Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die kontrollierten Mikroklingenkratzer auf der Oberfläche des Gelenkknorpels nach Destabilisierung des Mausknies durch Schneiden des medialen Miniscotibialbandes. Dieses Tiermodell stellt eine beschleunigte Form der Osteoarthritis (OA) dar, die für die Untersuchung der Osteophytenbildung, Osteosklerose und Schmerzen im Frühstadium geeignet ist.
Abstract
Arthrose ist die häufigste Muskel-Skelett-Erkrankung bei Menschen über 45 Jahren, was zu steigenden wirtschaftlichen und gesellschaftlichen Kosten führt. Tiermodelle werden verwendet, um viele Aspekte der Krankheit nachzuahmen. Das vorliegende Protokoll beschreibt das Destabilisierungs- und Knorpelkratzmodell (DCS) der posttraumatischen Arthrose. Basierend auf dem weit verbreiteten Modell der Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) führt DCS drei Kratzer auf der Knorpeloberfläche ein. Der aktuelle Artikel beleuchtet die Schritte zur Destabilisierung des Knies durch Transektion des medialen meniscotibialen Bandes, gefolgt von drei absichtlichen oberflächlichen Kratzern am Gelenkknorpel. Die möglichen Analysemethoden mittels dynamischer Belastung, Mikrocomputertomographie und Histologie werden ebenfalls demonstriert. Während das DCS-Modell nicht für Studien empfohlen wird, die sich auf die Wirkung von Osteoarthritis auf den Knorpel konzentrieren, ermöglicht es die Untersuchung der Arthroseentwicklung in einem kürzeren Zeitfenster, mit besonderem Fokus auf (1) Osteophytenbildung, (2) osteoarthritische und Verletzungsschmerzen und (3) die Wirkung von Knorpelschäden im gesamten Gelenk.
Introduction
Osteoarthritis (OA) ist die häufigste Muskel-Skelett-Erkrankung bei Menschen über 45, mit über 8,75 Millionenin Großbritannien Behandlung 1. Die zunehmende Prävalenz der Krankheit hat zu erhöhten wirtschaftlichen und gesellschaftlichen Kosten geführt, trägt wesentlich zur Behinderung bei und verringert die Lebensqualität der Patienten1. Ohne verfügbare Behandlungen besteht ein dringender Bedarf, die Forschung zu beschleunigen, um die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit zu verstehen. Die Krankheit ist komplex und auch multifaktoriell in ihrer Natur. Die wichtigsten klinischen Messungen der Krankheit sind Schmerzen und Gelenkbeweglichkeit2, und OA betrifft alle Gewebe im Gelenk, nicht nur den Knorpel3. Eine der größten Herausforderungen beim Verständnis von OA besteht darin, dass es Jahre, manchmal Jahrzehnte dauern kann, von der ersten Präsentation / Verletzung bis zum symptomatischen Krankheitsverlauf mit Schmerzen und Immobilität.
Die Modellierung von Arthrose bei Nagetieren hat unser Wissen über OA-Pathophysiologie erweitert, indem es uns ermöglicht, die Initiierung und Progression in einem viel kürzeren Zeitrahmen und mit einer detaillierten Untersuchung der beteiligten Gewebe zu verstehen. Es gibt zahlreiche murine Modelle der Arthrose, von gentechnisch veränderten Tieren bis hin zu chirurgischen Eingriffsmodellen. Das am weitesten verbreitete murine Modell der posttraumatischen OA ist die Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM)4,5. Ein Vorbehalt des Modells ist die Variabilität zwischen verschiedenen Operatoren. Erfahrene Chirurgen können den Eingriff mit minimalen Gelenkschäden durchführen, während unerfahrene Bediener die Gelenkkapsel für längere Zeit freilegen und den Knorpel schädigen. Diese Variabilität im Prozess beeinflusst die Schwere des Modells, wobei mehr Anfangsschäden zu erhöhten Knorpelschäden und Osteophytenbildung führen. Mit der Absicht, die Variabilität zwischen den Bedienern zu reduzieren und Knorpelschäden durch klinische Eingriffe nachzuahmen, wird eine modifizierte Version dieses Modells entwickelt, bei der kontrollierte zusätzliche Schäden an der Knorpeloberfläche in Form von drei oberflächlichen Kratzern zugefügt werden6. Dies ermöglicht auch die Modellierung der OA-Progression, die aus Knorpelschäden resultiert, die durch einige klinische Eingriffe verursacht werden. Im Vergleich zum Standard-DMM-Modell führt die direkt induzierte Knorpelschädigung zu einer konsequent beschleunigten protrudierenden Osteophytenbildung, erhöhten Knorpelschäden und Entzündungen sowie messbaren Ersatzschmerzen bei männlichen Mäusen.
Dieses Modell eignet sich besonders für die Untersuchung der posttraumatischen OA im Frühstadium mit Schwerpunkt auf Osteophytenbildung, Schmerzpräsentation (bei männlichen Mäusen), Synovitis und frühen Veränderungen der Knochenparameter. Die Konsistenz der Osteophytenbildung in diesem Modell macht es relevant, Knochenreparatur und endochondrale Ossifikation zu untersuchen, da die Osteophytenbildung ein Reparaturprozess durch endochondrale Ossifikation ist7. Das Modell ahmt auch Schäden nach, die bei klinischen Eingriffen wie arthroskopischen chirurgischen Eingriffen direkt in den Knorpel eingebracht werden, und eignet sich daher auch für die Untersuchung der Auswirkungen von Knorpelschäden auf das gesamte Gelenk.
Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden vom Ethical Review Panel der University of Glasgow und der University of the West of Scotland genehmigt und gemäß den Richtlinien des Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 10 Wochen alte männliche C57Bl6/J-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 25 g verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Tierische Zubereitung
HINWEIS: Berücksichtigen Sie das Geschlecht der Maus in Bezug auf den Zweck der Studie, da posttraumatische OA-Modelle wichtige Unterschiede je nach Geschlechtaufweisen 8,9,10.
- Stellen Sie sicher, dass das Anästhesiereagenz (2% Isofluran) bereit ist.
HINWEIS: Injizierbare Anästhesie kann auch verwendet werden11. Angesichts der kurzen Dauer der Operation wird die Verwendung einer Inhalationsanästhesie empfohlen. - Verwenden Sie eine separate scheinoperierte altersangepasste Gruppe als chirurgische Kontrolle.
HINWEIS: Das kontralaterale Knie darf nicht als chirurgische Kontrolle (Scheinoperation am kontralateralen Bein) verwendet werden. Dies kann Probleme in Bezug auf das Tierwohl haben und sich wahrscheinlich auf Gang- und Gangmessungen auswirken. Das kontralaterale Knie normalisiert intrinsische Knochenparameter12 und fungiert als gepaarter Vergleich bei evozierten Schmerztests13. - Verwenden Sie skelettreife Mäuse.
HINWEIS: Die meiste Literatur induziert OA im Alter von 8-12 Wochen. In der vorliegenden Studie sind die Mäuse 10 Wochen alt.
2. Präoperative Betreuung (durchgeführt durch einen chirurgischen Assistenten)
- Wenn Sie von einer anderen Einrichtung transportiert werden, lassen Sie die Mäuse mindestens 1 Woche vor dem chirurgischen Eingriff an ihre neue Umgebung gewöhnen.
- Führen Sie die Operation in einem entsprechend gekennzeichneten sterilen Raum durch, um sicherzustellen, dass alle Oberflächen steril sind (z. B. sterile Abdecktücher verwenden, um chirurgische Bereiche abzudecken).
HINWEIS: Die Operation ist aseptisch. - Sterile Instrumente arrangieren und auf sterile Vorhänge legen.
- Wiegen Sie die Maus.
- Induzieren Sie die Anästhesie, indem Sie die Maus in einen Anästhesiekäfig einführen und dann 2% Isofluoran für bis zu 15 Minuten mit einem Standard-Anästhesiegerät einführen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Der Käfig darf vor dem Einführen der Maus keine "Restanästhesie" haben. - Nach der Betäubung nehmen Sie die Maus aus der Anästhesiekammer und schneiden Sie das Fell mit kleinen Haarschneidemaschinen über das Knie, die Vorder- und Seitenseite vom mittleren Schienbein bis zur Mitte des Oberschenkels.
HINWEIS: Die Wahl des Hinterschenkelknies hängt von der Präferenz des Bedieners ab, auf welcher Seite er die Operation leichter durchführen kann. Dieses Protokoll wurde am linken Bein operiert. - Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig betäubt ist (reagiert nicht auf das Einklemmen des Fußes).
- Desinfizieren Sie die Haut durch Auftragen eines antibakteriellen Hautreinigers (z. B. mit Chlorhexidin oder Iodophor, siehe Materialtabelle) auf rasierte exponierte Haut.
- Zur Analgesie 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan verabreichen.
- Legen Sie die Maus auf die Rückenseite, lassen Sie das Knie nach oben operieren, und setzen Sie die Mausnase in die Düse, die mit dem Anästhesiegerät verbunden ist.
- Bedecken Sie die Maus mit einem sterilen Vorhang mit einer kleinen Schlüssellochöffnung.
- Positionieren Sie das zu operierende Bein mit weniger als 90° gebeugtem Knie, das Patellaband nach oben gerichtet und den Fuß mit OP-Tape immobilisiert.
3. Destabilisierung des medialen Meniskusverfahrens mit anschließendem Knorpelkratzer
- Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es sich auf das Patellaband konzentriert.
- Drücken Sie die Haut des Knies an der Seitenseite mit einer gezackten Pinzette ein (siehe Materialtabelle), machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt parallel zur distalen Patellasehne, führen Sie die Schere ein und erweitern Sie den Schnitt auf ca. 1 cm. Bewegen Sie die Haut auf die mediale Seite, wobei das Patellaband und das proximale Tibiaplateau freigelegt werden (Abbildung 1).
- Machen Sie mit einer Klinge der Nummer 11 einen Schnitt entlang der medialen Seite des Patellabandes, von oben nach unten des Bandes (Abbildung 1A). Wenn Sie den Boden des Patellabandes erreichen, drehen Sie die Klinge um 90° und verlängern Sie den Schnitt weg vom Patellaband in Richtung mediale Seite, um Zugang zur Gelenkkapsel zu erhalten.
HINWEIS: In diesem oder den nachfolgenden Schritten können Blutungen auftreten. Wenn Blutungen auftreten, verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen und üben Sie einige Sekunden Druck aus (5 bis 30 s). - Kneifen Sie das Patellaband mit einer stumpfen Pinzette und drehen Sie das Handgelenk, um das Patellaband zur lateralen Seite zu bewegen, gerade genug, um das infrapatellare Fettpolster (IFP) freizulegen.
HINWEIS: Um Schäden am Patellaband zu minimieren, halten Sie die Pinzette nicht zu fest, nur ausreichend, um das Band zur Seite zu halten. - Während Sie das Patellaband immer noch leicht halten, kneifen Sie das IFP mit einer Mikropinzette (siehe Materialtabelle), um es anzuheben und leicht nach oben zu bewegen. Dies ermöglicht die Visualisierung des medialen Meniskusbandes.
- Identifizieren Sie das mediale meniscotibialband (MMTL) des medialen Meniskus, das das Hirnhorn des medialen Meniskus am vorderen Tibiaplateau verankert (Abbildung 1B).
- Vermeiden Sie Schäden und längere Knorpelexposition am Tibiaplateau oder am Oberschenkelkondylen.
- Durchtrennen Sie die MMTL vorsichtig mit einer kleinen Vannas-Federschere mit 2 mm Klinge, wobei der mediale Meniskus und andere Bänder intakt bleiben. An diesem Punkt ist der chirurgische Eingriff für das DMM-Modell abgeschlossen (Abbildung 1C).
- Markieren Sie mit einem 3 mm mikrochirurgischen Messer drei gleichmäßig verteilte Vertiefungen auf dem Tibiagelenkknorpel in Richtung vom hinteren zum vorderen Teil.
HINWEIS: Die Ritzen sind etwa 1 mm lang und beschädigen nur die Oberfläche des Knorpels (Abbildung 2D).- Üben Sie keine übermäßige Kraft mit der Klinge auf den Knorpel aus (d. H. Stellen Sie sicher, dass die Kratzer oberflächlich sind). Dieser zusätzliche Schritt verursacht Knorpelschäden und induziert das DCS-Modell.
- Verschließen Sie die Haut mit zwei oder drei kleinen 7 mm Wundverschluss-Metallclips oder resorbierbaren 6-0 subdermalen chirurgischen Nähten (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Subdermale chirurgische Nähte sind besser, da sie weitere Eingriffe vermeiden, aber sie verlängern die Operationsdauer. Äußere Nähte erhöhen das Risiko einer Wundöffnung durch das Nagen der Mäuse. - Identifizieren Sie das mediale meniscotibialband des medialen Meniskus für eine Scheinoperation, aber nicht durchtrennen.
- Für Mäuse, die nur Knorpelkratzer erhalten, machen Sie die drei oberflächlichen Kratzer, ohne das Band zu durchtrennen.
HINWEIS: Wechseln Sie zwischen jeder Maus die Handschuhe und sterilisieren Sie die Instrumente im Autoklaven. Denken Sie daran, vor der Wiederverwendung zu überprüfen, ob die Instrumente abgekühlt sind.
4. Nachsorge
- Wenn Blutungen aufgetreten sind (>50 μL), injizieren Sie 500 μL warme sterile Kochsalzlösung subkutan (auf dem Rücken der Maus).
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung, obwohl Mäuse leichte Blutungen haben, ist es nie mehr als ein kleiner Tropfen, und daher müssen Flüssigkeiten nicht aufgefüllt werden. - Nach der Operation legen Sie die Maus in einen Erholungskäfig auf einem sauberen Papiertuch und lassen Sie die Erholung von der Narkose (5-10 min).
- Bringen Sie die vollständig bewussten Mäuse nach der Operation in einen sauberen Käfig mit frischer Einstreu.
- Überwachen Sie in den 72 h nach dem chirurgischen Eingriff auf Anzeichen von Schmerzen oder Ängsten. Achten Sie auf:
- Veränderungen des Körpergewichts. Obwohl das Körpergewicht am ersten und zweiten Tag abnehmen kann, beträgt dies normalerweise nicht mehr als 5% des präoperativen Körpergewichts.
- Allgemeiner Mangel an Pflege oder Überpflege um den Einschnitt.
- Anzeichen einer allgemeinen Verschlechterung des Gesundheitszustandes, wie gebeugte Körperhaltung, Grimassenschneiden im Gesicht und / oder abnormale Atmung.
- Wundinfektion wie durch Schwellung, Ausfluss oder Öffnung der Wunde angezeigt.
HINWEIS: Eine Infektion kann auftreten, wenn sich die Operationswunde öffnet. Da die chirurgische Wundreparatur (z. B. Austausch fehlender Metallclips oder erneutes Nähen) ein geregeltes Verfahren ist, stellen Sie sicher, dass vor der Durchführung von Reparaturen eine entsprechende Genehmigung eingeholt wird.
- Entfernen Sie Metallclips zwischen 5-7 Tagen nach der Operation.
- Pflegen Sie Mäuse in der Regel 2-52 Wochen postoperativ, abhängig vom Studiendesign.
- Bewerten Sie Schmerzen / Gang zu jedem Zeitpunkt während der Studie.
HINWEIS: Die vorliegende Studie verwendet die dynamische Gewichtsbelastung, wie in Schritt 5.1 beschrieben. - Euthanasieren Sie das Tier durch eine zugelassene Methode, gemäß den nationalen Lizenzvereinbarungen, lokalen Richtlinien und experimentellen Zulassungen.
HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden die Tiere durch Exsanguination (Herzpunktion) unter terminaler Anästhesie und anschließender zervikaler Dislokation eingeschläfert14.
5. Beurteilung der osteoarthritischen Erkrankung
- Messen Sie die dynamische Gewichtsbelastung als Ersatzmessung von Schmerzen anhand der folgenden Schritte.
HINWEIS: Da Mäuse Beutetiere sind, neigen sie dazu, Schmerzverhalten zu verbergen. Dies erschwert die Messung von Schmerzen. Es gibt viele Möglichkeiten, evozierte Schmerzen zu messen, wie z.B. Von Frey15 und Ganganalyse16. Die vorliegende Studie maß die differentielle Belastung zwischen dem operierten osteoarthritischen Bein und dem unoperierten Kontrollbein auf einer Druckmatte, während sich die Maus in einem Käfig befand (siehe Materialtabelle, Abbildung 2A).- Wiegen Sie die Maus. Planen und kalibrieren Sie die Druckmatte gemäß den spezifischen Anweisungen des Herstellers (siehe Dynamische Gewichtsaufnahmemittel in der Werkstofftabelle). Führen Sie die Maus in den Käfig ein.
- Aufzeichnung von Bewegung und Pfotendruck der Maus im Käfig für 5 min. Analysieren Sie die erfassten Daten, um 1 Minute zu validieren, und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Die automatisierte Analyse des Herstellers in der DWB-Software (siehe dynamische Belastungsausrüstung in der Materialtabelle) liefert Messungen an jeder Pfote im Verhältnis zum Gesamtkörpergewicht, der validierten Zeit, die jede Pfote auf der Matte verblieb, und einer Schätzung der Mattenfläche, die von jeder Pfote eingenommen wird. Dies ermöglicht die Berechnung der Differenzlast zwischen den beiden hinteren Pfoten, der Differenzlast zwischen den vorderen und hinteren Pfoten, eine Erhöhung der Vorderpfotenbelastung (wenn dieselbe Maus über einen längeren Zeitraum gemessen wurde), die Zeit, die mit dem Heben des OA-Beines im Vergleich zum kontralateralen Bein und der Pfotenoberfläche verbracht wurde.
- Quantifizieren Sie verkalktes Gewebe durch Mikrocomputertomographie (μCT).
HINWEIS: Obwohl subchondrale Knochenosteosklerose und Osteophytenbildung in histologischen Schnitten gemessen werden können, bietet die μCT die Möglichkeit, dreidimensional zu quantifizieren. Die Auflösung der Bildaufnahme in μCT bei 5 μm ist ausreichend, da dies die Visualisierung kleinerer Strukturen wie der Osteophyten ermöglicht, wobei je höher die Auflösung, desto besser.- Fixieren Sie die Kniegelenke in 4% iger Paraformaldehydlösung für 24 h und übertragen Sie sie dann auf 70% EtOH.
- Scannen Sie Kniegelenke in einem μCT-Scanner.
HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden die Proben auf einem μCT-Scanner (siehe Materialtabelle) mit einem 0,5-Aluminium-Filter gescannt, der auf 50 kV und 200 μA eingestellt war. Die Proben wurden bei einer Voxelgröße von 4,5 μm untersucht; 2 μm, 0,2° Drehwinkel für die Bildgebung und 0,5° Drehwinkel für die Quantifizierung. - Rekonstruieren Sie Scans, um eine 3D-Visualisierung zu ermöglichen. Die hier vorgestellten Scans wurden mit kompatibler Software rekonstruiert (siehe Materialtabelle).
- Analysieren Sie die subchondrale Knochensklerose (Abbildung 2B), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Wählen Sie ein interessierendes Volumen (VOI) von 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm in der Mitte der Last des medialen Tibiaplateaus17.
- Normalisieren Sie gegen den intrinsischen Knochenphänotyp der Maus, indem Sie das nicht operierte Bein analysieren.
- Bestimmen Sie die subchondrale Knochendichte und Mikroarchitektur, indem Sie eine Region of Interest (ROI) auswählen, die die trabekuläre Struktur innerhalb der Tibiaepiphyse, der subchondralen Platte oder des gesamten subchondralen Knochens in der zweidimensionalen koronalen Ansicht des Stapels mit CTan-Software abgrenzt (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Mit fortschreitender Erkrankung wird die Trennung zwischen der subchondralen Platte und der subchondralen trabekulären Region schwieriger zu unterscheiden. Es wird dann empfohlen, den Bereich des subchondralen Knochens zu analysieren, der vom Gelenkraum bis zur Wachstumsplatte ausgewählt wurde.
- Quantifizieren Sie Osteophyten (Abbildung 2C) anhand der folgenden Schritte.
- Identifizieren Sie Osteophyten in den rekonstruierten dreidimensionalen Bildstapeln mit der CTvol-Software (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Mineralisierte Osteophyten sind Vorsprünge ähnlich wie gewebter Knochen, die auf der medialen Seite des subchondralen Knochens sichtbarsind 18. Ein Beispiel hierfür ist in Abbildung 2C mit gelben Pfeilen gekennzeichnet. - Zählen Sie manuell die Anzahl der identifizierten Osteophyten in der medialen Seite des Kniegelenks.
- Messen Sie das Osteophytenvolumen in der sequentiellen 2D-Bildanalyse (mit dem CT-Analysator), indem Sie den Rand von Osteophyten manuell abgrenzen, der aus der subchondralen Platte als Region of Interest (ROI) für die Analyse herausragt.
- Berechnen Sie die Knochendichte von Osteophyten als Verhältnis von Knochenvolumen zu Osteophytenvolumen mit der CT-Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
- Identifizieren Sie Osteophyten in den rekonstruierten dreidimensionalen Bildstapeln mit der CTvol-Software (siehe Materialtabelle).
- Bewerten Sie Knorpelschäden und Synovitis (Abbildung 2D) gemäß dem OARSI-Knorpelschaden-Score19 und dem Synovitis-Score20 an paraffineingebetteten 6-μm-Abschnitten.
- Nach dem Scannen die Kniegelenke in 10% EDTA bei 4 °C für mindestens 2 Wochen entkalken und die Lösung zweimal wöchentlich wechseln.
- Proben in Paraffin einbetten. Zu Behandlungen und Inkubationszeiten siehe Zusatzdossier 1.
- Schneiden Sie 5 μm koronale Schnitte von paraffineingebetteten Proben auf einem rotierenden Mikrotom (siehe Materialtabelle).
- Wählen Sie Abschnitte in dem Bereich aus, in dem sich die Tibia- und Femurkondylen treffen (Abbildung 2D). Wählen Sie zwei Abschnitte in drei gleichmäßig voneinander entfernten Bereichen der Verbindung aus.
HINWEIS: Die in der vorliegenden Studie bewerteten Abschnitte wurden in Bereichen im Abstand von 80-100 μm ausgewählt. - Färbungsabschnitte mit Safranin-O und Fast Green (siehe Materialtabelle) nach den folgenden Schritten.
- Entparaffinieren Sie Abschnitte, indem Sie sie (in der genannten Reihenfolge) in Xylol für 5 min (2x), 100% Ethanol für 2 min, 95% Ethanol für 2 min, 80% Ethanol für 2 min und 70% Ethanol für 2 min eintauchen.
- Färbung mit gefiltertem Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) für 30 s. Anschließend 5 min (dreimal) in Leitungswasser abspülen.
- Mit Scott's Puffer (2 g Natriumbicarbonat und 10 g Magnesiumsulfat in 1 L destilliertem Wasser) 2 min waschen. In "Leitungswasser" für 5 min (dreimal) abspülen.
- Färbung für 4 min mit 0,2% Fast Green. Tauchen Sie in 1% Eisessig, fünfmal (frisch zubereitet jede Sitzung). Schnell in Leitungswasser abspülen.
- 5 min mit 0,5% Safranin-O einfärben. 95% Ethanol einspülen. Dehydrieren Sie Abschnitte in 100% Ethanol für 3 min, gefolgt von 3 min in Xylol.
- Score-Abschnitte wie in Glasson et al. für Knorpel19 und Jackson et al. für Synovitis20 angegeben.
ANMERKUNG: Es gibt auch andere Methoden der Quantifizierung, wie die computergestützte Quantifizierung von Pinamont et al.21. - Validieren Sie das Bewertungssystem mit zwei verschiedenen Scorern, die für das Experiment blind sind.
Representative Results
Die prozentuale Belastung pro Gesamtkörpergewicht des hinteren betätigten/OA-Beines wurde mit dem kontralateralen/Kontrollbein verglichen. Obwohl auch andere Parameter signifikante Unterschiede aufweisen können, wie die Erhöhung der Vorderpfotenbelastung nach einem chirurgischen Eingriff, deutet eine konsistente Veränderung der hinteren Pfotenbelastung auf eine Präferenz hin, ein Bein gegenüber dem anderen zu verwenden, und ist ein direkterer Indikator für signifikante Beschwerden für die Maus aufgrund der OA-Entwicklung. Es gab keine signifikanten Veränderungen der hinteren Beinbelastung im DMM-Modell innerhalb von 8 Wochen nach der Induktion, während DCS-Mäuse das kontralaterale / Kontrollbein 2 Wochen nach der Intervention signifikant bevorzugen (Abbildung 3A).
Subchondraler Knochen wurde analysiert, indem man sich auf das Volumen unter der medial belasteten Region des Tibiakondylus konzentrierte. Hier haben wir die Knochendichte dieses Bereichs bewertet, indem wir den Prozentsatz des mineralisierten Knochens innerhalb der interessierenden Region bestimmt und das Verhältnis zwischen dem kontralateralen und dem ipsilateralen Bein berechnet haben. Das Verhältnis zeigt an, dass beide Modelle 4 Wochen nach der Induktion eine erhöhte Knochendichte in der betroffenen Extremität (Verhältnis über 1) aufweisen (Abbildung 3B). Das Auftreten von Osteophyten ist im DCS-Modell stärker ausgeprägt, wo die Anzahl und das Volumen im Vergleich zum DMM-Modell 2 Wochen nach der Intervention signifikant zunehmen (Abbildung 3C, D). DCS zeigt erhöhte Knorpelschäden in den medialen Tibia- und Femurkompartimenten und Synovitis (Abbildung 3E,F) 4 Wochen nach der Induktion.
Abbildung 1: Chirurgischer Eingriff zur Induktion posttraumatischer OA in der Maus. Sequenzielle Bilder stellen die verschiedenen Phasen des Verfahrens dar. (A) Exposition der Gelenkkapsel, die die oberflächliche Membran um das Knie schneidet, indem eine Skalpellklinge Nummer 11 auf der medialen Seite des Patellabandes und weg vom Band eingeführt wird. Dadurch wird das infrapatellare Fettpolster freigelegt. (B) Identifizierung und Durchtrennung des Bandes meniscotibialis medial. Um das Band zu identifizieren, bewegen Sie das Patellaband zur lateralen Seite und drücken Sie dann das Fettpolster nach oben. Dies ermöglicht die Visualisierung des Bandes als kleine horizontale weiße Linie direkt über dem Tibiakondylen (hier mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet). Um das Band zu schneiden, wird die untere Klinge der Federschere unter das Band gelegt, wobei darauf geachtet wird, den Knorpel nicht zu beschädigen. Bewegen Sie den Meniskus zur medialen Seite, um den Tibiakondylen zu visualisieren. (C) Kratzen der Oberfläche des freiliegenden Knorpels und Verschluss der Wunde. Um den Knorpel zu zerkratzen, wird die Mikroklinge in Richtung der hinteren Seite eingeführt, wo sie den Knorpel berührt und sich dann nach vorne in Richtung des vorderen Teils des Gelenks bewegt. Sobald die Kratzer fertig sind, ziehen Sie die Haut über das Knie und schließen Sie die Wunde entweder durch subdermale Naht oder mit Wundclips. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beurteilung der Arthrose bei der Maus . (A) Die dynamische Gewichtsbelastung besteht darin, die Belastung einer Druckmatte an die entsprechende Pfote anzupassen. Die Belastung wird dann als Prozentsatz des Gesamtgewichts ausgedrückt. (B) Subchondralknochen wird gemessen, indem ein interessantes Volumen in der Belastungsregion des medialen Tibiakondylus ausgewählt und die subchondrale Platte oder der trabekuläre Knochen ausgewählt wird. Diese Bilder haben eine Auflösung von 4,5 μm. (C) Osteophyten werden in einer dreidimensionalen Ansicht der aufgenommenen μCT-Bilder identifiziert und quantifiziert. Das Volumen der Osteophyten wird gemessen, indem ein ROI ausgewählt wird, der den Rand des Osteophyten abgrenzt. Die Knochendichte wird als Knochenvolumen pro Osteophytenvolumen berechnet. Die hier vorgestellten Bilder wurden mit einer Auflösung von 2 μm aufgenommen, die Quantifizierung erfolgt jedoch in der Regel mit einer Auflösung von 4,5 μm. (D) Knorpel- und Synovitis-Scores werden aus 6 μm-Abschnitten entnommen, die mit Safranin-O und Fast Green gefärbt sind. Ein koronaler Schnitt des Mausknies, in dem alle mit einem schwarzen Kasten markierten Quadranten zur Markierung sichtbar sind und eine Vergrößerung der medialen Seite gezeigt wird. Die Synovitis, die die mediale Seite des Kniegelenks umgibt, ist ebenfalls sichtbar, insbesondere oberhalb und unterhalb des verschobenen Meniskus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Bewertung von OA im DMM- und DCS-Modell. (A) DWB wurde bis zu 8 Wochen nach der Induktion an Experimenten gemessen, die von demselben erfahrenen Bediener durchgeführt wurden. Die Last wird als Verhältnis zwischen der betriebenen/OA-Last und der kontralateralen/Kontrolllast ausgedrückt. Gepaarte t-Tests beider Beine werden auch in den Modellen Sham (grau), DMM (blau) und DCS (rosa) gezeigt. μCT-Analyse 4 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff. (B) Der subchondrale Knochen wurde 4 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff analysiert und als Verhältnis des ipsilateralen zum kontralateralen %BV/TV ausgedrückt. (C) Die Osteophytenzahl und (D) das Osteophytenvolumen wurden 2 Wochen nach der Induktion analysiert. Die histologische Beurteilung 4 Wochen nach Induktion einer (E) Knorpelschädigung des medialen Tibia- und Femurgelenkknorpels und (F) Synovitis wurde mit standardisierten Methoden bewertet19,20. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung n≥ 5 ausgedrückt. Die Daten wurden durch ANOVA mit wiederholten Messungen mit einer Šídák-Testkorrektur (A), einem gepaarten t-Test (A) oder einem Standard-Student-t-Test (B-F) verglichen. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzendes Dossier 1: Behandlungs- und Inkubationsbedingung für die Paraffineinbettung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Um eine chirurgische Induktion der posttraumatischen Osteoarthritis (PTOA) durchzuführen, wird die Unterstützung durch einen Assistenten dringend empfohlen (z. B. um die Mäuse vorzubereiten, während sich der Bediener auf die Operation konzentriert). Dies erleichtert die aseptische Chirurgie, reduziert dadurch das Infektionsrisiko und macht den Eingriff in großen Experimenten effizienter. Es ist leicht, die Fokusebene während der Operation zu verlieren, so dass ein Mikroskop, das Pedale zum Fokussieren enthält, ein wertvolles Merkmal ist, um die Sterilität während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten. Die Position der Maus und des Knies ist entscheidend. Das Knie muss nach oben zeigen und ausreichend gebeugt sein, um die Öffnung des Kniegelenkraums zu maximieren, was einen leichteren Zugang zum Band für das Einführen der Mikroklinge zum Kratzen der Kondylenoberfläche erleichtert. Die Identifizierung der MMTL kann eine Herausforderung darstellen, insbesondere wenn das Fettpolster größer als gewöhnlich ist oder eine kleine Blutung vorliegt. Um Blutungen zu vermeiden, drücken Sie das Fettpolster nach oben, um Tränen und nachfolgende Blutungen zu verhindern. Wenn das Fettpolster groß ist, kann dies etwas länger dauern, aber drücken Sie es geduldig weiter nach oben.
Die MMTL liegt ziemlich nahe am Tibiakondylen, daher muss man aufpassen, dass der Knorpel nicht verletzt wird, wenn man die untere Klinge der gebogenen Federschere unter der MMTL positioniert. Die gebogenen Klingen sollten zur medialen Seite und leicht nach oben zeigen, parallel zum Kondylen. Stellen Sie für eine optimale Aufteilung der MMTL sicher, dass die Schere scharf ist. Überprüfen Sie, ob sich der Meniskus nach dem Schneiden des Bandes medial bewegen kann, da manchmal ein kleiner Anhang verbleibt, der weiter geschnitten werden muss. Wenn die Mikroklinge eingeführt wird, um die Kondyle zu zerkratzen, muss sie senkrecht zur Kondyle stehen. Machen Sie den ersten Kratzer näher an der Mitte des Gelenks, aber achten Sie darauf, das vordere Kreuzband nicht zu beschädigen. Dann bewegen Sie sich in Richtung der medialen Seite und dann hinter dem Meniskus. Die Kratzer können als schwache weiße Linien auf dem Knorpel sichtbar sein. Da wir normalerweise Clips verwenden, wird der erste Schnitt auf der lateralen Seite durchgeführt, so dass die Clips nach dem Schließen der Wunde auf der Seite des Beines positioniert werden. Dadurch wird vermieden, dass die Clips das Knie reiben, wenn die Maus wieder in Bewegung gerät. Bei der Verwendung von Nähten wird die Verwendung von subdermalen Stichen dringend empfohlen. Wenn externe Stiche verwendet werden, nagen die Mäuse wahrscheinlich an den Stichen und öffnen ihre Wunde, was die Infektionswahrscheinlichkeit erhöht. Bei richtiger Durchführung darf diese Operation vom Schnitt bis zum Wundverschluss nicht länger als 5-10 Minuten dauern, wodurch die Exposition des Knorpels und zusätzliche unkontrollierte Schäden, die auftreten können, minimiert werden. Nach der Operation erholen sich die Mäuse sehr schnell und können fast sofort in den Käfig klettern und sich normal bewegen. Wenn die Mäuse nicht aktiv sind, sollte der entsprechende Experte in der Einheit konsultiert werden.
Für die Verhaltensbewertung von Schmerzen wurde die dynamische Gewichtsbelastung bewertet. Diese Methode kann jedoch als weniger empfindlich angesehen werden als andere evozierte Schmerztests, wie z. B. der von Frey-Test15. Es wird empfohlen, mehr als eine Methode zur Überwachung und Beurteilung von Schmerzen zu verwenden. Die Veränderungen, die 2 Wochen nach der Intervention bei DCS beobachtet wurden, deuten auf eine allgemein verminderte Belastung des OA-Beines im Vergleich zum gesunden Bein hin. Daher können 2 Wochen nach der DCS-Intervention verwendet werden, um frühe osteoarthritische oder Verletzungsschmerzen in Mausmodellen zu bewerten. Die Visualisierung mineralisierter Osteophyten durch μCT ermöglicht eine dreidimensionale Quantifizierung, die auch mit den histologischen Abschnitten12 abgeglichen werden kann, was der Untersuchung der Entstehung und Evolution von Osteophyten eine weitere Dimension hinzufügt. In unserer Gruppe war die Präsenz von Osteophyten im DMM-Modell zwischen und innerhalb der Operatoren variabel (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), während die Induktion von DCS in allen Fällen unabhängig vom Operateur robust zur Osteophytenbildung führte (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Außerdem gibt es im DCS-Modell im Vergleich zu DMM deutlich mehr und größere Osteophyten. Somit ist DCS ein ideales Modell für die Untersuchung der Osteophytenbildung. Die Quantifizierung der Osteosklerose, die auf den Belastungsbereich des subchondralen Knochens beschränkt ist, ist auch eine Verbesserung bei der Erkennung kleiner Veränderungen. Der Vergleich des medialen Kompartiments des operierten Beines mit dem kontralateralen Bein bietet auch eine Möglichkeit, sich gegen den intrinsischen Knochenphänotyp dieser bestimmten Maus zu normalisieren12. Die Hinzufügung der Knorpelkratzer im DCS-Modell ist ein kontrolliertes Mittel zur Induktion von fokussierten Knorpelschäden während der Operation, die viele Aspekte der Krankheit beschleunigen. Eine der Konsequenzen des experimentellen Verfahrens mit einer absichtlichen Schädigung des Knorpels selbst besteht darin, dass dieser artefaktische Schaden im Knorpelbewertungssystem ausgeschlossen oder bereinigt werden muss. Aufgrund dieser Einschränkung empfehlen wir dieses Modell nicht, wenn das Hauptziel der Studie darin besteht, die Wirkung von Arthrose auf den Knorpel selbst zu verstehen. Schließlich wird auch dringend empfohlen, mindestens zwei verblindete Scorer die Knorpelschäden und Synovitis-Scores bewerten zu lassen. Dies validiert und verbessert die Standardisierung der Scoring-Systeme.
Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass das Ausmaß der Variabilität über alle Parameter, die die DCS- und DMM-Modelle vergleichen, nicht vollständig bewertet wurde. Dies wird in Zukunft mit umfangreicheren Studien angegangen, die auch eine Bewertung der Variabilität zwischen Betreibern verschiedener Institutionen beinhalten könnten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschleunigte OA-Pathogenese im aktuellen DCS-Modell die Darstellung posttraumatischer OA ermöglicht und ein leistungsfähiges und robustes Forschungsinstrument bietet, um die zugrunde liegenden pathophysiologischen OA-Mechanismen zu untersuchen und aufzuklären, die diese chronisch schwächende Gelenkerkrankung antreiben. Darüber hinaus ermöglicht es die Erforschung von OA in einem kürzeren Zeitfenster, wobei der Schwerpunkt auf Osteophytogenese, OA-Schmerzen und den Auswirkungen von Knorpelschäden auf das gesamte Gelenk liegt.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir möchten die Arbeit von Gemma Charlesworth und Mandie Prior an der University of Liverpool würdigen, die die in dieser Publikation verwendeten μCT-Bilder erworben haben. Die Arbeit wurde von Versus Arthritis finanziert (Zuschüsse 20199 und 22483). Lynette Dunning wurde von Versus Arthritis gefördert (Zuschuss 20199). Kendal McCulloch wurde durch ein UWS-PhD-Stipendium finanziert. Carmen Huesa wurde von Versus Arthritis finanziert (Zuschüsse 20199 und 22483).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
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