Summary
Den nuværende protokol beskriver optimeringen af eksperimentelle parametre, når man bruger transesophageal atrial pacing til at vurdere følsomhed over for atrieflimren hos mus.
Abstract
Musemodeller af genetiske og erhvervede risikofaktorer for atrieflimren (AF) har vist sig værdifulde til at undersøge de molekylære determinanter for AF. Programmeret elektrisk stimulering kan udføres ved hjælp af transesophageal atrial pacing som en overlevelsesprocedure, hvilket muliggør seriel test i det samme dyr. Der findes dog adskillige tempoprotokoller, hvilket komplicerer reproducerbarheden. Denne protokol har til formål at tilvejebringe en standardiseret strategi til udvikling af modelspecifikke eksperimentelle parametre for at forbedre reproducerbarheden mellem undersøgelser. Indledende undersøgelser udføres for at optimere de eksperimentelle metoder til den specifikke model, der undersøges, herunder alder på undersøgelsestidspunktet, køn og parametre for pacingprotokollen (f.eks. Tempotilstand og definition af AF-modtagelighed). Det er vigtigt, at man sørger for at undgå høje stimulusenergier, da dette kan forårsage stimulering af ganglionic plexi med utilsigtet parasympatisk aktivering, manifesteret af overdreven atrioventrikulær (AV) blok under pacing og ofte forbundet med artefaktuel AF-induktion. Dyr, der påviser denne komplikation, skal udelukkes fra analysen.
Introduction
Atrieflimren (AF) repræsenterer en endelig fælles vej for flere erhvervede og genetiske risikofaktorer. For undersøgelser, der undersøger de patofysiologiske mekanismer i AF-substratet, er musemodeller fordelagtige i betragtning af den lette genetiske manipulation og det faktum, at de generelt reproducerer AF-modtageligheden observeret hos mennesker for forskellige kliniske fænotyper 1,2,3. Mus udvikler dog sjældent spontan AF4, hvilket nødvendiggør brug af provokerende undersøgelser af atrietempo.
Programmeret elektrisk stimulering (PES) kan udføres for at vurdere murine atrial elektrofysiologi og AF-modtagelighed ved hjælp af enten intracardiac5 eller transesophageal6 pacing. Mens den transesophageale tilgang er særlig fordelagtig som en overlevelsesprocedure, kompliceres dens anvendelse af de mange offentliggjorte eksperimentelle protokoller7,8 og kilder til variabilitet, der kan hindre reproducerbarhed9. Desuden gør begrænsede rapporterede protokolsammenligninger det udfordrende at vælge en passende tempoprotokol.
Den nuværende protokol sigter mod at anvende en systematisk strategi til at udvikle modelspecifikke transesophageal PES-metoder til vurdering af murine AF-modtagelighed for at øge reproducerbarheden. Det er vigtigt, at indledende pilotundersøgelser udføres for at optimere tempoprotokollen ved at tage højde for alders-, køns- og tempotilstandsvariation, med tempo designet til at minimere utilsigtet parasympatisk stimulering, der kan forvirre resultater9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure blev godkendt af Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee og er i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr. Protokollen blev udviklet ved hjælp af både genetisk9 ogerhvervede 10 (f.eks. Hypertension) musemodeller af AF-modtagelighed. Operatøren blev blindet for fænotypen af musen under undersøgelse.
1. Dyrevalg
- For genetiske modeller skal mus udsættes for to ugentlige (dvs. hver anden uge) atrietempo som beskrevet nedenfor (se trin 6.) for at bestemme den optimale periode med AF-modtagelighed.
- Begynd to ugentlige skridt ved 8 ugers alderen. Brug vildtlevende kuldkammerater som kontroller for at reducere variabiliteten. Undersøg begge køn, da man måske ikke udvikler en AF-fænotype9.
- For erhvervede modeller skal du udføre tempo, efter at mus opnår fysisk modenhed (~ 12 uger)10. Som nævnt ovenfor skal du studere begge køn.
- Under disse indledende undersøgelser skal du udføre både burst pacing8 (ved hjælp af en fast pacing cycle length [CL]) og decremental pacing7 (med en gradvist kortere pacing CL) for at bestemme den optimale pacing mode. Adskil hver procedure med mindst 24 timer.
BEMÆRK: Når et stigende antal mus undersøges, skal du gennemgå de akkumulerede data for at bestemme den optimale alder, køn og tempotilstand, der fremmer AF i AF-modtagelige mus, men ikke kontroller.- Analyser dataene ved hjælp af flere definitioner af AF-modtagelighed (f.eks. antal AF-episoder8, total AF-varighed 9, AF-forekomst4 og vedvarende AF-forekomst, almindeligvis defineret som 10 s 11 eller 15 s 12 og endda op til 5 min13,14), da nogle modeller kan vise en AF-fænotype for en, men ikke alle definitioner 9.
BEMÆRK: Definitionen af en AF-episode og AF-modtagelighed varierer mellem offentliggjorte undersøgelser 4,7. AF-afsnit8 defineres almindeligvis som hurtig atrieaktivitet med et uregelmæssigt uregelmæssigt ventrikulært respons, der forekommer i mindst 1 sek. (figur 1). Ud over AF kan atrietempo også fremkalde atrieflimren med enten en regelmæssig eller uregelmæssig ventrikulær respons.
- Analyser dataene ved hjælp af flere definitioner af AF-modtagelighed (f.eks. antal AF-episoder8, total AF-varighed 9, AF-forekomst4 og vedvarende AF-forekomst, almindeligvis defineret som 10 s 11 eller 15 s 12 og endda op til 5 min13,14), da nogle modeller kan vise en AF-fænotype for en, men ikke alle definitioner 9.
- Brug de optimerede modelspecifikke parametre og definitionen af AF-modtagelighed til efterfølgende undersøgelser af yderligere mus.
2. Tilberedning af dyr
- Anæstetik musen i et induktionskammer ved hjælp af 3% isofluran (se Materialetabel) i 1 L/min 100% ilt.
BEMÆRK: Isofluran er skadeligt. Det kan irritere huden eller øjet og kan forårsage svimmelhed, træthed og hovedpine, blandt andre centralnervesystemet toksiciteter. Anvendes i et godt ventileret område med en passende rensningsmetode (f.eks. beholdere med aktivt kul). - Efter tabet af pedalrefleksen placeres musen i liggende stilling på en varmepude, der er designet til at holde kropstemperaturen på ca. 37 °C med bagbenene tapet fast til pudeoverfladen.
- Påfør smørende øjensalve på øjnene for at forhindre tørring.
- Placer en bedøvelsesmaske sikkert over musens næse. Begynd vedligeholdelse af anæstesi ved hjælp af 1% isofluran i 1 L / min af 100% ilt. Sørg for, at næseborene er fri for forhindringer, da mus er obligatoriske næsepustere.
- Få et overfladeelektrokardiogram (EKG, bly I) ved subkutan placering af 27 G EKG-nåleelektroder (se Materialetabel) forbundet til en biologisk forstærker og dataindsamlingshardware i forbenene. Jord signalet ved at placere en nåleelektrode i venstre bagben.
3. Kateter placering
- Fjern kortvarigt isofluranmasken fra musen.
- Indsæt et 2-F octapolært elektrodekateter (elektrodebredde og afstand = 0,5 mm), der er forbundet med en stimulator og stimulusisolator (se Materialetabel) i spiserøret (figur 2).
- Indsæt til en dybde, der tilnærmer afstanden fra munden (med halsen strakt) til lige over xiphoidbrusk.
- Flyt isofluranmasken over musens næsebor.
- Begynd dataindsamling med kontinuerlig registrering af EKG bly I ved hjælp af analysesoftware (se Materialetabel).
- Juster stimulusisolatortilstanden til bipolar. Brug det distale par elektroder under stimulering.
- Placer kateteret korrekt i spiserøret for at muliggøre indfangning. For at gøre det skal du anvende en 1,5 mA stimulus med en pulsbredde på 2 ms ved en CL lidt kortere end sinus CL (brug f.eks. en CL på 100 ms, hvis sinus CL er 120 ms). Placer kateteret forsigtigt, indtil der opnås konsekvent atriefangst.
4. Fastsættelse af tærskelværdier
- For at bestemme den atriale diastoliske indfangningstærskel (TH) skal du starte pacing ved 1,5 mA med en pulsbredde på 2 ms ved CL, der bruges til atriefangst. Reducer stimulusamplituden med 0,05 mA trin indtil tabet af atriefangst, med efterfølgende stigning indtil indfangning.
BEMÆRK: Den laveste amplitude, ved hvilken konsekvent atrieindfangning opnås, er den atrie TH. På grund af bekymring for parasympatisk stimulering ved høje stimulusamplituder, hvilket afspejles af overdreven AV-blok under pacing med artefaktuel AF-induktion9, er den maksimalt acceptable TH 0,75 mA. Om nødvendigt skal kateteret omplaceres for at opnå en TH ≤0,75 mA. - Juster stimulusamplituden til to gange TH.
5. Bestemmelse af elektrofysiologiske egenskaber
- Mål elektrofysiologiske parametre, herunder sinusknudegendannelsestiden (SNRT), Wenckebach-cykluslængden (WCL) og atrioventrikulær effektiv ildfast periode (AVERP) før hurtig atriehastighed for AF-induktion15.
6. Følsomhed over for atriearytmi
- Der udføres tempo ved to gange TH med en pulsbredde på 2 ms ved hjælp af enten burst-pacing ved forskellige CL'er eller decremental pacing som bestemt ud fra indledende undersøgelser (trin 1.1.-1.4.).
- For burst pacing, tempo ved en indledende CL på 50 ms for 15 s med efterfølgende tog, der forekommer ved CL'er på 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms og 15 ms 8,10. Sæt tempoet på pause i 30 sekunder efter hvert tempotog for at give mulighed for restitution, før du fortsætter. Hvis AF opstår efter et tempotog, skal du vente i 30 sekunder efter afslutningen, før du fortsætter med efterfølgende tempo.
- For decremental pacing, tempo ved en CL på 40 ms og reducer CL med 2 ms hver 2 s indtil afslutning ved 20 ms7. Udfør pacing-tog i tredobbelt16 eller quintuplicate17, med en 30 s pause for genopretning efter hvert tog. Som ovenfor, hvis AF udvikler sig, skal du vente i 30 s efter opsigelsen, før du fortsætter.
BEMÆRK: Når du optimerer protokolparametre under indledende eksperimenter (dvs. trin 1.1.-1.5.), skal du udføre decremental pacing med fem tog. Udfør en post hoc-analyse for at afgøre, om tre eller fem tog giver den største følsomhed. - Afslut proceduren ved 30 s sinusrytme efter det sidste tempotog eller efter en 10 minutters episode af AF, alt efter hvad der kommer først.
7. Efter proceduren
- Stop dataindsamling.
- Fjern forsigtigt kateter og EKG-elektroder.
- Stop anæstesi.
- Placer den bedøvede mus i et bur og observer i 10 minutter for at sikre genopretning.
- Gem datafilen. I tilfælde af seriel test skal du vente i mindst 24 timer, før du gentager tempoproceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transesophageal atrial pacing undersøgelser vurderer de elektrofysiologiske egenskaber af SA- og AV-noderne ved at bestemme SNRT og AVERP samt AF-modtagelighed6 (figur 1). EKG-optagelse muliggør målinger af P-bølgevarighed, PR-interval, QRS-varighed og QT / QTc-intervaller. Kontinuerlig registrering af EKG under hurtig atriefart kan give følgende målinger af AF-sårbarhed: antallet af episoder induceret under undersøgelsen, kumulativ og gennemsnitlig varighed af episoderne og antallet af vedvarende AF-episoder. Episoder med overdreven AV-blok under pacing kan demonstrere perioder med pacing-induceret parasympatisk stimulering (figur 3), hvilket betyder, at den tilknyttede AF er en artefakt af dette fænomen snarere end patofysiologien af selve modellen9.
Figur 1: Repræsentative resultater af atrietempo. Overflade EKG-optagelser, der viser (A) sinusrytme og (B) atrieflimren efter hurtig atriefart. Tempohastigheden overstiger Wenckebach CL, hvilket resulterer i tab af 1:1 AV nodal ledning under pacing. Den grundlæggende artefakt er relateret til musens åndedræt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Visuel repræsentation af det transesophageale kateter og dets nærhed til ganglionic plexi. (A) Et fotografi, der viser 2-F octapolarkateteret. (B) Afbildning af kateterets nærhed til den bageste venstre atriale ganglioniske plexi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater af overdreven AV-blok under hurtig atriefart. Overflade EKG-optagelser, der viser atrietemporytme med (A) og uden (B) overdreven AV-blok, der kan forekomme under atrietempo, især under pacing med højere stimulusintensitet og ved korte CL'er. Røde pile angiver QRS-komplekser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transesophageal atrial pacing tillader ikke kun serielle undersøgelser i samme dyr, men dets varighed er typisk kortere end intrakardiale undersøgelser (~ 20 minutter), hvilket minimerer anæstetisk brug og dets virkninger på elektrofysiologiske parametre.
Det er afgørende at optimere metoderne i første omgang for hver enkelt musemodel. Aldring øger AF-inducerbarheden hos normale mus18,19, og individuelle genetiske modeller kan vise AF-inducerbarhed over en begrænset periode. Udførelse af pilotundersøgelser hver anden uge kan bestemme et aldersvindue, hvor AF-fænotypemusen er inducerbar, men kontrolmus ikke er det. Sex kan være en afgørende faktor, da enten et eller begge køn kan vise inducerbar AF9. Derudover kan specifikke mus vise AF-modtagelighed som reaktion på kun én type pacing-tilstand, mens andre viser AF-modtagelighed for en anden tilstand eller for flere tilstande9.
Under hurtig atriefart kan mus opleve overdreven AV-blok, der ofte er sammenfaldende med AF-induktion. Dette fænomen er forårsaget af utilsigtet stimulering af ganglionic plexi placeret på det bageste venstre atrium, hvilket resulterer i parasympatisk aktivering9. Signifikant AV-blok er defineret som ventrikulær bradykardi, der varer ≥10% af et enkelt tempotog og oftest opstår, når man pacer med høje stimulusintensiteter og ved korte pacing CL'er. Denne type arytmiinduktion øger forekomsten af AF i kontrolmus og forårsager større arytmivariation inden for en eksperimentel gruppe. I betragtning af disse forurenende egenskaber skal dyr, der oplever AF under disse forhold, udelukkes fra analysen.
Hvis der opstår dyb AV-blok under pacing på trods af TH ≤0,75 mA, er det rimeligt at reducere tempoamplituden til 1,5x TH7. Desuden, hvis en AF-fænotype ikke observeres under indledende forsøg, er det tænkeligt at forsøge igen ved hjælp af 10 ms som det laveste tempo CL16. Hvis en AF-fænotype ikke observeres ved 12 ugers alderen for en erhvervet model, skal du overveje to ugentlige indledende undersøgelser for at undersøge virkningerne af stigende fænotype modenhed20.
En begrænsning af denne fremgangsmåde er brugen af isofluranbedøvelse. Isofluran er kendt for at undertrykke autonom funktion21, og denne effekt kan ikke udelukkes på trods af en relativt kort eksponering. Denne protokol repræsenterer den første detaljerede rapport om en optimeret strategi til udvikling af transesophageal PES-metoder hos mus. Mens denne undersøgelse fokuserer på AF-modtagelighed, kan fremtidige anvendelser af denne protokol bruges til at vurdere ventrikulære arytmier22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Figur 2 blev oprettet med BioRender.com. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Heart, Lung, and Blood Institute ved National Institutes of Health (HL096844 og HL133127); American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 og 903918 [MBM]); og National Center for Advancing Translational Sciences ved National Institute of Health (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
References
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al.
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T.
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077 (2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896 (2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402 (2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57 (2021).
