Summary
Het huidige protocol beschrijft de gecontroleerde microblade krassen op het oppervlak van het gewrichtskraakbeen na het destabiliseren van de muizenknie door het snijden van het mediale miniscotibiale ligament. Dit diermodel presenteert een versnelde vorm van artrose (OA) die geschikt is voor het bestuderen van osteofytvorming, osteosclerose en pijn in een vroeg stadium.
Abstract
Artrose is de meest voorkomende musculoskeletale ziekte bij mensen ouder dan 45, wat leidt tot toenemende economische en maatschappelijke kosten. Diermodellen worden gebruikt om vele aspecten van de ziekte na te bootsen. Het huidige protocol beschrijft het destabilisatie- en kraakbeenkrabmodel (DCS) van posttraumatische artrose. Op basis van de veel gebruikte destabilisatie van het mediale meniscusmodel (DMM) introduceert DCS drie krassen op het kraakbeenoppervlak. Het huidige artikel belicht de stappen om de knie te destabiliseren door het mediale meniscotibiale ligament te transecteren, gevolgd door drie opzettelijke oppervlakkige krassen op het gewrichtskraakbeen. De mogelijke analysemethoden door dynamische gewichtdragende, microcomputed tomografie en histologie worden ook gedemonstreerd. Hoewel het DCS-model niet wordt aanbevolen voor studies die zich richten op het effect van artrose op het kraakbeen, maakt het de studie van artroseontwikkeling in een korter tijdsbestek mogelijk, met speciale aandacht voor (1) osteofytvorming, (2) artrose en letselpijn, en (3) het effect van kraakbeenschade in het hele gewricht.
Introduction
Artrose (OA) is de meest voorkomende musculoskeletale ziekte bij mensen ouder dan 45, met meer dan 8,75 miljoen die een behandeling zoeken in het VK1. De toenemende prevalentie van de ziekte heeft geleid tot hogere economische en maatschappelijke kosten, levert een belangrijke bijdrage aan invaliditeit en vermindert de kwaliteit van leven voor patiënten1. Zonder beschikbare behandelingen is er een dringende noodzaak om onderzoek te versnellen om de ontwikkeling en progressie van de ziekte te begrijpen. De ziekte is complex en ook multifactorieel van aard. De belangrijkste klinische metingen van de ziekte zijn pijn en gewrichtsmobiliteit2, en artrose beïnvloedt alle weefsels in het gewricht, niet alleen het kraakbeen3. Een van de belangrijkste uitdagingen bij het begrijpen van artrose is dat het jaren, soms decennia kan duren, van de eerste presentatie / verwonding tot symptomatische ziekteprogressie met pijn en immobiliteit.
Het modelleren van artrose bij knaagdieren heeft onze kennis van OA-pathofysiologie verbeterd door ons in staat te stellen de initiatie en progressie in een veel korter tijdsbestek te begrijpen en met een gedetailleerd onderzoek van de betrokken weefsels. Er zijn talloze muizenmodellen van artrose, van genetisch gemodificeerde dieren tot chirurgische interventiemodellen. Het meest gebruikte muizenmodel van posttraumatische artrose is de destabilisatie van de mediale meniscus (DMM)4,5. Een kanttekening bij het model is de variabiliteit tussen verschillende operatoren. Ervaren chirurgen kunnen de procedure uitvoeren met minimale gewrichtsschade, terwijl onervaren operators het gewrichtskapsel gedurende langere tijd blootstellen en schade toebrengen aan het kraakbeen. Deze variabiliteit in het proces beïnvloedt de ernst van het model, waarbij meer initiële schade leidt tot verhoogde kraakbeenschadescores en osteofytvorming. Met de bedoeling om de variabiliteit tussen operators te verminderen en kraakbeenschade door klinische interventie na te bootsen, wordt een aangepaste versie van dit model ontwikkeld, waarbij gecontroleerde extra schade aan het kraakbeenoppervlak in de vorm van drie oppervlakkige krassen wordt toegebracht6. Dit maakt het ook mogelijk om de OA-progressie te modelleren als gevolg van kraakbeenschade veroorzaakt door sommige klinische interventies. In vergelijking met het standaard DMM-model resulteert de direct geïnduceerde kraakbeenschade in consistent versnelde uitstekende osteofytvorming, verhoogde kraakbeenschade en -ontsteking en meetbare surrogaatpijn bij mannelijke muizen.
Dit model is met name geschikt voor de studie van posttraumatische artrose in een vroeg stadium, met de nadruk op osteofytvorming, pijnpresentatie (bij mannelijke muizen), synovitis en vroege veranderingen in botparameters. De consistentie van osteofytvorming in dit model maakt het relevant om botherstel en endochondrale ossificatie te bestuderen, aangezien osteofytvorming een proces van reparatie is via endochondrale ossificatie7. Het model bootst ook schade na die rechtstreeks in het kraakbeen wordt geïntroduceerd tijdens klinische interventies, zoals artroscopische chirurgische procedures, en is dus ook geschikt voor de studie van het effect van kraakbeenschade op het hele gewricht.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Ethical Review Panel van de University of Glasgow en de University of the West of Scotland en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK). 10 weken oude C57Bl6/J mannelijke muizen, met een gewicht van ongeveer 25 g, werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen).
1. Voorbereiding van dieren
OPMERKING: Overweeg het geslacht van de muis met betrekking tot het doel van de studie, aangezien posttraumatische OA-modellen belangrijke verschillen vertonen, afhankelijk van geslacht 8,9,10.
- Zorg ervoor dat het anesthetische reagens (2% isofluraan) klaar is.
OPMERKING: Injecteerbare anesthesie kan ook worden gebruikt11. Gezien de snelle duur van de operatie, wordt het gebruik van inhalatie-anesthesie aanbevolen. - Gebruik een afzonderlijke schijnoperatieve leeftijdsgematchte groep als chirurgische controle.
OPMERKING: De contralaterale knie mag niet worden gebruikt als een chirurgische controle (schijnoperatie op het contralaterale been). Dit kan problemen hebben op het gebied van dierenwelzijn en het zal waarschijnlijk van invloed zijn op loop- en loopmetingen. De contralaterale knie normaliseert intrinsieke botparameters12 en fungeert als een gepaarde vergelijking op opgeroepen pijntests13. - Gebruik skeletmatig volwassen muizen.
OPMERKING: De meeste literatuur induceert artrose op de leeftijd van 8-12 weken. In deze studie zijn de muizen 10 weken oud.
2. Pre-operatieve zorg (uitgevoerd door een operatieassistent)
- Indien vervoerd vanuit een andere faciliteit, laat muizen dan ten minste 1 week voorafgaand aan de chirurgische ingreep toe om zich aan te passen aan hun nieuwe omgeving.
- Voer een operatie uit in een speciaal aangewezen steriele ruimte en zorg ervoor dat alle oppervlakken steriel zijn (gebruik bijvoorbeeld steriele gordijnen om gebieden van chirurgie te bedekken).
OPMERKING: De operatie is aseptisch. - Schik en plaats steriele instrumenten op steriele gordijnen.
- Weeg de muis.
- Anesthesie induceren door de muis in een anesthesiekooi te brengen en vervolgens 2% isofluoraan gedurende maximaal 15 minuten in te brengen met behulp van een standaard anestheticum (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De kooi mag geen "resterende" anesthesie hebben voordat de muis wordt geïntroduceerd. - Eenmaal verdoofd, haal je de muis uit de verdovingskamer en knip je de vacht over de knie, voorkant en zijkanten van het middenscheenbeen tot het midden van de dij met kleine tondeuses.
OPMERKING: De keuze van de achterste knie is afhankelijk van de voorkeur van de operator aan welke kant ze de operatie gemakkelijker kunnen uitvoeren. Dit protocol opereerde op het linkerbeen. - Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is (reageert niet op knijpen in de voet).
- Desinfecteer de huid door antibacteriële huidreiniger (bijv. chloorhexidine of joodphor bevattend, zie materiaaltabel) aan te brengen op de geschoren blootgestelde huid.
- Voor analgesie, dien 0,05 mg/kg buprenorfine subcutaan toe.
- Plaats de muis aan de dorsale kant, laat de knie naar boven opereren en plaats de muizenneus in het mondstuk dat is aangesloten op de verdovingsinstallatie.
- Bedek de muis met een steriel gordijn met een kleine sleutelgatopening.
- Plaats het te opereren been met de knie gebogen op minder dan 90°, met de patellapeesband naar boven gericht en de voet geïmmobiliseerd met chirurgische tape.
3. Destabilisatie van de mediale meniscusprocedure gevolgd door kraakbeenkrab
- Pas de microscoop aan om scherp te stellen op het patellapeesband.
- Knijp de huid van de knie aan de zijkant met gekartelde tang (zie Materiaaltabel), maak een kleine snede parallel aan de distale patellapees met een chirurgische schaar, introduceer de schaar en breid de snede uit tot ongeveer 1 cm. Verplaats de huid naar de mediale kant, waarbij het patellapeesband en het proximale tibiale plateau worden blootgelegd (figuur 1).
- Maak met een mes met nummer 11 een incisie langs de mediale kant van het patellapeesband, van de bovenkant naar de onderkant van het ligament (figuur 1A). Wanneer u de onderkant van het patellapeesband bereikt, draait u het blad 90 ° en verlengt u de incisie weg van het patella ligament naar de mediale kant om toegang te krijgen tot het gewrichtskapsel.
OPMERKING: Bloedingen kunnen optreden in deze of de volgende stappen. Als er een bloeding optreedt, gebruik dan een steriel wattenstaafje en oefen een paar seconden (5 tot 30 s) druk uit. - Knijp het patella ligament met een stompe tiptang en draai de pols om het patella ligament naar de zijkant te verplaatsen, net genoeg om de infrapatellar fat pad (IFP) bloot te leggen.
OPMERKING: Om schade aan het patella ligament te minimaliseren, houd het pincet niet te strak, net voldoende om het ligament opzij te houden. - Terwijl u het patella ligament nog steeds licht vasthoudt, knijpt u de IFP met een micro-pincet (zie Materiaaltabel) om deze op te tillen en iets omhoog te bewegen. Dit maakt het mogelijk om het mediale meniscusband te visualiseren.
- Identificeer het mediale meniscotibiale ligament (MMTL) van de mediale meniscus, die de schedelhoorn van de mediale meniscus verankert aan het voorste tibiale plateau (figuur 1B).
- Vermijd schade en langdurige blootstelling aan kraakbeen op het tibiale plateau of de femorale condylus.
- Knip de MMTL voorzichtig door met een kleine 2 mm blad Vannas veerschaar, waarbij de mediale meniscus en andere ligamenten intact blijven. Op dit punt is de chirurgische procedure voor het DMM-model voltooid (figuur 1C).
- Markeer met een microchirurgisch mes van 3 mm drie gelijkmatig verdeelde inkepingen op het tibiale gewrichtskraakbeen in een richting van het achterste naar het voorste deel.
OPMERKING: De partituren zijn ongeveer 1 mm lang en beschadigen alleen het oppervlak van het kraakbeen (figuur 2D).- Gebruik geen overmatige kracht met het mes op het kraakbeen (d.w.z. zorg ervoor dat de krassen oppervlakkig zijn). Deze extra stap brengt kraakbeenschade toe, waardoor het DCS-model wordt geïnduceerd.
- Sluit de huid met twee of drie kleine metalen clips met wondsluiting van 7 mm of absorbeerbare 6-0 subdermale chirurgische hechtingen (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Subdermale chirurgische hechtingen zijn beter omdat ze verdere interventie vermijden, maar ze verlengen de duur van de operatie. Externe hechtingen verhogen het risico op wondopening door het knagen van de muizen. - Identificeer het mediale meniscotibiale ligament van de mediale meniscus voor schijnchirurgie, maar scheid niet.
- Voor muizen die alleen kraakbeenkrabben krijgen, maak de drie oppervlakkige krassen zonder het ligament te verbreken.
OPMERKING: Wissel tussen elke muis handschoenen en steriliseer instrumenten via een autoclaaf. Vergeet niet om te controleren of de instrumenten zijn afgekoeld voordat ze opnieuw worden gebruikt.
4. Postoperatieve zorg
- Als er een bloeding is opgetreden (>50 uL), injecteer dan 500 μL warme steriele zoutoplossing subcutaan (op de rug van de muis).
OPMERKING: In onze ervaring, hoewel muizen kleine bloedingen hebben, is het nooit meer dan een kleine druppel en hoeven vloeistoffen dus niet te worden aangevuld. - Plaats de muis na de operatie in een herstelkooi op een schoon papieren zakdoekje en laat herstel van anesthesie (5-10 min).
- Breng de volledig bewuste muizen na de operatie over in een schone kooi met vers beddengoed.
- Controleer in de 72 uur na chirurgische ingreep op tekenen van pijn of angst. Let op:
- Veranderingen in lichaamsgewicht. Hoewel het lichaamsgewicht op de eerste en tweede dag kan afnemen, is dit meestal niet meer dan 5% van het pre-chirurgische lichaamsgewicht.
- Algemeen gebrek aan verzorging of over-grooming rond de incisie.
- Tekenen van algemene verslechtering van de gezondheid, zoals een gebogen houding, grimassen in het gezicht en / of abnormale ademhaling.
- Wondinfectie zoals aangegeven door zwelling, afscheiding of opening van de wond.
OPMERKING: Infectie kan optreden als de chirurgische wond opent. Aangezien chirurgische wondreparatie (bijvoorbeeld het vervangen van ontbrekende metalen clips of opnieuw hechten) een gereguleerde procedure is, moet u ervoor zorgen dat de relevante goedkeuring wordt verkregen voordat reparaties worden uitgevoerd.
- Verwijder metalen clips tussen 5-7 dagen na de operatie.
- Houd muizen meestal 2-52 weken na de operatie, afhankelijk van de onderzoeksopzet.
- Evalueer pijn/gang op elk moment tijdens het onderzoek.
OPMERKING: In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van dynamisch gewichtdragen zoals beschreven in stap 5.1. - Euthanaseer het dier via een goedgekeurde methode, volgens de nationale licentieovereenkomsten, lokale richtlijnen en experimentele goedkeuring.
OPMERKING: In deze studie werden de dieren geëuthanaseerd via exsanguinatie (hartpunctie) onder terminale anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie14.
5. Evaluatie van artrose
- Meet dynamisch gewicht dragen als een surrogaatmeting van pijn volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Omdat muizen prooidieren zijn, hebben ze de neiging om pijngedrag te verbergen. Dit maakt het meten van pijn moeilijk. Er zijn veel manieren om opgewekte pijn te meten, zoals Von Frey15 en loopanalyse16. De huidige studie mat het verschil in belasting tussen het geopereerde artrosebeen en het niet-geopereerde controlebeen op een drukmat terwijl de muis in een kooi zat (zie Materiaaltabel, figuur 2A).- Weeg de muis. Tarra en kalibreer de drukmat volgens de specifieke instructies van de fabrikant (zie Dynamische gewichtdragende apparatuur in materiaaltabel). Introduceer de muis in de kooi.
- Registreer beweging en pootdruk van de muis in de kooi gedurende 5 minuten. Analyseer verkregen gegevens om 1 minuut te valideren, volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: De geautomatiseerde analyse van de fabrikant op DWB-software (zie dynamische gewichtdragende apparatuur in de tabel met materialen) biedt metingen aan elke poot in verhouding tot het totale lichaamsgewicht, de hoeveelheid gevalideerde tijd dat elke poot op de mat bleef en een schatting van het matoppervlak dat door elke poot werd ingenomen. Dit maakt de berekening mogelijk van de differentiële belasting tussen de twee achterpoten, de differentiële belasting tussen de voor- en achterpoten, een toename van de belasting van de voorpoot (als dezelfde muis gedurende een bepaalde periode is gemeten), de tijd die wordt besteed aan het optillen van het OA-been in vergelijking met het contralaterale been en het pootoppervlak.
- Kwantificeer verkalkt weefsel door middel van microcomputed tomografie (μCT).
OPMERKING: Hoewel subchondrale botosterose en osteofytenvorming in histologische secties kunnen worden gemeten, biedt μCT de mogelijkheid om driedimensionaal te kwantificeren. De resolutie van beeldopname in μCT bij 5 μm is voldoende, omdat dit visualisatie van kleinere structuren zoals de osteofyten mogelijk maakt, hoewel hoe hoger de resolutie, hoe beter.- Bevestig kniegewrichten in 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 24 uur en breng vervolgens over naar 70% EtOH.
- Scan kniegewrichten in een μCT-scanner.
OPMERKING: In deze studie werden de monsters gescand op een μCT-scanner (zie Tabel van materialen) met een 0,5 aluminium filter ingesteld op 50 kV en 200 μA. Monsters werden onderzocht bij een voxelgrootte van 4,5 μm; 2 μm, 0,2° rotatiehoek voor beeldvorming en 0,5° rotatiehoek voor kwantificering. - Reconstrueer scans om 3D-visualisatie mogelijk te maken. De hier gepresenteerde scans zijn gereconstrueerd met behulp van compatibele software (zie Materiaaltabel).
- Analyseer subchondrale botsclerose (figuur 2B) volgens de onderstaande stappen.
- Selecteer een interessant volume (VOI) van 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm in het midden van de belasting van het mediale tibiale plateau17.
- Normaliseer tegen het intrinsieke botfenotype van de muis door het niet-geopereerde been te analyseren.
- Bepaal de subchondrale botdichtheid en micro-architectuur door een gebied van belang (ROI) te selecteren dat de trabeculaire structuur binnen de tibiale epifyse, de subchondrale plaat of het totale subchondrale bot in de tweedimensionale coronale weergave van de stapel afbakent met behulp van CTan-software (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Naarmate de ziekte vordert, wordt de scheiding tussen de subchondrale plaat en het subchondrale trabeculaire gebied moeilijker te onderscheiden. Het wordt vervolgens aanbevolen om het gebied van subchondraal bot te analyseren dat is geselecteerd uit de gewrichtsruimte tot de groeischijf.
- Kwantificeer osteofyten (figuur 2C) volgens de onderstaande stappen.
- Identificeer osteofyten in de gereconstrueerde driedimensionale beeldstapels met behulp van CTvol-software (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Gemineraliseerde osteofyten zijn uitsteeksels die lijken op geweven bot zichtbaar aan de mediale kant van het subchondrale bot18. Een voorbeeld hiervan wordt aangegeven met gele pijlen in figuur 2C. - Tel handmatig het aantal geïdentificeerde osteofyten in de mediale kant van het kniegewricht.
- Meet het osteofytvolume in 2D sequentiële beeldanalyse (met behulp van de CT-analyzer) door de rand van osteofyten handmatig af te bakenen, die uit de subchondrale plaat steekt als het gebied van belang (ROI) voor analyse.
- Bereken de botdichtheid van osteofyten als de verhouding tussen botvolume en osteofytvolume met behulp van de CT-analysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Identificeer osteofyten in de gereconstrueerde driedimensionale beeldstapels met behulp van CTvol-software (zie Materiaaltabel).
- Evalueer kraakbeenschade en synovitis (figuur 2D) volgens de OARSI kraakbeenschadescore19 en synovitisscore20 op paraffine-ingebedde secties van 6 μm.
- Na het scannen, ontkalken kniegewrichten in 10% EDTA bij 4 °C gedurende minimaal 2 weken, waarbij de oplossing tweemaal per week wordt vervangen.
- Sluit monsters in paraffine in. Voor behandelingen en incubatietijden, zie Aanvullend Dossier 1.
- Snijd 5 μm coronale secties van paraffine-ingebedde monsters op een roterend microtoom (zie Materiaaltabel).
- Selecteer secties in het gebied waar de tibiale en femorale condylusen elkaar ontmoeten (figuur 2D). Selecteer twee secties in drie gebieden met gelijke afstand van het gewricht.
OPMERKING: Secties gescoord in de huidige studie werden geselecteerd in gebieden 80-100 μm uit elkaar. - Beitssecties met Safranin-O en Snelgroen (zie Materiaaltabel) volgens de onderstaande stappen.
- Deparaffiniseer secties door ze (in de genoemde volgorde) onder te dompelen in Xyleen gedurende 5 minuten (2x), 100% ethanol gedurende 2 minuten, 95% ethanol gedurende 2 minuten, 80% ethanol gedurende 2 minuten en 70% ethanol gedurende 2 minuten.
- Vlek met gefilterd Hematoxyline (zie Materiaaltabel) gedurende 30 s. Spoel vervolgens 5 minuten (drie keer) in leidingwater.
- Was met Scott's buffer (2 g natriumbicarbonaat en 10 g magnesiumsulfaat in 1 l gedestilleerd water) gedurende 2 min. Spoel in 'kraanwater' gedurende 5 minuten (drie keer).
- Beits gedurende 4 min met 0,2% Snelgroen. Dip in 1% ijsazijn, vijf keer (elke sessie vers gemaakt). Spoel snel af in kraanwater.
- Vlek gedurende 5 min met 0,5% Safranin-O. Spoel in 95% ethanol. Droog secties in 100% ethanol gedurende 3 minuten gevolgd door 3 minuten in xyleen.
- Scoresecties zoals vermeld in Glasson et al. voor kraakbeen19 en Jackson et al. voor synovitis20.
OPMERKING: Er bestaan andere kwantificeringsmethoden, zoals de computergebaseerde kwantificering door Pinamont et al.21. - Valideer het scoresysteem met twee verschillende scorers, blind voor het experiment.
Representative Results
De procentuele belasting per totaal lichaamsgewicht van het achterbeen werd vergeleken met het contralaterale/controlebeen. Hoewel andere parameters ook significante verschillen kunnen geven, zoals de toename van de voorpootbelasting na chirurgische ingreep, duidt een consistente verandering in de belasting van de achterpoot op een voorkeur om één been boven het andere te gebruiken en is het een meer directe indicator van aanzienlijk ongemak voor de muis als gevolg van de ontwikkeling van artrose. Er waren geen significante veranderingen in de belasting van de achterpoot in het DMM-model binnen 8 weken na inductie, terwijl DCS-muizen significant 2 weken na de interventie de voorkeur geven aan het contralaterale / controlebeen (figuur 3A).
Subchondraal bot werd geanalyseerd door zich te concentreren op het volume onder het mediale geladen gebied van de tibiale condylus. Hier hebben we de botdichtheid van dit gebied beoordeeld door het percentage gemineraliseerd bot binnen het interessegebied te bepalen en de verhouding tussen het contralaterale en het ipsilaterale been te berekenen. De verhouding geeft aan dat beide modellen een verhoogde botdichtheid hebben in de aangedane ledemaat (verhouding boven 1) 4 weken na inductie (figuur 3B). De opkomst van osteofyten is prominenter in het DCS-model, waar er een significante toename is in het aantal en volume in vergelijking met het DMM-model 2 weken na interventie (figuur 3C, D). DCS presenteert verhoogde kraakbeenschade in de mediale tibiale en femorale compartimenten en synovitis (figuur 3E, F) 4 weken na inductie.
Figuur 1: Chirurgische ingreep om posttraumatische artrose bij de muis te induceren. Opeenvolgende afbeeldingen vertegenwoordigen de verschillende fasen van de procedure. (A) Blootstelling van het gewrichtskapsel dat het oppervlakkige membraan rond de knie snijdt door een scalpelblad met nummer 11 in te brengen aan de mediale kant van het patellapeesband en weg van het ligament. Dit zal de infrapatellaire vetpad blootleggen. (B) Identificatie en transsectie van het mediale meniscotibiale ligament. Om het ligament te identificeren, verplaatst u het patellapeesband naar de laterale kant en duwt u vervolgens het vetkussen omhoog. Dit maakt de visualisatie van het ligament mogelijk als een kleine horizontale witte lijn net boven de tibiale condylus (hier aangegeven met een zwarte pijl). Om het ligament te knippen, wordt het onderste mes van de veerschaar onder het ligament geplaatst, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het kraakbeen niet wordt beschadigd. Beweeg de meniscus naar de mediale kant om de tibiale condylus te visualiseren. (C) Krabben aan het oppervlak van het blootgestelde kraakbeen en sluiting van de wond. Om het kraakbeen te krabben, wordt de microblade naar de achterste kant ingebracht, waar het contact maakt met het kraakbeen en vervolgens naar voren beweegt naar het voorste deel van het gewricht. Zodra de krassen zijn gedaan, trekt u de huid over de knie en sluit u de wond door subdermaal hechten of met wondklemmen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Evaluatie van artrose bij de muis. (A) Dynamisch gewichtdragen bestaat uit het afstemmen van de belasting op een drukmat op de overeenkomstige poot. De belasting wordt dan uitgedrukt als een percentage van het totale gewicht. (B) Subchondraal bot wordt gemeten door een volume te selecteren dat van belang is voor het laadgebied van de mediale tibiale condylus en door de subchondrale plaat of het trabeculaire bot te selecteren. Deze beelden hebben een resolutie van 4,5 μm. (C) Osteofyten worden geïdentificeerd en gekwantificeerd in een driedimensionale weergave van de verkregen μCT-beelden. Het volume osteofyten wordt gemeten door een ROI te selecteren die de rand van de osteofyt afbakent. De botdichtheid wordt berekend als het botvolume per osteofytvolume. De hier gepresenteerde beelden zijn gemaakt met een resolutie van 2 μm, maar kwantificering gebeurt meestal met een resolutie van 4,5 μm. (D) Kraakbeen- en synovitisscores worden genomen uit secties van 6 μm gekleurd met Safranin-O en Fast green. Een coronaal gedeelte van de muizenknie waar alle kwadranten, gemarkeerd met een zwarte doos, zichtbaar zijn voor scoren en een vergroting van de mediale kant wordt getoond. De synovitis rond de mediale kant van het kniegewricht is ook zichtbaar, vooral boven en onder de verplaatste meniscus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve evaluatie van artrose in de DMM- en dcs-modellen. (A) DWB gemeten tot 8 weken na inductie op experimenten uitgevoerd door dezelfde deskundige operator. De belasting wordt uitgedrukt als een verhouding tussen de bediende/vve-belasting en de contralaterale/regelbelasting. Gepaarde t-tests van beide benen worden ook getoond in de Sham (grijs), DMM (blauw) en DCS (roze) modellen. μCT-analyse 4 weken na chirurgische ingreep. (B) Subchondraal bot werd 4 weken na chirurgische ingreep geanalyseerd en uitgedrukt als de verhouding van het ipsilaterale over het contralaterale %BV/TV. (C) Het aantal osteofyten en (D) het osteofytenvolume werden 2 weken na inductie geanalyseerd. Histologische evaluatie 4 weken na inductie van (E) kraakbeenschade van het mediale tibiale en femorale gewrichtskraakbeen en (F) synovitis werden gescoord met gestandaardiseerde methoden19,20. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, n ≥ 5. De gegevens werden vergeleken door herhaalde metingen van ANOVA met een Šídák-testcorrectie (A), een gepaarde t-test (A) of een standaard Student's t-test (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Behandeling en incubatievoorwaarde voor paraffine-inbedding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Om chirurgische inductie van posttraumatische artrose (PTOA) uit te voeren, wordt ondersteuning van een assistent sterk aanbevolen (bijvoorbeeld om de muizen voor te bereiden terwijl de operator zich op de operatie concentreert). Dit vergemakkelijkt aseptische chirurgie, waardoor het risico op infecties wordt verminderd en de interventie efficiënter wordt in grote experimenten. Het is gemakkelijk om het focusvlak tijdens de operatie te verliezen, dus een microscoop met pedalen om te focussen is een waardevolle functie om de steriliteit tijdens de operatie te behouden. De positie van de muis en de knie is cruciaal. De knie moet naar boven gericht zijn en voldoende gebogen om de opening van de kniegewrichtsruimte te maximaliseren, waardoor de toegang tot het ligament gemakkelijker wordt voor het introduceren van de microblade om het condyle-oppervlak te krassen. Het identificeren van de MMTL kan een uitdaging zijn, vooral wanneer het vetkussen groter is dan normaal of er een kleine bloeding is. Om bloedingen te voorkomen, duwt u het vetkussen omhoog om tranen en daaropvolgende bloedingen te voorkomen. Als het vetkussen groot is, kan dit iets langer duren, maar blijf het geduldig omhoog duwen.
De MMTL bevindt zich vrij dicht bij de tibiale condylus, dus men moet ervoor zorgen dat het kraakbeen niet wordt verwond bij het plaatsen van het onderste blad van de gebogen veerschaar onder de MMTL. De gebogen bladen moeten naar de mediale kant wijzen en iets naar boven, parallel aan de condylus. Voor de beste sectie van de MMTL, zorg ervoor dat de schaar scherp is. Controleer of de meniscus mediaal kan bewegen na het doorsnijden van het ligament, omdat er soms een kleine aanhechting overblijft die verder moet worden doorgesneden. Bij het introduceren van de microblade om de condylus te krassen, moet deze loodrecht op de condylus staan. Maak de eerste kras dichter bij het midden van het gewricht, maar zorg ervoor dat u de voorste kruisband niet beschadigt. Ga dan naar de mediale kant en dan achter de meniscus. De krassen kunnen zichtbaar zijn als vage witte lijnen op het kraakbeen. Omdat we meestal clips gebruiken, wordt de initiële incisie aan de laterale kant uitgevoerd, zodat de clips na het sluiten van de wond aan de zijkant van het been worden geplaatst. Dit voorkomt dat de clips over de knie wrijven als de muis weer in beweging komt. Bij het gebruik van hechtingen wordt het gebruik van subdermale hechtingen sterk aanbevolen. Als u externe hechtingen gebruikt, zullen de muizen waarschijnlijk aan de hechtingen knagen en hun wond openen, wat de kans op infectie zal vergroten. Wanneer deze operatie goed wordt uitgevoerd, mag deze niet meer dan 5-10 minuten duren, van incisie tot wondsluiting, waardoor de blootstelling van het kraakbeen en eventuele extra ongecontroleerde schade die kan optreden, wordt geminimaliseerd. Na de operatie herstellen de muizen zeer snel en kunnen ze bijna onmiddellijk in de kooi klimmen en normaal bewegen. Als de muizen niet actief zijn, moet de juiste deskundige in de eenheid worden geraadpleegd.
Voor de gedragsevaluatie van pijn werd dynamisch gewichtdragendheid beoordeeld. Deze methode kan echter als minder gevoelig worden beschouwd dan andere opgeroepen pijntests, zoals von Frey-testen15. Het wordt aanbevolen dat meer dan één methode wordt gebruikt om pijn te controleren en te beoordelen. De veranderingen die 2 weken na interventie in DCS werden waargenomen, hoewel van voorbijgaande aard, wijzen op een over het algemeen verminderde belasting van het OA-been in vergelijking met het gezonde been. Daarom kan 2 weken na DCS-interventie worden gebruikt om vroege artrose- of letselpijn in muismodellen te evalueren. Visualisatie van gemineraliseerde osteofyten door μCT maakt driedimensionale kwantificering mogelijk, die ook kan worden afgestemd op de histologische secties12, waardoor een andere dimensie wordt toegevoegd aan de studie van het ontstaan en de evolutie van osteofyten. In onze groep was de aanwezigheid van osteofyten variabel in het DMM-model tussen en binnen operators (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), terwijl inductie van DCS in alle gevallen robuust leidde tot osteofytengeneratie, ongeacht de operator (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Ook zijn er aanzienlijk meer en grotere osteofyten in het DCS-model in vergelijking met DMM. DCS is dus een ideaal model voor de studie van osteofytvorming. Kwantificering van osteosclerose beperkt tot het laadgebied van het subchondrale bot is ook een verbetering in het detecteren van kleine veranderingen. Het vergelijken van het mediale compartiment van het geopereerde been met het contralaterale been biedt ook een manier om te normaliseren tegen het intrinsieke botfenotype van die specifieke muis12. De toevoeging van de kraakbeenkrabben in het DCS-model is een gecontroleerd middel om gerichte kraakbeenschade tijdens een operatie op te wekken die veel van de aspecten van de ziekte versnelt. Een van de gevolgen van de experimentele procedure met opzettelijke schade aan het kraakbeen zelf is dat deze artefactuele schade moet worden uitgesloten of gecorrigeerd in het kraakbeenclassificatiesysteem. Vanwege deze beperking raden we dit model niet aan als het belangrijkste doel van de studie is om het effect van artrose op het kraakbeen zelf te begrijpen. Ten slotte wordt het ook sterk aanbevolen om ten minste twee geblindeerde scorers de kraakbeenschade en synovitisscores te laten beoordelen. Dit valideert en verbetert de standaardisatie van de scoresystemen.
Een beperking van deze studie is dat de mate van variabiliteit tussen alle parameters die de DCS- en DMM-modellen vergelijken, niet volledig werd geëvalueerd. Dit zal in de toekomst worden aangepakt met uitgebreidere studies, die ook een beoordeling van de variabiliteit tussen exploitanten van verschillende instellingen kunnen omvatten.
Kortom, de versnelde OA-pathogenese in het huidige DCS-model maakt representatie van posttraumatische OA mogelijk en biedt een krachtig en robuust onderzoeksinstrument om onderliggende OA pathofysiologische mechanismen die deze chronische slopende gewrichtsziekte aansturen te onderzoeken en op te helderen. Bovendien maakt het het mogelijk om artrose in een korter tijdsbestek te onderzoeken, met de nadruk op osteofytogenese, OA-pijn en het effect van kraakbeenschade op het hele gewricht.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag het werk van Gemma Charlesworth en Mandie Prior van de Universiteit van Liverpool erkennen, die de μCT-afbeeldingen hebben verkregen die in deze publicatie worden gebruikt. Het werk werd gefinancierd door Versus Arthritis (subsidies 20199 en 22483). Lynette Dunning werd gefinancierd door Versus Arthritis (subsidie 20199). Kendal McCulloch werd gefinancierd door een UWS PhD-beurs. Carmen Huesa werd gefinancierd door Versus Arthritis (subsidies 20199 en 22483).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
