bu yöntem, von Frey testi15 gibi diğer uyarılmış ağrı testlerinden daha az hassas olarak kabul edilebilir. Ağrıyı izlemek ve değerlendirmek için birden fazla yöntemin kullanılması önerilir. DCS'ye müdahaleden 2 hafta sonra gözlenen değişiklikler, geçici olsa da, OA bacağının sağlıklı bacağa kıyasla genel olarak azalmış bir yüklenmesini göstermektedir. Bu nedenle, DCS müdahalesinden 2 hafta sonra, fare modellerinde erken osteoartritik veya yaralanma ağrısını değerlendirmek için kullanılabilir. Mineralize osteofitlerin μCT ile görselleştirilmesi, histolojik bölüm12 ile de eşleştirilebilen üç boyutlu nicelemeye izin verir ve osteofit ortaya çıkışı ve evrimi çalışmasına başka bir boyut ekler. Bizim grubumuzda, osteofit varlığı operatörler arasında ve içinde DMM modelinde değişkendi (2.3 ± 1'e karşı 1.2 ± 1, n > 7, P = 0.0183), DCS'nin indüksiyonu operatörden bağımsız olarak tüm vakalarda osteofit oluşumuna güçlü bir şekilde yol açtı (2.6 ± 0.7'ye karşı 2.4 ± 0.5, n > 7, P = 0.711). Ayrıca, DCS modelinde DMM'ye kıyasla önemli ölçüde daha fazla ve daha büyük osteofitler vardır. Bu nedenle, DCS osteofit oluşumunun incelenmesi için ideal bir modeldir. Subkondral kemiğin yükleme alanıyla sınırlı osteosklerozun nicelleştirilmesi de küçük değişikliklerin saptanmasında bir gelişmedir. Ameliyat edilen bacağın medial bölmesini kontralateral bacakla karşılaştırmak, aynı zamanda o farenin intrinsik kemik fenotipine karşı normalleşmenin bir yolunu sunar12. DCS modelinde kıkırdak çiziklerinin eklenmesi, hastalığın birçok yönünü hızlandıran ameliyat sırasında odaklanmış kıkırdak hasarını indüklemenin kontrollü bir yoludur. Kıkırdağın kendisine kasıtlı hasar veren deneysel prosedürün sonuçlarından biri, bu artefolgusal hasarın kıkırdak derecelendirme sisteminde dışlanması veya ayarlanması gerektiğidir. Bu sınırlama nedeniyle, çalışmanın asıl amacı osteoartritin kıkırdağın kendisi üzerindeki etkisini anlamaksa, bu modeli önermiyoruz. Son olarak, en az iki kör skorerin kıkırdak hasarı ve sinovit skorlarını derecelendirmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu, puanlama sistemlerinin standardizasyonunu doğrular ve geliştirir.
Bu çalışmanın bir sınırlaması, DCS ve DMM modellerini karşılaştıran tüm parametrelerdeki değişkenlik derecesinin tam olarak değerlendirilmemiş olmasıdır. Bu, gelecekte, farklı kurumlardan operatörler arasındaki değişkenliğin bir değerlendirmesini de içerebilecek daha kapsamlı çalışmalarla ele alınacaktır.
Sonuç olarak, mevcut DCS modelinde hızlandırılmış OA patogenezi, travma sonrası OA'nın temsiline izin vermekte ve bu kronik zayıflatıcı eklem hastalığını yönlendiren altta yatan OA patofizyolojik mekanizmalarını araştırmak ve aydınlatmak için güçlü ve sağlam bir araştırma aracı sağlamaktadır. Ek olarak, OA'nın osteofitogenez, OA ağrısı ve kıkırdak hasarının tüm eklem üzerindeki etkisine odaklanarak daha kısa sürede araştırılmasını sağlar.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu yayında kullanılan μCT görüntülerini edinen Liverpool Üniversitesi'nden Gemma Charlesworth ve Mandie Before'un çalışmalarına teşekkür ederiz. Çalışma Versus Arthritis tarafından finanse edildi (hibeler 20199 ve 22483). Lynette Dunning, Versus Arthritis (hibe 20199) tarafından finanse edildi. Kendal McCulloch, UWS doktora bursu ile finanse edildi. Carmen Huesa, Versus Arthritis (hibeler 20199 ve 22483) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B.
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
