Summary
Il presente protocollo descrive i graffi controllati della microlama sulla superficie della cartilagine articolare dopo aver destabilizzato il ginocchio del topo tagliando il legamento miniscotibiale mediale. Questo modello animale presenta una forma accelerata di osteoartrite (OA) adatta allo studio della formazione di osteofiti, dell'osteosclerosi e del dolore in fase iniziale.
Abstract
L'osteoartrite è la malattia muscoloscheletrica più diffusa nelle persone sopra i 45 anni, portando ad un aumento dei costi economici e sociali. I modelli animali sono usati per imitare molti aspetti della malattia. Il presente protocollo descrive il modello di destabilizzazione e graffio della cartilagine (MDD) dell'osteoartrite post-traumatica. Sulla base della destabilizzazione ampiamente utilizzata del modello del menisco mediale (DMM), DCS introduce tre graffi sulla superficie della cartilagine. L'articolo attuale evidenzia i passaggi per destabilizzare il ginocchio transettando il legamento meniscotibiale mediale seguito da tre graffi superficiali intenzionali sulla cartilagine articolare. Vengono inoltre dimostrati i possibili metodi di analisi mediante pesistica, tomografia microcomputerizzata e istologia. Mentre il modello MDD non è raccomandato per gli studi che si concentrano sull'effetto dell'osteoartrite sulla cartilagine, consente lo studio dello sviluppo dell'osteoartrite in una finestra temporale più breve, con particolare attenzione a (1) formazione di osteofiti, (2) dolore osteoartritico e lesione e (3) l'effetto del danno alla cartilagine in tutta l'articolazione.
Introduction
L'osteoartrite (OA) è la malattia muscoloscheletrica più diffusa nelle persone sopra i 45 anni, con oltre 8,75 milioni di persone in cerca di trattamento nel Regno Unito1. La crescente prevalenza della malattia ha portato a un aumento dei costi economici e sociali, è un importante contributo alla disabilità e riduce la qualità della vita dei pazienti1. Senza trattamenti disponibili, c'è un urgente bisogno di accelerare la ricerca per comprendere lo sviluppo e la progressione della malattia. La malattia è complessa e anche multifattoriale nella sua natura. Le principali misurazioni cliniche della malattia sono il dolore e la mobilità articolare2 e l'OA colpisce tutti i tessuti dell'articolazione, non solo la cartilagine3. Una delle principali sfide nella comprensione dell'OA è che possono essere necessari anni, a volte decenni, dalla presentazione iniziale / lesione alla progressione sintomatica della malattia con dolore e immobilità.
La modellazione dell'osteoartrosi nei roditori ha migliorato la nostra conoscenza della fisiopatologia dell'OA permettendoci di comprendere l'inizio e la progressione in un lasso di tempo molto più breve e con un esame dettagliato dei tessuti coinvolti. Esistono numerosi modelli murini di osteoartrite, dagli animali geneticamente modificati ai modelli di intervento chirurgico. Il modello murino più utilizzato di OA post-traumatica è la destabilizzazione del menisco mediale (DMM)4,5. Un avvertimento del modello è la variabilità tra i diversi operatori. I chirurghi esperti possono eseguire la procedura con danni articolari minimi, mentre gli operatori inesperti espongono la capsula articolare per periodi di tempo più lunghi e infliggono danni alla cartilagine. Questa variabilità nel processo influenza la gravità del modello, con un danno iniziale maggiore che porta ad un aumento dei punteggi di danno alla cartilagine e alla formazione di osteofiti. Con l'intenzione di ridurre la variabilità tra gli operatori e imitare il danno alla cartilagine dall'intervento clinico, viene sviluppata una versione modificata di questo modello, in cui vengono inflitti danni aggiuntivi controllati sulla superficie della cartilagine sotto forma di tre graffi superficiali6. Ciò consente anche di modellare la progressione dell'OA derivante dal danno cartilagineo causato da alcuni interventi clinici. Rispetto al modello DMM standard, il danno alla cartilagine indotto direttamente si traduce in una formazione di osteofiti sporgenti costantemente accelerata, in un aumento del danno e dell'infiammazione della cartilagine e in un dolore surrogato misurabile nei topi maschi.
Questo modello è particolarmente adatto per lo studio dell'OA post-traumatica in fase iniziale, concentrandosi sulla formazione di osteofiti, sulla presentazione del dolore (nei topi maschi), sulla sinovite e sulle alterazioni precoci dei parametri ossei. La consistenza della formazione degli osteofiti in questo modello rende pertinente studiare la riparazione ossea e l'ossificazione endocondrale poiché la formazione degli osteofiti è un processo di riparazione tramite ossificazione endocondrale7. Il modello imita anche i danni introdotti direttamente alla cartilagine durante gli interventi clinici, come le procedure chirurgiche artroscopiche, ed è quindi adatto anche per lo studio dell'effetto del danno cartilagineo sull'intera articolazione.
Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Ethical Review Panel dell'Università di Glasgow e dell'Università della Scozia occidentale e condotte seguendo le linee guida dell'Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (Regno Unito). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl6/J di 10 settimane, del peso di circa 25 g. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione degli animali
NOTA: Considerare il genere del topo per quanto riguarda lo scopo dello studio in quanto i modelli OA post-traumatici mostrano importanti differenze a seconda del genere 8,9,10.
- Assicurarsi che il reagente anestetico (isoflurano al 2%) sia pronto.
NOTA: L'anestesia iniettabile può essere utilizzata anche11. Data la rapida durata dell'intervento, si raccomanda l'uso dell'anestesia inalante. - Utilizzare un gruppo di età corrispondente a sham operato separatamente come controllo chirurgico.
NOTA: Il ginocchio controlaterale non deve essere utilizzato come controllo chirurgico (operazione fittizia sulla gamba controlaterale). Ciò potrebbe avere problemi in termini di benessere degli animali e probabilmente influenzerà l'andatura e le misurazioni dell'andatura. Il ginocchio controlaterale normalizza i parametri ossei intrinseci12 e agisce come un confronto accoppiato sui test del dolore evocati13. - Usa topi scheletrici maturi.
NOTA: La maggior parte della letteratura induce OA a 8-12 settimane di età. Nel presente studio, i topi hanno 10 settimane.
2. Assistenza preoperatoria (eseguita da un assistente chirurgico)
- Se trasportati da una struttura diversa, consentire almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico affinché i topi si adattino al loro nuovo ambiente.
- Eseguire un intervento chirurgico in una stanza sterile appropriatamente designata, assicurandosi che tutte le superfici siano sterili (ad esempio, utilizzare teli sterili per coprire le aree dell'intervento chirurgico).
NOTA: L'intervento è asettico. - Disporre e posizionare strumenti sterili su teli sterili.
- Pesare il mouse.
- Indurre l'anestesia introducendo il topo in una gabbia anestetica e quindi introducendo il 2% di isofluorano per un massimo di 15 minuti utilizzando un impianto di anestesia standard (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: La gabbia non deve avere anestesia "residua" prima di introdurre il topo. - Una volta anestetizzata, estrarre il topo dalla camera anestetica e tagliare la pelliccia sopra il ginocchio, i lati anteriori e laterali da metà stinco a metà coscia con piccoli tagliacapelli.
NOTA: La scelta del ginocchio degli arti posteriori dipende dalla preferenza dell'operatore su quale lato trova più facile condurre l'intervento. Questo protocollo operava sulla gamba sinistra. - Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato (non risponde al pizzicamento del piede).
- Disinfettare la pelle applicando detergenti antibatterici (ad esempio, contenenti clorexidina o iodoporo, vedere la tabella dei materiali) sulla pelle esposta rasata.
- Per l'analgesia, somministrare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea.
- Posizionare il mouse sul lato dorsale, lasciando il ginocchio da operare verso l'alto, e posizionare il naso del topo nell'ugello collegato al rig anestetico.
- Coprire il mouse con un drappo sterile con una piccola apertura del buco della serratura.
- Posizionare la gamba da operare con il ginocchio flesso a meno di 90°, con il legamento rotuleo rivolto verso l'alto e il piede immobilizzato con nastro chirurgico.
3. Destabilizzazione della procedura del menisco mediale seguita da graffio della cartilagine
- Regolare il microscopio per concentrarsi sul legamento rotuleo.
- Pizzicare la pelle del ginocchio sul lato laterale con una pinza seghettata (vedi Tabella dei materiali), fare un piccolo taglio parallelo al tendine rotuleo distale usando le forbici chirurgiche, introdurre le forbici ed espandere il taglio a circa 1 cm. Spostare la pelle sul lato mediale, esponendo il legamento rotuleo e il plateau tibiale prossimale (Figura 1).
- Con una lama numero 11, praticare un'incisione lungo il lato mediale del legamento rotuleo, dalla parte superiore a quella inferiore del legamento (Figura 1A). Quando si raggiunge la parte inferiore del legamento rotuleo, ruotare la lama di 90 ° ed estendere l'incisione lontano dal legamento rotuleo verso il lato mediale per accedere alla capsula articolare.
NOTA: in questa o nelle fasi successive può verificarsi sanguinamento. Se si verifica sanguinamento, utilizzare un cotton fioc sterile e applicare una pressione per alcuni secondi (da 5 a 30 s). - Pizzicare il legamento rotuleo con una pinza a punta smussata e ruotare il polso per spostare il legamento rotuleo sul lato laterale, quanto basta per esporre il cuscinetto adiposo infrarotuleo (IFP).
NOTA: Per ridurre al minimo i danni al legamento rotuleo, non tenere le pinzette troppo strette, quanto basta per mantenere il legamento di lato. - Tenendo ancora leggermente il legamento rotuleo, pizzicare l'IFP con micro-pinzette (vedi Tabella dei materiali) per sollevarlo e spostarlo leggermente verso l'alto. Ciò consente di visualizzare il legamento del menisco mediale.
- Identificare il legamento meniscotibiale mediale (MMTL) del menisco mediale, che ancora, ancorando il corno cranico del menisco mediale al plateau tibiale anteriore (Figura 1B).
- Evitare danni e prolungata esposizione della cartilagine al plateau tibiale o condilo femorale.
- Recidere con cura la MMTL con piccole forbici a molla Vannas da 2 mm, lasciando intatti il menisco mediale e gli altri legamenti. A questo punto, la procedura chirurgica per il modello DMM è completata (Figura 1C).
- Con un coltello microchirurgico da 3 mm, segnare tre rientranze uniformemente distanziate sulla cartilagine articolare tibiale in una direzione dalla parte posteriore a quella anteriore.
NOTA: I punteggi sono lunghi circa 1 mm e danneggiano solo la superficie della cartilagine (Figura 2D).- Non usare una forza eccessiva con la lama sulla cartilagine (cioè, assicurarsi che i graffi siano superficiali). Questo passaggio aggiuntivo infligge danni alla cartilagine, inducendo il modello DCS.
- Chiudere la pelle con due o tre piccole clip metalliche con chiusura della ferita da 7 mm o suture chirurgiche sottocutanee 6-0 riassorbibili (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Le suture chirurgiche sottocutanee sono migliori in quanto evitano ulteriori interventi, ma prolungano la durata dell'intervento. Le suture esterne aumentano il rischio di apertura della ferita da rosicchiare i topi. - Identificare il legamento meniscotibiale mediale del menisco mediale per la chirurgia fittizia, ma non recidere.
- Per i topi che ricevono solo graffi di cartilagine, fare i tre graffi superficiali senza recidere il legamento.
NOTA: Tra un mouse e l'altro, cambiare i guanti e sterilizzare gli strumenti tramite autoclave. Ricordarsi di controllare che gli strumenti si siano raffreddati prima di riutilizzarli.
4. Assistenza post-operatoria
- Se si è verificato sanguinamento (>50 uL), iniettare 500 μL di soluzione salina sterile calda per via sottocutanea (sul dorso del topo).
NOTA: Nella nostra esperienza, anche se i topi hanno sanguinamenti minori, non è mai più di una piccola goccia, e quindi i liquidi non hanno bisogno di essere reintegrati. - Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il topo in una gabbia di recupero su un fazzoletto di carta pulito e consentire il recupero dall'anestesia (5-10 min).
- Trasferire i topi pienamente coscienti in una gabbia pulita con lettiere fresche dopo l'intervento chirurgico.
- Nelle 72 ore dopo l'intervento chirurgico, monitorare eventuali segni di dolore o angoscia. Presta attenzione a:
- Cambiamenti nel peso corporeo. Sebbene il peso corporeo possa diminuire il primo e il secondo giorno, di solito non supera il 5% del peso corporeo pre-chirurgico.
- Mancanza generale di toelettatura o sovra-toelettatura intorno all'incisione.
- Segni di deterioramento generale della salute, come postura curva, smorfie facciali e / o respirazione anormale.
- Infezione della ferita come indicato da qualsiasi gonfiore, scarico o apertura della ferita.
NOTA: L'infezione può verificarsi se la ferita chirurgica si apre. Poiché la riparazione chirurgica delle ferite (ad esempio, la sostituzione di clip metalliche mancanti o la risutura) è una procedura regolamentata, assicurarsi che venga ottenuta l'approvazione pertinente prima di eseguire le riparazioni.
- Rimuovere le clip metalliche tra 5-7 giorni dopo l'intervento.
- Mantenere i topi in genere 2-52 settimane post-operatorie a seconda del disegno dello studio.
- Valutare il dolore / andatura in qualsiasi momento durante lo studio.
NOTA: Il presente studio utilizza la capacità portante dinamica come descritto al punto 5.1. - Eutanasia l'animale con un metodo approvato, secondo gli accordi nazionali di licenza, le linee guida locali e l'approvazione sperimentale.
NOTA: Nel presente studio, gli animali sono stati eutanizzati tramite dissanguamento (puntura cardiaca) in anestesia terminale seguita da lussazione cervicale14.
5. Valutazione della malattia osteoartritica
- Misurare il peso dinamico come misura surrogata del dolore seguendo i passaggi seguenti.
NOTA: Poiché i topi sono animali da preda, tendono a nascondere i comportamenti del dolore. Ciò rende difficile la misurazione del dolore. Ci sono molti modi per misurare il dolore evocato, come Von Frey15 e l'analisi dell'andatura16. Il presente studio ha misurato il carico differenziale tra la gamba osteoartritica operata e la gamba di controllo non operata su un tappetino a pressione mentre il topo era in gabbia (vedi Tabella dei materiali, Figura 2A).- Pesare il mouse. Tarare e calibrare il tappetino a pressione secondo le istruzioni specifiche del produttore (vedere Attrezzature portanti dinamiche nella tabella dei materiali). Introdurre il mouse nella gabbia.
- Registra il movimento e la pressione della zampa del mouse nella gabbia per 5 minuti. Analizza i dati acquisiti per convalidare 1 minuto, seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: L'analisi automatizzata del produttore sul software DWB (vedere l'attrezzatura portante dinamica nella tabella dei materiali) fornisce misurazioni su ciascuna zampa in proporzione al peso corporeo totale, alla quantità di tempo convalidato in cui ogni zampa è rimasta sul tappetino e una stima dell'area del tappetino occupata da ciascuna zampa. Ciò consente il calcolo del carico differenziale tra le due zampe posteriori, il carico differenziale tra le zampe anteriori e posteriori, un aumento del carico della zampa anteriore (se lo stesso mouse è stato misurato per un periodo di tempo), il tempo trascorso a sollevare la gamba OA rispetto alla gamba controlaterale e alla superficie della zampa.
- Quantificare il tessuto calcificato attraverso la tomografia microcomputerizzata (μCT).
NOTA: Sebbene l'osteosclerosi ossea subcondrale e la formazione di osteofiti possano essere misurate in sezioni istologiche, la μCT offre l'opportunità di quantificare tridimensionalmente. La risoluzione di acquisizione delle immagini in μCT a 5 μm è sufficiente, in quanto consente la visualizzazione di strutture più piccole come gli osteofiti, anche se maggiore è la risoluzione, meglio è.- Fissare le articolazioni del ginocchio in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore, quindi trasferire al 70% di EtOH.
- Scansione delle articolazioni del ginocchio in uno scanner μCT.
NOTA: Nel presente studio, i campioni sono stati scansionati su uno scanner μCT (vedi Tabella dei materiali) con un filtro in alluminio 0,5 impostato a 50 kV e 200 μA. I campioni sono stati esaminati con una dimensione voxel di 4,5 μm; 2 μm, angolo di rotazione di 0,2° per l'imaging e angolo di rotazione di 0,5° per la quantificazione. - Ricostruire le scansioni per consentire la visualizzazione 3D. Le scansioni qui presentate sono state ricostruite utilizzando un software compatibile (vedi Tabella dei materiali).
- Analizzare la sclerosi ossea subcondrale (Figura 2B) seguendo i passaggi seguenti.
- Selezionare un volume di interesse (VOI) di 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm al centro del carico del plateau tibiale mediale17.
- Normalizzare contro il fenotipo osseo intrinseco del topo analizzando la gamba non operata.
- Determinare la densità ossea subcondrale e la microarchitettura selezionando una regione di interesse (ROI) che delinea la struttura trabecolare all'interno dell'epifisi tibiale, della piastra subcondrale o dell'osso subcondrale totale nella vista coronale bidimensionale della pila utilizzando il software CTan (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Con il progredire della malattia, la separazione tra la placca subcondrale e la regione trabecolare subcondrale diventa più difficile da distinguere. Si raccomanda quindi di analizzare l'area dell'osso subcondrale selezionata dallo spazio articolare alla piastra di crescita.
- Quantificare gli osteofiti (Figura 2C) seguendo i passaggi seguenti.
- Identificare gli osteofiti nelle pile di immagini tridimensionali ricostruite utilizzando il software CTvol (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Gli osteofiti mineralizzati sono sporgenze simili all'osso tessuto visibili sul lato mediale dell'osso subcondrale18. Un esempio di questi è indicato con frecce gialle nella Figura 2C. - Contare manualmente il numero di osteofiti identificati nel lato mediale dell'articolazione del ginocchio.
- Misurare il volume degli osteofiti nell'analisi sequenziale delle immagini 2D (utilizzando l'analizzatore CT) delineando manualmente il bordo degli osteofiti, sporgendo dalla piastra subcondrale come regione di interesse (ROI) per l'analisi.
- Calcolare la densità ossea degli osteofiti come rapporto tra il volume osseo e il volume degli osteofiti utilizzando il software dell'analizzatore CT (vedere la tabella dei materiali).
- Identificare gli osteofiti nelle pile di immagini tridimensionali ricostruite utilizzando il software CTvol (vedi Tabella dei materiali).
- Valutare il danno alla cartilagine e la sinovite (Figura 2D) in base al punteggio di danno cartilagineo OARSI19 e al punteggio di sinovite20 su sezioni da 6 μm incorporate in paraffina.
- Dopo la scansione, decalcificare le articolazioni del ginocchio in EDTA al 10% a 4 °C per un minimo di 2 settimane, cambiando soluzione due volte a settimana.
- Incorporare i campioni nella paraffina. Per i trattamenti e i periodi di incubazione, vedere il file supplementare 1.
- Tagliare sezioni coronali da 5 μm di campioni incorporati in paraffina su un microtomo rotante (vedi Tabella dei materiali).
- Selezionare le sezioni nell'area in cui i condili tibiale e femorale si incontrano (Figura 2D). Selezionare due sezioni in tre aree ugualmente distanti del giunto.
NOTA: Le sezioni valutate nel presente studio sono state selezionate in aree distanti 80-100 μm. - Sezioni di colorazione con Safranin-O e Fast green (vedi Tabella dei materiali) seguendo i passaggi seguenti.
- Deparaffinizzare le sezioni immergendole (nella sequenza menzionata) in xilene per 5 minuti (2x), etanolo al 100% per 2 minuti, etanolo al 95% per 2 minuti, etanolo all'80% per 2 minuti e etanolo al 70% per 2 minuti.
- Colorare con ematossilina filtrata (vedi Tabella dei materiali) per 30 s. Quindi risciacquare in acqua di rubinetto per 5 minuti (tre volte).
- Lavare con tampone Scott (2 g di bicarbonato di sodio e 10 g di solfato di magnesio in 1 L di acqua distillata) per 2 min. Risciacquare con "acqua di rubinetto" per 5 minuti (tre volte).
- Colora per 4 minuti con lo 0,2% di verde veloce. Immergere in acido acetico glaciale all'1%, cinque volte (appena fatto ogni sessione). Risciacquare velocemente con acqua di rubinetto.
- Colora per 5 minuti con lo 0,5% di Safranin-O. Risciacquare con etanolo al 95%. Disidratare le sezioni in etanolo al 100% per 3 minuti seguito da 3 minuti in xilene.
- Sezioni di punteggio come indicato in Glasson et al. per la cartilagine19 e Jackson et al. per la sinovite20.
NOTA: Esistono altri metodi di quantificazione, come la quantificazione computerizzata di Pinamont et al.21. - Convalidare il sistema di punteggio con due punteggi diversi, in cieco all'esperimento.
Representative Results
Il carico percentuale per peso corporeo totale della gamba posteriore operata/OA è stato confrontato con la gamba controlaterale/di controllo. Sebbene anche altri parametri possano dare differenze significative, come l'aumento del carico della zampa anteriore dopo l'intervento chirurgico, un cambiamento consistente nel carico della zampa posteriore indica una preferenza per usare una gamba rispetto all'altra ed è un indicatore più diretto di un disagio significativo per il mouse a causa dello sviluppo di OA. Non ci sono stati cambiamenti significativi nel carico della gamba posteriore nel modello DMM entro 8 settimane dopo l'induzione, mentre i topi DCS favoriscono significativamente la gamba controlaterale / di controllo 2 settimane dopo l'intervento (Figura 3A).
L'osso subcondrale è stato analizzato concentrandosi sul volume sotto la regione caricata mediale del condilo tibiale. Qui abbiamo valutato la densità ossea di quest'area determinando la percentuale di osso mineralizzato all'interno della regione di interesse e calcolato il rapporto tra la gamba controlaterale e quella omolaterale. Il rapporto indica che entrambi i modelli hanno aumentato la densità ossea nell'arto interessato (rapporto superiore a 1) 4 settimane dopo l'induzione (Figura 3B). L'emergere di osteofiti è più evidente nel modello MDD, dove vi è un aumento significativo del numero e del volume rispetto al modello DMM 2 settimane dopo l'intervento (Figura 3C, D). La MDD presenta un elevato danno cartilagineo nei compartimenti tibiale e femorale mediale e nella sinovite (Figura 3E,F) 4 settimane dopo l'induzione.
Figura 1: Intervento chirurgico per indurre OA post-traumatica nel topo. Le immagini sequenziali rappresentano le diverse fasi della procedura. (A) Esposizione della capsula articolare che taglia la membrana superficiale intorno al ginocchio inserendo una lama di bisturi numero 11 sul lato mediale del legamento rotuleo e lontano dal legamento. Questo esporrà il cuscinetto di grasso infrarotuleo. (B) Identificazione e transezione del legamento meniscotibiale mediale. Per identificare il legamento, spostare il legamento rotuleo verso il lato laterale e quindi spingere il cuscinetto adiposo verso l'alto. Ciò consente la visualizzazione del legamento come una piccola linea bianca orizzontale appena sopra il condilo tibiale (indicato qui con una freccia nera). Per tagliare il legamento, la lama inferiore delle forbici a molla viene posizionata sotto il legamento, facendo attenzione a non danneggiare la cartilagine. Spostare il menisco verso il lato mediale per visualizzare il condilo tibiale. (C) Graffiare la superficie della cartilagine esposta e chiudere la ferita. Per graffiare la cartilagine, la microlama viene inserita verso il lato posteriore, dove entra in contatto con la cartilagine e poi si sposta in avanti verso la parte anteriore dell'articolazione. Una volta che i graffi sono fatti, tirare la pelle sopra il ginocchio e chiudere la ferita mediante sutura sottocutanea o con clip per ferite. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione dell'osteoartrosi nel topo . (A) Il carico dinamico consiste nell'abbinare il carico su un tappetino a pressione alla zampa corrispondente. Il carico viene quindi espresso come percentuale del peso totale. (B) L'osso subcondrale viene misurato selezionando un volume di interesse nella regione di carico del condilo tibiale mediale e selezionando la piastra subcondrale o l'osso trabecolare. Queste immagini hanno una risoluzione di 4,5 μm. (C) Gli osteofiti sono identificati e quantificati in una vista tridimensionale delle immagini μCT acquisite. Il volume degli osteofiti viene misurato selezionando un ROI che delinea il bordo dell'osteofita. La densità ossea è calcolata come il volume osseo per volume osteofita. Le immagini qui presentate sono state scattate con una risoluzione di 2 μm, ma la quantificazione viene solitamente eseguita con una risoluzione di 4,5 μm. (D) I punteggi della cartilagine e della sinovite sono presi da sezioni di 6 μm colorate con Safranin-O e verde veloce. Una sezione coronale del ginocchio del topo in cui tutti i quadranti, contrassegnati con una scatola nera, sono visibili per il punteggio e viene mostrato un ingrandimento del lato mediale. La sinovite che circonda il lato mediale dell'articolazione del ginocchio è anche visibile, specialmente sopra e sotto il menisco spostato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Valutazione rappresentativa dell'OA nei modelli DMM e DCS. (A) DWB misurato fino a 8 settimane dopo l'induzione su esperimenti effettuati dallo stesso operatore esperto. Il carico è espresso come rapporto tra il carico operato/OA rispetto al carico controlaterale/di controllo. I t-test accoppiati di entrambe le gambe sono mostrati anche nei modelli Sham (grigio), DMM (blu) e DCS (rosa). Analisi μCT 4 settimane dopo l'intervento chirurgico. (B) L'osso subcondrale è stato analizzato 4 settimane dopo l'intervento chirurgico ed espresso come rapporto tra l'omolaterale e il controlaterale %BV/TV. (C) Il numero di osteofiti e (D) il volume degli osteofiti sono stati analizzati 2 settimane dopo l'induzione. La valutazione istologica 4 settimane dopo l'induzione di (E) danno cartilagineo della cartilagine tibiale mediale e articolare femorale e (F) sinovite sono state valutate con metodi standardizzati19,20. I dati sono espressi come media ± deviazione standard, n ≥ 5. I dati sono stati confrontati mediante misure ripetute ANOVA con una correzione del test di Šídák (A), un test t accoppiato (A) o un test t di Student standard (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: Trattamento e condizioni di incubazione per l'incorporazione di paraffina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Per eseguire l'induzione chirurgica dell'artrosi post-traumatica (PTOA), si raccomanda vivamente il supporto di un assistente (ad esempio, per preparare i topi mentre l'operatore si concentra sull'intervento chirurgico). Ciò facilita la chirurgia asettica, riducendo così i rischi di infezioni e rendendo l'intervento più efficiente nei grandi esperimenti. È facile perdere il piano di messa a fuoco durante l'intervento chirurgico, quindi un microscopio che include pedali per la messa a fuoco è una caratteristica preziosa per aiutare a mantenere la sterilità durante l'intervento chirurgico. La posizione del mouse e del ginocchio è fondamentale. Il ginocchio deve essere rivolto verso l'alto e sufficientemente piegato per massimizzare l'apertura dello spazio articolare del ginocchio, facilitando l'accesso al legamento per introdurre la microlama per graffiare la superficie del condilo. Identificare la MMTL può essere difficile, soprattutto quando il cuscinetto adiposo è più grande del solito o c'è un piccolo sanguinamento. Per evitare sanguinamenti, spingere il cuscinetto di grasso verso l'alto per prevenire lacrime e successive emorragie. Se il cuscinetto adiposo è grande, questo potrebbe richiedere un po 'più di tempo, ma pazientemente continua a spingerlo verso l'alto.
Il MMTL è abbastanza vicino al condilo tibiale, quindi bisogna fare attenzione a non ferire la cartilagine quando si posiziona la lama inferiore delle forbici a molla curve sotto la MMTL. Le lame curve dovrebbero puntare verso il lato mediale e leggermente verso l'alto, parallele al condilo. Per una migliore sezionatura della MMTL, assicurarsi che le forbici siano affilate. Controllare che il menisco possa muoversi medialmente dopo aver tagliato il legamento, poiché a volte rimane un piccolo attacco che necessita di ulteriori tagli. Quando si introduce la microlama per graffiare il condilo, deve essere perpendicolare al condilo. Fai il primo graffio più vicino al centro dell'articolazione ma fai attenzione a non danneggiare il legamento crociato anteriore. Quindi spostarsi verso il lato mediale e poi dietro il menisco. I graffi potrebbero essere visibili come deboli linee bianche sulla cartilagine. Poiché di solito usiamo le clip, l'incisione iniziale viene eseguita sul lato laterale, quindi le clip sono posizionate sul lato della gamba dopo aver chiuso la ferita. Ciò evita che le clip sfregano il ginocchio mentre il mouse riacquista il movimento. Quando si utilizzano punti di sutura, l'uso di punti sottocutanei è fortemente raccomandato. Se si utilizzano punti esterni, è probabile che i topi rosicchino i punti e aprano la ferita, il che aumenterà le possibilità di infezione. Se eseguito correttamente, questo intervento non deve richiedere più di 5-10 minuti, dall'incisione alla chiusura della ferita, riducendo così al minimo l'esposizione della cartilagine e qualsiasi ulteriore danno incontrollato che possa verificarsi. Dopo l'intervento chirurgico, i topi si riprendono molto rapidamente e quasi immediatamente possono arrampicarsi nella gabbia e muoversi normalmente. Se i topi non sono attivi, consultare l'esperto appropriato nell'unità.
Per la valutazione comportamentale del dolore, è stata valutata la pesatura dinamica. Tuttavia, questo metodo può essere considerato meno sensibile di altri test del dolore evocato, come il test di von Frey15. Si raccomanda di utilizzare più di un metodo per monitorare e valutare il dolore. I cambiamenti osservati 2 settimane dopo l'intervento nella MDD, anche se transitori, indicano un carico generalmente ridotto della gamba OA rispetto alla gamba sana. Pertanto, 2 settimane dopo l'intervento di MDD possono essere utilizzati per valutare il dolore osteoartritico precoce o da lesione nei modelli murini. La visualizzazione degli osteofiti mineralizzati mediante μCT consente una quantificazione tridimensionale, che può anche essere abbinata alle sezioni istologiche12, aggiungendo un'altra dimensione allo studio dell'emergenza e dell'evoluzione degli osteofiti. Nel nostro gruppo, la presenza di osteofiti era variabile nel modello DMM tra e all'interno degli operatori (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), mentre l'induzione della MDD ha portato robustamente alla generazione di osteofiti in tutti i casi indipendentemente dall'operatore (2,6 ± 0,7 vs 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Inoltre, ci sono significativamente più osteofiti e più grandi nel modello MDD rispetto al DMM. Pertanto, la MDD è un modello ideale per lo studio della formazione degli osteofiti. La quantificazione dell'osteosclerosi limitata all'area di carico dell'osso subcondrale è anche un miglioramento nel rilevare piccoli cambiamenti. Il confronto tra il compartimento mediale della gamba operata e la gamba controlaterale offre anche un modo per normalizzare il fenotipo osseo intrinseco di quel particolare topo12. L'aggiunta dei graffi della cartilagine nel modello MDD è un mezzo controllato per indurre danni mirati alla cartilagine durante l'intervento chirurgico che accelera molti degli aspetti della malattia. Una delle conseguenze della procedura sperimentale che comporta danni intenzionali alla cartilagine stessa è che questo danno artefattuale deve essere escluso o regolato nel sistema di classificazione della cartilagine. A causa di questa limitazione, non raccomandiamo questo modello se l'obiettivo principale dello studio è comprendere l'effetto dell'osteoartrite sulla cartilagine stessa. Infine, si raccomanda vivamente di avere almeno due marcatori in cieco che classificano il danno alla cartilagine e i punteggi della sinovite. Ciò convalida e migliora la standardizzazione dei sistemi di punteggio.
Una limitazione di questo studio è che l'entità della variabilità tra tutti i parametri che confrontano i modelli DCS e DMM non è stata completamente valutata. Questo problema sarà affrontato in futuro con studi più approfonditi, che potrebbero includere anche una valutazione della variabilità tra operatori di diverse istituzioni.
In conclusione, la patogenesi accelerata dell'OA nell'attuale modello di MDD consente la rappresentazione dell'OA post-traumatica e fornisce uno strumento di ricerca potente e robusto per indagare e chiarire i meccanismi fisiopatologici sottostanti dell'OA che guidano questa malattia articolare cronica debilitante. Inoltre, consente di esplorare l'OA in una finestra temporale più breve, concentrandosi sull'osteofitogenesi, sul dolore OA e sull'effetto del danno alla cartilagine sull'intera articolazione.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere il lavoro di Gemma Charlesworth e Mandie Prior presso l'Università di Liverpool, che hanno acquisito le immagini μCT utilizzate in questa pubblicazione. Il lavoro è stato finanziato da Versus Arthritis (sovvenzioni 20199 e 22483). Lynette Dunning è stata finanziata da Versus Arthritis (sovvenzione 20199). Kendal McCulloch è stato finanziato da una borsa di studio di dottorato UWS. Carmen Huesa è stata finanziata da Versus Arthritis (sovvenzioni 20199 e 22483).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
