Summary
본 프로토콜은 내측 소인대를 절단하여 마우스 무릎을 불안정하게 한 후 관절 연골의 표면에 조절된 마이크로블레이드 스크래치를 기술한다. 이 동물 모델은 골괴사 형성, 골경화증 및 초기 단계 통증을 연구하기에 적합한 가속 형태의 골관절염(OA)을 제시합니다.
Abstract
골관절염은 45세 이상의 사람들에게 가장 널리 퍼진 근골격계 질환으로 경제적, 사회적 비용이 증가합니다. 동물 모델은 질병의 여러 측면을 모방하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 외상후 골관절염의 불안정화 및 연골 스크래치 모델(DCS)을 기술한다. 널리 사용되는 내측 반월판(DMM) 모델의 불안정화를 기반으로 DCS는 연골 표면에 세 가지 스크래치를 도입합니다. 현재 기사는 내측 반월판 인대를 횡단하여 무릎을 불안정하게 만드는 단계를 강조한 다음 관절 연골에 세 번의 의도적인 표면 긁힘을 나타냅니다. 동적 중량 지지, 미세 컴퓨터 단층 촬영 및 조직학에 의한 가능한 분석 방법도 시연됩니다. DCS 모델은 연골에 대한 골관절염의 영향에 초점을 맞춘 연구에는 권장되지 않지만, (1) 골괴사 형성, (2) 골관절염 및 부상 통증, (3) 전체 관절의 연골 손상 영향에 특히 중점을 두고 더 짧은 시간 내에 골관절염 발달을 연구할 수 있습니다.
Introduction
골관절염(OA)은 45세 이상의 사람들에게 가장 널리 퍼진 근골격계 질환으로, 영국에서 875만 명 이상이 치료를 받고 있습니다1. 질병의 유병률 증가는 경제적 및 사회적 비용 증가로 이어졌고 장애의 주요 원인이며 환자의 삶의 질을 저하시킵니다1. 치료법이 없으면 질병의 발달과 진행을 이해하기 위한 연구를 가속화해야 할 시급한 필요성이 있습니다. 이 질병은 복잡하고 본질적으로 다 인성입니다. 이 질환의 주요 임상 측정은 통증 및 관절 이동성2이며, OA는 연골3뿐만 아니라 관절의 모든 조직에 영향을미칩니다. OA를 이해하는 데있어 주요 과제 중 하나는 초기 표현 / 부상에서 통증과 부동성을 동반 한 증상이있는 질병 진행에 이르기까지 수년, 때로는 수십 년이 걸릴 수 있다는 것입니다.
설치류에서 골관절염을 모델링하면 훨씬 더 짧은 시간 내에 시작과 진행을 이해하고 관련된 조직을 자세히 검사할 수 있으므로 OA 병태생리학에 대한 지식이 향상되었습니다. 유전자 변형 동물에서 외과 적 개입 모델에 이르기까지 골관절염의 수많은 쥐 모델이 있습니다. 외상 후 OA의 가장 널리 사용되는 쥐 모델은 내측 반월상 연골(DMM)의 불안정화입니다.4,5. 모델의 주의 사항은 서로 다른 연산자 간의 가변성입니다. 숙련 된 외과의는 관절 손상을 최소화하면서 절차를 수행 할 수 있지만 경험이없는 작업자는 관절낭을 장기간 노출시켜 연골에 손상을 입힐 수 있습니다. 프로세스의 이러한 가변성은 모델의 심각도에 영향을 미치며, 초기 손상이 많을수록 연골 손상 점수와 골괴사 형성이 증가합니다. 작업자 간의 가변성을 줄이고 임상 개입으로 인한 연골 손상을 모방하기 위해이 모델의 수정 된 버전이 개발되어 3 개의 표면 스크래치 형태로 연골 표면에 추가 손상이 가해집니다6. 이것은 또한 일부 임상 개입으로 인한 연골 손상으로 인한 OA 진행을 모델링 할 수있게합니다. 표준 DMM 모델과 비교하여 직접 유도된 연골 손상은 수컷 마우스에서 지속적으로 가속화된 돌출된 골괴사 형성, 연골 손상 및 염증 증가, 측정 가능한 대리 통증을 초래합니다.
이 모델은 골괴사 형성, 통증 표현 (수컷 마우스에서), 활막염 및 뼈 매개 변수의 초기 변화에 초점을 맞춘 초기 단계의 외상 후 OA 연구에 특히 적합합니다. 이 모델에서 골괴사 형성의 일관성은 골괴사 형성이 연골내 골화를 통한 복구 과정이기 때문에 뼈 복구 및 연골 내골화를 연구하는 것이 적절합니다7. 이 모델은 또한 관절 경 수술 절차와 같은 임상 개입 중에 연골에 직접 도입 된 손상을 모방하므로 전체 관절에 대한 연골 손상의 영향 연구에도 적합합니다.
Protocol
모든 실험 절차는 글래스고 대학교와 스코틀랜드 서부 대학교의 윤리 검토 패널의 승인을 받았으며 동물 (과학적 절차) 법 1986 (영국) 지침에 따라 수행되었습니다. 체중이 약 25g인 10주 된 C57Bl6/J 수컷 마우스를 본 연구에 사용했습니다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조).
1. 동물 준비
참고: 외상 후 OA 모델은 성별에 따라 중요한 차이를 나타내므로 연구 목적과 관련하여 마우스 성별을 고려하십시오 8,9,10.
- 마취 시약 (2 % 이소 플루 란)이 준비되었는지 확인하십시오.
참고: 주사 가능한 마취도 사용할 수 있습니다11. 수술 기간이 빠르기 때문에 흡입 마취를 사용하는 것이 좋습니다. - 별도의 가짜 수술 연령 일치 그룹을 수술 대조군으로 사용하십시오.
알림: 반대쪽 무릎은 외과적 대조군으로 사용해서는 안 됩니다(반대쪽 다리의 가짜 수술). 이것은 동물 복지 측면에서 문제가있을 수 있으며 보행 및 보행 측정에 영향을 미칠 수 있습니다. 반대쪽 무릎은 내재성 뼈 매개변수(12 )를 정상화하고 유발된 통증 검사(13)에서 쌍을 이루는 비교 역할을 합니다. - 골격이 성숙한 마우스를 사용하십시오.
참고: 대부분의 문헌은 8-12주령에 OA를 유도합니다. 본 연구에서, 마우스는 10주령이다.
2. 수술 전 관리 (외과 보조원이 수행)
- 다른 시설에서 이송되는 경우 생쥐가 새로운 환경에 적응할 수 있도록 외과 적 개입 최소 1 주일을 허용하십시오.
- 적절하게 지정된 멸균실에서 수술을 수행하여 모든 표면이 멸균되었는지 확인합니다(예: 수술 부위를 덮기 위해 멸균 커튼 사용).
참고: 수술은 무균입니다. - 멸균 커튼에 멸균기구를 배치하고 놓습니다.
- 마우스의 무게를 잰다.
- 마우스를 마취 케이지에 넣은 다음 표준 마취 장비를 사용하여 최대 15분 동안 2% 이소플루오란을 도입하여 마취를 유도합니다( 재료 표 참조).
알림: 케이지는 마우스를 도입하기 전에 "잔류" 마취가 없어야 합니다. - 마취가 끝나면 마우스를 마취실에서 꺼내 작은 이발기로 무릎, 정강이 중간에서 허벅지 중간까지 무릎, 앞 및 옆면에 털을 클립합니다.
알림: 뒷다리 무릎의 선택은 수술을 수행하기 더 쉬운 쪽에 대한 작업자의 선호도에 달려 있습니다. 이 프로토콜은 왼쪽 다리에서 작동했습니다. - 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다(발을 꼬집어도 반응하지 않음).
- 면도한 노출된 피부에 항균성 피부 클렌저(예: 클로르헥시딘 또는 요오드포 함유, 재료 표 참조)를 바르고 피부를 소독합니다.
- 진통의 경우 0.05 mg / kg의 부 프레 노르 핀을 피하 투여하십시오.
- 무릎을 위쪽으로 향하게 하여 마우스를 등쪽에 놓고 마우스 코를 마취 리그에 연결된 노즐에 놓습니다.
- 작은 열쇠 구멍이있는 멸균 드레이프로 마우스를 덮으십시오.
- 슬개골 인대가 위쪽을 향하고 발이 수술 테이프로 고정되도록 무릎을 90° 미만으로 구부린 상태에서 수술할 다리를 배치합니다.
3. 연골 긁힘에 따른 내측 반월상 연골 시술의 불안정화
- 슬개골 인대에 초점을 맞추도록 현미경을 조정합니다.
- 톱니 모양의 집게로 측면의 무릎 피부를 꼬집고 ( 재료 표 참조) 수술 용 가위를 사용하여 원위 슬개 건과 평행하게 작은 절단을하고 가위를 넣고 절단을 약 1cm로 확장합니다. 피부를 내측으로 이동하여 슬개골 인대와 근위 경골 고원을 노출시킵니다 (그림 1).
- 숫자 11 블레이드를 사용하여 인대의 상단에서 하단까지 슬개골 인대의 내측을 따라 절개하십시오 (그림 1A). 슬개골 인대의 바닥에 도달하면 블레이드를 90° 돌리고 절개 부위를 슬개골 인대에서 내측으로 확장하여 관절낭에 접근합니다.
알림: 출혈은이 단계 또는 후속 단계에서 발생할 수 있습니다. 출혈이 발생하면 멸균 된 면봉을 사용하고 몇 초 (5-30 초) 압력을가하십시오. - 무딘 끝 집게로 슬개골 인대를 꼬집고 손목을 돌려 슬개골 인대를 측면으로 움직여 슬개골 하 지방 패드 (IFP)가 노출 될 정도로합니다.
알림: 슬개골 인대의 손상을 최소화하려면 핀셋을 너무 세게 잡지 말고 인대를 옆으로 유지하기에 충분합니다. - 슬개골 인대를 가볍게 잡고 마이크로 핀셋 ( 재료 표 참조)으로 IFP를 꼬집어 들어 올리고 약간 위쪽으로 움직입니다. 이를 통해 내측 반월 상 연골 인대를 시각화 할 수 있습니다.
- 내측 반월판의 두개골 뿔을 전방 경골 고원에 고정시키는 내측 반월판의 내측 반월상 연골 인대(MMTL)를 식별합니다(그림 1B).
- 경골 고원 또는 대퇴 과두에서 손상과 장기간의 연골 노출을 피하십시오.
- 작은 2mm 블레이드 Vannas 스프링 가위로 MMTL을 조심스럽게 절단하고 내측 반월 상 연골 및 기타 인대를 그대로 둡니다. 이 시점에서 DMM 모델에 대한 수술 절차가 완료됩니다(그림 1C).
- 3mm 미세 수술 칼로 경골 관절 연골에 뒤쪽에서 앞쪽 방향으로 3 개의 균일 한 간격의 움푹 들어간 곳을 표시하십시오.
참고: 점수의 길이는 약 1mm이며 연골 표면만 손상시킵니다(그림 2D).- 칼날을 연골에 과도한 힘을 가하지 마십시오(즉, 긁힌 자국이 피상적인지 확인). 이 추가 단계는 연골 손상을 입히고 DCS 모델을 유도합니다.
- 2 개 또는 3 개의 작은 7mm 상처 봉합 금속 클립 또는 흡수성 6-0 피하 수술 봉합사로 피부를 닫습니다 ( 재료 표 참조).
참고: 피하 수술 봉합사는 추가 개입을 피하기 때문에 더 좋지만 수술 기간이 연장됩니다. 외부 봉합사는 생쥐의 g아 먹음으로 상처가 열릴 위험을 증가시킵니다. - 가짜 수술을 위해 내측 반월 상 연골의 내측 반월 상 연골 인대를 확인하되 절단하지 마십시오.
- 연골 긁힘 만받는 마우스의 경우 인대를 절단하지 않고 3 개의 표면 스크래치를 만듭니다.
알림: 각 마우스 사이에 장갑을 교체하고 오토클레이브를 통해 기구를 소독합니다. 재사용하기 전에 기기가 냉각되었는지 확인하는 것을 잊지 마십시오.
4. 수술 후 관리
- 출혈이 발생하면 (>50 uL) 따뜻한 멸균 식염수 500 μL를 피하 (마우스 뒷면에) 주사하십시오.
참고: 우리의 경험에 따르면 마우스에는 약간의 출혈이 있지만 결코 작은 방울 이상은 아니므로 체액을 보충할 필요가 없습니다. - 수술 후 마우스를 깨끗한 종이 조직의 복구 케이지에 넣고 마취에서 회복하십시오 (5-10 분).
- 수술 후 완전히 의식이있는 마우스를 신선한 침구가있는 깨끗한 케이지로 옮깁니다.
- 외과 적 개입 후 72 시간 동안 통증이나 고통의 징후가 있는지 모니터링하십시오. 주의 사항 :
- 체중의 변화. 체중은 첫날과 둘째 날에 감소 할 수 있지만 일반적으로 수술 전 체중의 5 %를 넘지 않습니다.
- 절개 부위 주변의 일반적인 손질 또는 과도한 손질 부족.
- 구부린 자세, 얼굴 찡그린 얼굴 및/또는 비정상적인 호흡과 같은 일반적인 건강 악화의 징후.
- 상처의 붓기, 분비물 또는 개방으로 나타나는 상처 감염.
참고: 수술 상처가 열리면 감염이 발생할 수 있습니다. 외과적 상처 복구(예: 누락된 금속 클립 교체 또는 재봉합)는 규제된 절차이므로 수리를 수행하기 전에 관련 승인을 받아야 합니다.
- 수술 후 5-7일 사이에 금속 클립을 제거하십시오.
- 마우스는 전형적으로 연구 설계에 따라 수술 후 2-52주 동안 유지한다.
- 연구 중 어느 시점에서든 통증/보행을 평가합니다.
참고: 본 연구는 5.1단계에서 설명한 대로 동적 중량 지지를 사용합니다. - 국가 허가 계약, 현지 지침 및 실험 승인에 따라 승인된 방법으로 동물을 안락사시킵니다.
참고: 본 연구에서, 동물들은 말단 마취 하에 방혈(심장 천자)을 통해 안락사된 후 자궁경부 탈구(14)를 통해 안락사되었습니다.
5. 골관절염 질환의 평가
- 아래 단계에 따라 통증의 대리 측정으로 동적 체중 부하를 측정하십시오.
참고: 생쥐는 먹이 동물이기 때문에 통증 행동을 숨기는 경향이 있습니다. 이것은 통증의 측정을 어렵게 만듭니다. 유발 된 통증을 측정하는 방법에는 Von Frey15 및 보행 분석16과 같은 여러 가지가 있습니다. 본 연구는 마우스가 케이지에 있는 동안 압력 매트에서 수술된 골관절염 다리와 수술되지 않은 대조군 다리 사이의 차동 하중을 측정했습니다( 재료 표, 그림 2A 참조).- 마우스의 무게를 잰다. 제조업체의 특정 지침에 따라 압력 매트를 장착하고 보정하십시오( 재료 표의 동적 중량 지지 장비 참조). 케이지에 마우스를 넣으십시오.
- 케이지에서 마우스의 움직임과 발 압력을 5 분 동안 기록하십시오. 획득한 데이터를 분석하여 제조업체의 지침에 따라 1분을 검증합니다.
알림: DWB 소프트웨어에 대한 제조업체의 자동 분석( 재료 표의 동적 중량 지지 장비 참조)은 총 체중에 비례하여 각 발에 대한 측정값, 각 발이 매트에 남아 있는 검증된 시간 및 각 발이 차지하는 매트 면적의 추정치를 제공합니다. 이를 통해 두 뒷발 사이의 차동 하중, 앞발과 뒷발 사이의 차동 하중, 앞발 하중 증가 (일정 기간 동안 동일한 마우스가 측정 된 경우), 반대쪽 다리 및 발 표면과 비교하여 OA 다리를 들어 올리는 데 소요되는 시간을 계산할 수 있습니다.
- 미세 컴퓨터 단층 촬영(μCT)을 통해 석회화된 조직을 정량화합니다.
참고: 연골하 골 골경화증과 골괴사 형성은 조직학적 섹션에서 측정할 수 있지만 μCT는 3차원적으로 정량화할 수 있는 기회를 제공합니다. 5μm에서 μCT의 이미지 캡처 해상도는 골괴사와 같은 더 작은 구조를 시각화 할 수 있기 때문에 충분하지만 해상도가 높을수록 좋습니다.- 무릎 관절을 4 % 파라 포름 알데히드 용액에 24 시간 동안 고정 한 다음 70 % EtOH로 옮깁니다.
- μCT 스캐너로 무릎 관절을 스캔합니다.
참고: 본 연구에서, 샘플은 50 kV 및 200 μA에서 설정된 0.5 알루미늄 필터를 사용하여 μCT 스캐너( 재료 표 참조)에서 스캔되었습니다. 샘플은 4.5 μm의 복셀 크기로 검사되었습니다. 2 μm, 이미징을 위한 0.2° 회전 각도, 정량화를 위한 0.5° 회전 각도. - 3D 시각화가 가능하도록 스캔을 재구성합니다. 여기에 제시된 스캔은 호환되는 소프트웨어를 사용하여 재구성되었습니다( 재료 표 참조).
- 아래 단계에 따라 연골하 골 경화증(그림 2B)을 분석합니다.
- 내측 경골 고원17의 하중 중심에서 0.5mm × 0.9mm × 0.9mm의 관심 부피 (VOI)를 선택하십시오.
- 수술되지 않은 다리를 분석하여 마우스의 고유 뼈 표현형에 대해 정규화하십시오.
- CTan 소프트웨어를 사용하여 스택의 2차원 관상 보기에서 경골 골단, 연골하 판 또는 전체 연골하 뼈 내의 섬유주 구조를 묘사하는 관심 영역(ROI)을 선택하여 연골하 골밀도와 미세 구조를 결정합니다( 재료 표 참조).
참고: 질병이 진행됨에 따라 연골하 판과 연골하 섬유주 영역 사이의 분리가 구별하기가 더 어려워집니다. 그런 다음 관절 공간에서 성장판까지 선택된 연골 하 뼈의 면적을 분석하는 것이 좋습니다.
- 아래 단계에 따라 골괴사를 정량화합니다(그림 2C).
- CTvol 소프트웨어를 사용하여 재구성된 3차원 이미지 스택에서 골괴사를 식별합니다( 재료 표 참조).
참고: 광물화된 골괴사는 연골하골(18)의 내측에서 볼 수 있는 직조된 뼈와 유사한 돌출부이다. 이들의 예는 그림 2C에서 노란색 화살표로 표시됩니다. - 무릎 관절의 내측에서 확인 된 골 괴사의 수를 수동으로 계산하십시오.
- 2D 순차 이미지 분석(CT 분석기 사용)에서 골괴사의 가장자리를 수동으로 묘사하고 연골하 플레이트에서 분석을 위한 관심 영역(ROI)으로 돌출하여 골괴사 부피를 측정합니다.
- CT 분석기 소프트웨어를 사용하여 골괴사 부피에 대한 골량의 비율로 골괴사 골밀도를 계산합니다( 재료 표 참조).
- CTvol 소프트웨어를 사용하여 재구성된 3차원 이미지 스택에서 골괴사를 식별합니다( 재료 표 참조).
- 파라핀 포매 6 μm 절편에서 OARSI 연골 손상 점수19 및 활막염 점수20에 따라 연골 손상 및 활막염(도 2D)을 평가한다.
- 스캔 후 최소 2주 동안 4°C에서 10% EDTA로 무릎 관절을 석회질화하고 일주일에 두 번 용액을 바꿉니다.
- 파라핀에 샘플을 삽입합니다. 치료 및 잠복기에 대해서는 보충 파일 1을 참조하십시오.
- 회전식 마이크로톰에서 파라핀 포매 샘플의 5μm 관상 절편을 절단합니다( 재료 표 참조).
- 경골과 대퇴 과두가 만나는 영역에서 섹션을 선택하십시오 (그림 2D). 조인트의 동일한 거리가 있는 세 영역에서 두 섹션을 선택합니다.
참고 : 본 연구에서 채점 된 섹션은 80-100 μm 떨어진 영역에서 선택되었습니다. - 아래 단계에 따라 Safranin-O 및 Fast green( 재료 표 참조)으로 섹션을 염색합니다.
- 절편을 크실렌에 5분(2x), 100% 에탄올을 2분, 95% 에탄올을 2분, 80% 에탄올을 2분, 70% 에탄올에 2분 동안 담가 절편을 탈파라핀화합니다.
- 여과 된 헤마톡실린 ( 재료 표 참조)으로 30 초 동안 염색합니다. 그런 다음 수돗물로 5 분 동안 헹굽니다 (3 회).
- Scott의 완충액 (증류수 1L에 중탄산 나트륨 2g과 황산 마그네슘 10g)으로 2 분 동안 씻으십시오. '수돗물'로 5분(3회) 헹굽니다.
- 0.2% 패스트 그린으로 4분 동안 염색합니다. 1% 빙초산에 5회 담그십시오(각 세션마다 신선하게 만들기). 수돗물로 빠르게 헹굽니다.
- 0.5% 사프라닌-O로 5분간 염색합니다. 95 % 에탄올로 헹굽니다. 100 % 에탄올에서 3 분 동안 섹션을 탈수 한 다음 크실렌에서 3 분 동안 탈수합니다.
- 연골19 에 대한 Glasson et al. 및 활막염20에 대한 Jackson et al.에 명시된 점수 섹션.
참고 : Pinamont et al.21의 컴퓨터 기반 정량화와 같은 다른 정량화 방법이 존재합니다. - 실험에 눈이 먼 두 명의 다른 채점자를 사용하여 채점 시스템을 검증합니다.
Representative Results
후방 작동/OA 다리의 총 체중당 하중 백분율을 반대측/제어 다리와 비교했습니다. 외과적 개입 후 앞발 하중의 증가와 같은 다른 매개변수도 상당한 차이를 줄 수 있지만, 뒷발 하중의 일관된 변화는 한쪽 다리를 다른 쪽 다리보다 사용하는 선호도를 나타내며 OA 발달로 인한 마우스의 심각한 불편함을 보다 직접적으로 나타내는 지표입니다. 유도 후 8주 이내에 DMM 모델에서 후방 다리 하중에는 유의미한 변화가 없었으며, DCS 마우스는 개입 후 2주 후에 반대측/대조군 다리를 유의하게 선호했습니다(그림 3A).
연골하골은 경골 과두의 내측 하중 영역 아래의 부피에 초점을 맞추어 분석하였다. 여기서 우리는 관심 영역 내에서 광물화 된 뼈의 비율을 결정하여이 영역의 골밀도를 평가하고 반대쪽 다리와 동측 다리 사이의 비율을 계산했습니다. 이 비율은 두 모델 모두 유도 4 주 후에 영향을받은 사지에서 골밀도가 증가했음을 나타냅니다 (1 이상의 비율). 골괴사의 출현은 DCS 모델에서 더 두드러지며, 개입 2 주 후 DMM 모델에 비해 수와 부피가 크게 증가합니다 (그림 3C, D). DCS는 유도 4 주 후 내측 경골 및 대퇴부 구획과 활막염 (그림 3E, F)에서 연골 손상 상승을 나타냅니다.
그림 1: 마우스에서 외상 후 OA를 유도하기 위한 외과적 개입. 순차 이미지는 절차의 여러 단계를 나타냅니다. (A) 슬개골 인대의 내측에 11 번 메스 블레이드를 삽입하고 인대에서 멀어지게하여 무릎 주위의 표재성 막을 절단하는 관절낭의 노출. 이것은 슬개골 하 지방 패드를 노출시킵니다. (B) 내측 반월상 연골 인대의 식별 및 절개. 인대를 식별하려면 슬개골 인대를 측면으로 이동 한 다음 지방 패드를 위쪽으로 밉니다. 이것은 경골 과두 바로 위의 작은 수평 흰색 선으로 인대를 시각화 할 수 있습니다 (여기에 검은 색 화살표로 표시됨). 인대를 자르기 위해 스프링 가위의 아래쪽 날을 인대 아래에 놓고 연골을 손상시키지 않도록주의하십시오. 반월판을 내측으로 움직여 경골 과두를 시각화합니다. (c) 노출된 연골의 표면을 긁고 상처를 봉합한다. 연골을 긁기 위해 마이크로 블레이드는 뒤쪽으로 삽입되어 연골과 접촉 한 다음 관절의 앞쪽 부분으로 앞으로 이동합니다. 긁힌 자국이 끝나면 피부를 무릎 위로 당기고 피하 봉합이나 상처 클립으로 상처를 닫습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스의 골관절염 평가 . (A) 동적 중량 지지는 압력 매트의 하중을 해당 발에 맞추는 것으로 구성됩니다. 그런 다음 하중은 총 중량의 백분율로 표시됩니다. (B) 연골하골은 내측 경골 과두의 로딩 영역에서 관심 부피를 선택하고 연골하 판 또는 섬유주 뼈를 선택하여 측정합니다. 이 이미지는 4.5 μm의 해상도입니다. (C) 획득 된 μCT 이미지의 3 차원 뷰에서 골 괴사를 식별하고 정량화합니다. 골괴사의 부피는 골괴사의 가장자리를 묘사하는 ROI를 선택하여 측정됩니다. 골밀도는 골괴사 부피당 골량으로 계산됩니다. 여기에 제시된 이미지는 2μm의 해상도로 촬영되었지만 정량화는 일반적으로 4.5μm 해상도로 수행됩니다. (D) 연골 및 활막염 점수는 Safranin-O 및 Fast green으로 염색 된 6 μm 섹션에서 가져옵니다. 블랙 박스로 표시된 모든 사분면이 채점을 위해 표시되고 내측의 배율이 표시되는 마우스 무릎의 관상 동맥 섹션. 무릎 관절의 내측을 둘러싼 활액막염, 특히 변위 된 반월 상 연골 위와 아래에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DMM 및 DCS 모델에서 OA의 대표 평가. (A) DWB는 동일한 전문 작업자가 수행한 실험에서 유도 후 최대 8주까지 측정했습니다. 부하는 작동/OA 부하 대 반대측/제어 부하 간의 비율로 표시됩니다. 두 다리의 쌍체 t-검정은 Sham(회색), DMM(파란색) 및 DCS(분홍색) 모델에서도 나타납니다. 외과 적 개입 4 주 후 μCT 분석. (B) 연골하골은 외과적 개입 4주 후에 분석되었으며 반대쪽 %BV/TV에 대한 동측성의 비율로 표시되었습니다. (C) 골괴사 수 및 (D) 골사상사 부피는 유도 2주 후에 분석하였다. 조직학적 평가는 (E) 내측 경골 및 대퇴 관절 연골의 연골손상 및 (F) 활막염의 유도 4주 후 표준화된 방법으로 점수를 매겼다. 데이터는 평균 ± 표준 편차, n ≥ 5로 표현된다. 데이터는 반복 측정 ANOVA와 Šídák 검정 보정(A), 쌍체 t-검정(A) 또는 표준 스튜던트 t-검정(B-F)으로 비교되었습니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns = 유의하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 파라핀 포매를 위한 처리 및 배양 조건. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
외상 후 골관절염 (PTOA)의 외과 적 유도를 수행하려면 보조자의 지원이 강력히 권장됩니다 (예 : 수술자가 수술에 집중하는 동안 마우스를 준비). 이것은 무균 수술을 용이하게하여 감염의 위험을 줄이고 대규모 실험에서보다 효율적으로 개입 할 수 있습니다. 수술 중 초점면을 잃기 쉽기 때문에 초점을 맞추기 위한 페달이 포함된 현미경은 수술 내내 무균 상태를 유지하는 데 도움이 되는 중요한 기능입니다. 마우스와 무릎의 위치가 중요합니다. 무릎은 위쪽을 향하고 무릎 관절 공간의 개방을 최대화하기 위해 충분히 구부러져 있어야 하며, 과두 표면을 긁기 위해 마이크로블레이드를 도입하기 위해 인대에 더 쉽게 접근할 수 있습니다. MMTL을 식별하는 것은 특히 지방 패드가 평소보다 크거나 작은 출혈이있는 경우 어려울 수 있습니다. 출혈을 피하려면 지방 패드를 위로 밀어 눈물과 그에 따른 출혈을 방지하십시오. 지방 패드가 크면 시간이 조금 더 걸릴 수 있지만 참을성있게 계속 위로 밀어 올리십시오.
MMTL은 경골 과두에 매우 가깝기 때문에 MMTL 아래에 구부러진 스프링 가위의 하부 날을 배치 할 때 연골을 손상시키지 않도록주의해야합니다. 구부러진 블레이드는 내측을 향하고 과두와 평행하게 약간 위쪽을 가리켜야 합니다. MMTL을 가장 잘 절단하려면 가위가 날카로운지 확인하십시오. 인대를 자른 후 반월 상 연골이 내측으로 움직일 수 있는지 확인하십시오., 때로는 추가 절단이 필요한 작은 부착물이 남아 있기 때문입니다. 과두를 긁기 위해 마이크로 블레이드를 도입 할 때 과두에 수직이어야합니다. 첫 번째 스크래치를 관절의 중앙에 가깝게 만들되 전방 십자 인대가 손상되지 않도록주의하십시오. 그런 다음 내측으로 이동 한 다음 반월 상 연골 뒤로 이동하십시오. 긁힌 자국은 연골에 희미한 흰색 선으로 보일 수 있습니다. 우리는 일반적으로 클립을 사용하기 때문에 초기 절개는 측면에서 수행되므로 클립을 상처를 닫은 후 다리 측면에 위치합니다. 이렇게 하면 마우스가 다시 움직일 때 클립이 무릎을 문지르는 것을 방지할 수 있습니다. 봉합사를 사용할 때는 피하 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 외부 바늘을 사용하는 경우, 마우스는 바늘을 g아 먹고 상처를 열어 감염 가능성을 높입니다. 올바르게 수행되면 이 수술은 절개에서 상처 봉합까지 5-10분 이상 걸리지 않아야 하므로 연골의 노출과 발생할 수 있는 통제되지 않은 추가 손상을 최소화해야 합니다. 수술 후, 마우스는 매우 빨리 회복되고 거의 즉시 케이지로 올라가 정상적으로 움직일 수 있습니다. 마우스가 활동적이지 않으면 해당 장치의 적절한 전문가와상의해야합니다.
통증의 행동 평가를 위해 동적 체중 부하가 평가되었습니다. 그러나, 이 방법은 폰 프레이 검사(15)와 같은 다른 유발된 통증 검사보다 덜 민감한 것으로 간주될 수 있다. 통증을 모니터링하고 평가하기 위해 하나 이상의 방법을 사용하는 것이 좋습니다. DCS 개입 2주 후 관찰된 변화는 일시적이더라도 건강한 다리에 비해 일반적으로 OA 다리의 하중이 감소했음을 나타냅니다. 따라서, DCS 개입 2주 후를 사용하여 마우스 모델에서 초기 골관절염 또는 상해 통증을 평가할 수 있다. μCT에 의한 광물화된 골괴사의 시각화는 3차원 정량화를 가능하게 하며, 이는 조직학적 섹션12와도 일치할 수 있어 골괴사의 출현 및 진화 연구에 또 다른 차원을 추가합니다. 우리 그룹에서 골괴사의 존재는 DMM 모델에서 작업자 간 및 작업자 내에서 가변적이었습니다(2.3 ± 1 대 1.2 ± 1, n > 7, P = 0.0183), DCS의 유도는 작업자에 관계없이 모든 경우에 골괴사 생성을 강력하게 유도했습니다(2.6 ± 0.7 대 2.4 ± 0.5, n > 7, P = 0.711). 또한 DCS 모델에는 DMM에 비해 훨씬 더 크고 더 큰 골괴사가 있습니다. 따라서 DCS는 골괴사 형성 연구에 이상적인 모델입니다. 연골하 뼈의 로딩 영역으로 제한되는 골경화증의 정량화는 또한 작은 변화를 감지하는 개선입니다. 수술된 다리의 내측 구획을 반대쪽 다리와 비교하는 것은 또한 그 특정 마우스(12)의 내재적 골 표현형에 대해 정상화하는 방법을 제공한다. DCS 모델에서 연골 스크래치의 추가는 수술 동안 집중된 연골 손상을 유도하는 제어 된 수단이며 이는 질병의 많은 측면을 가속화합니다. 연골 자체에 대한 의도적 인 손상을 포함하는 실험 절차의 결과 중 하나는 연골 등급 시스템에서 이러한 인공적 손상을 배제하거나 조정해야한다는 것입니다. 이러한 제한 때문에 연구의 주요 목표가 연골 자체에 대한 골관절염의 영향을 이해하는 것이라면 이 모델을 권장하지 않습니다. 마지막으로, 적어도 두 명의 맹검 채점자가 연골 손상 및 활액막염 점수를 평가하는 것이 좋습니다. 이는 채점 시스템의 표준화를 검증하고 향상시킵니다.
이 연구의 한계는 DCS와 DMM 모델을 비교하는 모든 매개 변수의 변동성 정도가 완전히 평가되지 않았다는 것입니다. 이것은 앞으로 더 광범위한 연구를 통해 해결 될 것이며, 여기에는 다른 기관의 운영자 간의 변동성 평가도 포함될 수 있습니다.
결론적으로, 현재 DCS 모델에서 가속화된 OA 병인은 외상 후 OA의 표현을 허용하고 이 만성 쇠약 관절 질환을 유발하는 근본적인 OA 병태생리학적 메커니즘을 조사하고 해명할 수 있는 강력하고 강력한 연구 도구를 제공합니다. 또한 골형성, 골관절염 통증 및 연골 손상이 전체 관절에 미치는 영향에 초점을 맞춰 더 짧은 시간 내에 OA를 탐색할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 이 출판물에 사용된 μCT 이미지를 획득한 리버풀 대학의 Gemma Charlesworth와 Mandie Prior의 연구를 인정하고 싶습니다. 작업은 Versus Arthritis (보조금 20199 및 22483)에서 자금을 지원했습니다. Lynette Dunning은 Versus Arthritis (보조금 20199)의 자금 지원을 받았습니다. Kendal McCulloch는 UWS PhD 장학금으로 자금을 지원 받았습니다. Carmen Huesa는 Versus Arthritis (보조금 20199 및 22483)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
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