Настоящий протокол описывает оптимизацию экспериментальных параметров при использовании чреспищеводной стимуляции предсердий для оценки восприимчивости к фибрилляции предсердий у мышей.
Методическая статья
Оптимизация чреспищеводной стимуляции предсердий для оценки восприимчивости к фибрилляции предсердий у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мышиные модели генетических и приобретенных факторов риска фибрилляции предсердий (ФП) оказались ценными при исследовании молекулярных детерминант ФП. Запрограммированная электрическая стимуляция может быть выполнена с использованием чреспищеводной стимуляции предсердий в качестве процедуры выживания, что позволяет проводить серийные испытания на одном и том же животном. Тем не менее, существуют многочисленные протоколы темпа, что усложняет воспроизводимость. Настоящий протокол направлен на обеспечение стандартизированной стратегии разработки экспериментальных параметров для конкретных моделей для улучшения воспроизводимости между исследованиями. Предварительные исследования проводятся для оптимизации экспериментальных методов для конкретной исследуемой модели, включая возраст на момент исследования, пол и параметры протокола кардиостимуляции (например, режим кардиостимуляции и определение восприимчивости к ФП). Важно отметить, что следует избегать высоких энергий стимулов, так как это может вызвать стимуляцию ганглионного плексиуса с непреднамеренной парасимпатической активацией, проявляющейся преувеличенной атриовентрикулярной (AV) блокадой во время кардиостимуляции и часто связанной с артефактной индукцией ФП. Животные, демонстрирующие это осложнение, должны быть исключены из анализа.
Введение
Фибрилляция предсердий (ФП) представляет собой окончательный общий путь для множественных приобретенных и генетических факторов риска. Для исследований, изучающих патофизиологические механизмы субстрата ФП, мышиные модели являются предпочтительными, учитывая простоту генетических манипуляций и тот факт, что в целом они воспроизводят восприимчивость к ФП, наблюдаемую у людей для различных клинических фенотипов 1,2,3. Тем не менее, у мышей редко развивается спонтанная AF4, что требует использования провокационных исследований темпа предсердий.
Программируемая электрическая стимуляция (PES) может быть выполнена для оценки электрофизиологии предсердий мышей и восприимчивости к ФП с использованием либо внутрисердечного5, либо чреспищеводного6-го темпа. Хотя чреспищеводный подход особенно выгоден в качестве процедуры выживания, его использование осложняется многочисленными опубликованными экспериментальными протоколами 7,8 и источниками изменчивости, которые могут препятствовать воспроизводимости9. Кроме того, ограниченное количество сообщаемых сравнений протоколов затрудняет выбор соответствующего протокола темпа.
Текущий протокол направлен на использование систематической стратегии для разработки специфических для модели методов ЧРЕС для оценки восприимчивости к ФП мышей с целью повышения воспроизводимости. Важно отметить, что первоначальные пилотные исследования проводятся для оптимизации протокола кардиостимуляции путем учета вариабельности возраста, пола и режима темпа, причем темп предназначен для минимизации непреднамеренной парасимпатической стимуляции, которая может спутать результаты9.
Протокол
Эта процедура была одобрена Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию и согласуется с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию. Протокол был разработан с использованием как генетических9 , так и приобретенных10 (например, гипертония) мышиных моделей восприимчивости к ФП. Оператор был ослеплен фенотипом исследуемой мыши.
1. Селекция животных
- Для генетических моделей подвергайте мышей двухнедельному (т.е. раз в две недели) кардиостимуляции предсердий, как описано ниже (см. шаг 6.), чтобы определить оптимальный период восприимчивости к ФП.
- Начните раз в две недели в возрасте 8 недель. Используйте пометов дикого типа в качестве элементов управления, чтобы уменьшить изменчивость. Изучите оба пола, так как у одного не может развиться фенотипФП 9.
- Для приобретенных моделей проводите кардиостимуляцию после того, как мыши достигнут физической зрелости (~ 12 недель)10. Как уже говорилось выше, изучайте оба пола.
- Во время этих предварительных исследований выполните как пакетный темп8 (используя фиксированную длину цикла темпа [CL]), так и декрементальный темп7 (с постепенно более коротким темпом CL), чтобы определить оптимальный режим темпа. Отделите каждую процедуру минимум на 24 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: По мере изучения все большего числа мышей просмотрите накопленные данные, чтобы определить оптимальный возраст, пол и режим темпа, который способствует ФП у мышей, восприимчивых к ФП, но не у контрольной группы.- Проанализируйте данные, используя несколько определений восприимчивости к ФП (например, количество эпизодов ФП8, общая продолжительность ФП9, частота ФП4 и устойчивая частота ФП, обычно определяемая как 10 с11 или 15 с12 и даже до 5 мин13,14), поскольку некоторые модели могут отображать фенотип ФП для одного, но не для всех определений9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение эпизода ФП и восприимчивости ФП различаются между опубликованными исследованиями 4,7. Эпизоды8 ФП обычно определяются как быстрая предсердная активность с нерегулярным желудочковым ответом, происходящим в течение по меньшей мере 1 с (рисунок 1). В дополнение к ФП, стимуляция предсердий может также вызывать трепетание предсердий с регулярным или нерегулярным желудочковым ответом.
- Проанализируйте данные, используя несколько определений восприимчивости к ФП (например, количество эпизодов ФП8, общая продолжительность ФП9, частота ФП4 и устойчивая частота ФП, обычно определяемая как 10 с11 или 15 с12 и даже до 5 мин13,14), поскольку некоторые модели могут отображать фенотип ФП для одного, но не для всех определений9.
- Используйте оптимизированные параметры модели и определение чувствительности к ФП для последующих исследований на дополнительных мышах.
2. Подготовка животных
- Обезболивают мышь в индукционной камере, используя 3% изофлуран (см. Таблицу материалов) в 1 л/мин 100% кислорода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран вреден. Это может раздражать кожу или глаза и может вызвать головокружение, усталость и головную боль, среди других токсичностей центральной нервной системы. Использование в хорошо проветриваемом помещении с соответствующим методом очистки (например, канистра с активированным углем). - После потери педального рефлекса поместите мышь в лежачее положение на грелке, предназначенной для поддержания температуры тела примерно на уровне 37 °C, приклеив задние конечности к поверхности колодки.
- Нанесите смазывающую глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
- Надежно наденьте анестезирующую маску на нос мыши. Начинают поддержание анестезии с использованием 1% изофлурана в 1 л/мин 100% кислорода. Убедитесь, что ноздри свободны от обструкции, так как мыши являются облигатными носовыми дышащими.
- Получение поверхностной электрокардиограммы (ЭКГ, свинец I) путем подкожного размещения игольчатых электродов ЭКГ 27 Г (см. Таблицу материалов), подключенных к биологическому усилителю и аппаратуре сбора данных в передние конечности. Заземлите сигнал, поместив игольчатый электрод в левую заднюю конечность.
3. Установка катетера
- Ненадолго снимите изофлурановую маску с мыши.
- Вставьте в пищевод октаполярный электродный катетер 2-F (ширина электрода и расстояние = 0,5 мм), подключенный к стимулятору и изолятору стимулов (см. Таблицу материалов).
- Вставьте на глубину, которая приближается к расстоянию от рта (с вытянутой горловиной) чуть выше мечевидного хряща.
- Переместите изофлурановую маску на ноздри мыши.
- Начать сбор данных с непрерывной регистрации ЭКГ-свинца I с помощью аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
- Отрегулируйте режим изолятора стимула до биполярного. Используйте дистальную пару электродов во время стимуляции.
- Правильно расположите катетер в пищеводе, чтобы обеспечить захват. Для этого примените стимул 1,5 мА с шириной импульса 2 мс при CL немного короче, чем синус CL (например, используйте CL 100 мс, если sinus CL составляет 120 мс). Осторожно позиционируйте катетер до тех пор, пока не будет получен последовательный захват предсердий.
4. Определение порога
- Чтобы определить порог захвата диастолического захвата предсердий (TH), инициируйте кардиостимуляцию при 1,5 мА с шириной импульса 2 мс при CL, используемом для захвата предсердий. Уменьшают амплитуду стимула на 0,05 мА с шагом до потери захвата предсердий, с последующим увеличением до захвата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наименьшей амплитудой, при которой достигается последовательный захват предсердий, является TH предсердия. Из-за беспокойства по поводу парасимпатической стимуляции при высоких амплитудах стимула, что отражается на чрезмерном AV-блоке во время кардиостимуляции с артефактной индукцией AF9, максимально допустимая TH составляет 0,75 мА. При необходимости переставьте катетер для достижения TH ≤0,75 мА. - Отрегулируйте амплитуду стимула до удвоения TH.
5. Определение электрофизиологических свойств
- Измерение электрофизиологических параметров, включая время восстановления синусового узла (SNRT), длину цикла Венкебаха (WCL) и атриовентрикулярный эффективный рефрактерный период (AVERP) до быстрой стимуляции предсердий для индукции ФП15.
6. Восприимчивость к предсердной аритмии
- Выполняйте темп при двойном TH с шириной импульса 2 мс, используя либо пакетный темп при разных КЛ, либо декрементальный темп, как определено из первоначальных исследований (шаги 1.1.-1.4.).
- Для темпа всплеска, темп при начальном CL 50 мс в течение 15 с с последующими поездами, происходящими при CL 40 мс, 30 мс, 25 мс, 20 мс и 15 мс 8,10. Приостановите темп на 30 секунд после каждого шага, чтобы обеспечить восстановление перед продолжением. Если AF возникает после темповой тренировки, подождите 30 секунд после окончания, прежде чем приступать к последующему темпу.
- Для декрементного темпа темпа при CL 40 мс и уменьшайте CL на 2 мс каждые 2 с до окончания через 20 мс7. Выполняйте темп поездов в трех экземплярах16 или квинтупликации17, с паузой 30 с для восстановления после каждого поезда. Как указано выше, если развивается AF, подождите 30 секунд после прекращения, прежде чем продолжить.
ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимизации параметров протокола во время предварительных экспериментов (т.е. шагов 1.1.-1.5.) выполняйте декрементальный темп с пятью поездами. Проведите пост-специальный анализ, чтобы определить, обеспечивают ли три или пять поездов наибольшую чувствительность. - Прекратите процедуру на 30 с синусового ритма после последнего шага или после 10-минутного эпизода ФП, в зависимости от того, что наступит раньше.
7. Постпроцедура
- Остановите сбор данных.
- Аккуратно снимите катетер и электроды ЭКГ.
- Прекратить анестезию.
- Поместите обезболенную мышь в клетку и наблюдайте в течение 10 минут, чтобы обеспечить выздоровление.
- Сохраните файл данных. В случае последовательного тестирования подождите не менее 24 часов, прежде чем повторять процедуру определения темпа.
Результаты
Исследования чреспищеводной стимуляции предсердий оценивают электрофизиологические свойства SA и AV узлов путем определения SNRT и AVERP, а также восприимчивости фП6 (рисунок 1). Запись ЭКГ позволяет измерять длительность волны P, интервал PR, длительность QRS и интервалы QT /QTc. Непрерывная запись ЭКГ во время быстрой кардиостимуляции может обеспечить следующие измерения уязвимости ФП: количество эпизодов, вызванных во время исследования, кумулятивная и средняя продолжительность эпизодов и количество устойчивых эпизодов ФП. Эпизоды чрезмерного AV-блока во время кардиостимуляции могут демонстрировать периоды парасимпатической стимуляции, вызванной кардиостимуляцией (рисунок 3), что означает, что связанная фП является артефактом этого явления, а не патофизиологией самой модели9.
Рисунок 1: Репрезентативные результаты кардиостимуляции предсердий. Поверхностные записи ЭКГ, изображающие (А) синусовый ритм и (В) фибрилляцию предсердий после быстрой кардиостимуляции. Скорость темпа превышает Wenckebach CL, что приводит к потере узловой проводимости 1: 1 AV во время кардиостимуляции. Базовый артефакт связан с дыханием мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуальное представление чреспищеводного катетера и его близость к ганглионарным плексилам. (А) Фотография, изображающая октаполярный катетер 2-F. (B) Изображение близости катетера к заднему ганглионному плексиозу левого предсердия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты чрезмерной AV-блокады во время быстрой кардиостимуляции предсердий. Поверхностные записи ЭКГ, демонстрирующие ритм предсердийного темпа с (A) и без (B) чрезмерного AV-блока, который может возникать во время кардиостимуляции, особенно во время темпа с более высокой интенсивностью стимула и при коротких CLA. Красные стрелки обозначают комплексы QRS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Обсуждение
Чреспищеводная стимуляция предсердий не только позволяет проводить серийные исследования на одном и том же животном, но и ее продолжительность, как правило, короче, чем внутрисердечные исследования (~ 20 мин), что сводит к минимуму использование анестетика и его влияние на электрофизиологические параметры.
Крайне важно изначально оптимизировать методы для каждой отдельной модели мыши. Старение увеличивает индуцируемость ФП у нормальных мышей18,19, и отдельные генетические модели могут демонстрировать индуцируемость ФП в течение ограниченного периода времени. Выполнение пилотных исследований каждые две недели может определить возрастное окно, в течение которого мышь фенотипа ФП индуцируется, а контрольные мыши - нет. Пол может быть определяющим фактором, так как один или оба пола могут проявлять индуцируемую AF9. Кроме того, конкретные мыши могут демонстрировать восприимчивость к автофокусировке в ответ только на один тип режима темпа, в то время как другие демонстрируют восприимчивость к автофокусировке к другому режиму или к нескольким режимам9.
Во время быстрой стимуляции предсердий мыши могут испытывать чрезмерную AV-блокаду, которая часто совпадает с индукцией ФП. Это явление вызвано непреднамеренной стимуляцией ганглионарных плексий, расположенных на заднем левом предсердии, в результате чего происходит парасимпатическая активация9. Значительный AV-блок определяется как желудочковая брадикардия, которая длится ≥10% от одного темпового поезда и чаще всего встречается при ходьбе с высокой интенсивностью стимулов и при коротком темпе КЛ. Этот тип индукции аритмии увеличивает частоту ФП у контрольных мышей и вызывает большую вариабельность аритмии в экспериментальной группе. Учитывая эти загрязняющие особенности, животные, которые испытывают ФП в этих условиях, должны быть исключены из анализа.
Если во время кардиостимуляции возникает глубокий AV-блок, несмотря на ≤0,75 мА, разумно уменьшить амплитуду темпа до 1,5x TH7. Кроме того, если фенотип ФП не наблюдается во время предварительных экспериментов, можно повторно повторить попытку, используя 10 мс в качестве самого низкого темпа CL16. Если фенотип ФП не наблюдается в возрасте 12 недель для приобретенной модели, рассмотрите двухнедельные предварительные исследования для изучения последствий увеличения зрелости фенотипа20.
Ограничением такого подхода является использование изофлурановой анестезии. Изофлуран, как известно, подавляет вегетативную функцию21, и этот эффект не может быть исключен, несмотря на относительно короткое воздействие. Этот протокол представляет собой первый подробный отчет об оптимизированной стратегии разработки чреспищеводных методов PES на мышах. Хотя это исследование фокусируется на восприимчивости к ФП, будущие применения этого протокола могут быть использованы для оценки желудочковых аритмий22,23.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Рисунок 2 был создан с помощью BioRender.com. Эта работа была поддержана грантами Национального института сердца, легких и крови при Национальных институтах здравоохранения (HL096844 и HL133127); Американская кардиологическая ассоциация (2160035, 18SFRN34230125 и 903918 [MBM]); и Национальный центр развития трансляционных наук Национального института здравоохранения (UL1 TR000445).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Электроды 27 G | ЭКГинструменты | MLA1204 | |
| 2-F октаполярный электродный катетер | NuMED | CIBercath | |
| Канистра с активированным углем | VetEquip | 931401 | |
| Программное обеспечение для анализа | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Биологический усилитель | ADInstruments | FE231 | |
| Data Оборудование для захвата | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Глазная мазь | MWI Ветеринарная | NC1886507 | |
| Грелка | Braintree Scientific | DPIP | |
| Изофлуран | Пирамал | 66794-017-25 | |
| Стимулятор | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Изолятор стимулов | World Precision Instruments | Модель A365 |
Ссылки
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018(2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T. Programmed electrical stimulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730(2010).
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077(2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896(2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402(2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57(2021).
Перепечатки и разрешения
