Summary
O presente protocolo descreve a otimização de parâmetros experimentais quando se utiliza a estimulação atrial transesofágica para avaliar a suscetibilidade à fibrilação atrial em camundongos.
Abstract
Modelos de camundongos de fatores de risco genéticos e adquiridos para fibrilação atrial (FA) têm se mostrado valiosos na investigação dos determinantes moleculares da FA. A estimulação elétrica programada pode ser realizada usando a estimulação atrial transesofágica como procedimento de sobrevivência, permitindo assim testes seriados no mesmo animal. No entanto, existem inúmeros protocolos de estimulação, o que dificulta a reprodutibilidade. O presente protocolo tem como objetivo fornecer uma estratégia padronizada para desenvolver parâmetros experimentais específicos do modelo para melhorar a reprodutibilidade entre os estudos. Estudos preliminares são realizados para otimizar os métodos experimentais para o modelo específico sob investigação, incluindo idade no momento do estudo, sexo e parâmetros do protocolo de estimulação (por exemplo, modo de estimulação e definição de suscetibilidade à FA). É importante ressaltar que se toma cuidado para evitar altas energias de estímulo, pois isso pode causar estimulação do plexo ganglionar com ativação parassimpática inadvertida, manifestada por bloqueio atrioventricular (AV) exagerado durante a estimulação e frequentemente associada à indução de FA artifactual. Os animais que demonstrem esta complicação devem ser excluídos da análise.
Introduction
A fibrilação atrial (FA) representa uma via final comum para múltiplos fatores de risco adquiridos e genéticos. Para os estudos que investigam os mecanismos fisiopatológicos do substrato da FA, os modelos de camundongos são vantajosos dada a facilidade de manipulação genética e o fato de que, em geral, reproduzem a suscetibilidade à FA observada em humanos para diferentes fenótipos clínicos 1,2,3. No entanto, os camundongos raramente desenvolvem FAespontânea 4, necessitando do uso de estudos provocativos de estimulação atrial.
A estimulação elétrica programada (PSE) pode ser realizada para avaliar a eletrofisiologia atrial murina e a suscetibilidade à FA usando estimulação intracardíaca5 ou transesofágica6. Embora a abordagem transesofágica seja particularmente vantajosa como procedimento de sobrevivência, seu uso é complicado pelos inúmeros protocolos experimentais publicados 7,8 e fontes de variabilidade que podem dificultar a reprodutibilidade9. Além disso, comparações limitadas de protocolos relatados tornam a seleção de um protocolo de estimulação apropriada desafiadora.
O protocolo atual visa utilizar uma estratégia sistemática para desenvolver métodos de PSA transesofágicos específicos do modelo para avaliar a suscetibilidade à FA murina, a fim de aumentar a reprodutibilidade. É importante ressaltar que estudos piloto iniciais são realizados para otimizar o protocolo de estimulação por meio da contabilização da variabilidade da idade, sexo e modo de estimulação, com estimulação projetada para minimizar a estimulação parassimpática inadvertida que pode confundir os resultados9.
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Protocol
Este procedimento foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Vanderbilt e é consistente com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo foi desenvolvido usando modelos genéticos de 9 e10 (por exemplo, hipertensão)de suscetibilidade à FA em camundongos. O operador foi cegado para o fenótipo do rato em estudo.
1. Seleção de animais
- Para modelos genéticos, submeta camundongos a estimulação atrial quinzenal (ou seja, a cada duas semanas), conforme descrito abaixo (ver etapa 6.) para determinar o período ideal de suscetibilidade à FA.
- Comece o ritmo quinzenal às 8 semanas de idade. Use companheiros de ninhada do tipo selvagem como controles para reduzir a variabilidade. Estude ambos os sexos, pois não se pode desenvolver um fenótipo de FA9.
- Para os modelos adquiridos, realizar a estimulação após os camundongos atingirem a maturidade física (~12 semanas de idade)10. Como mencionado acima, estude ambos os sexos.
- Durante esses estudos preliminares, execute a estimulação de ruptura 8 (usando um comprimento de ciclo de estimulação fixa [CL]) e a estimulação decréscimo7 (com uma estimulação progressivamente mais curta CL) para determinar o modode estimulação ideal. Separe cada procedimento por um mínimo de 24 h.
NOTA: À medida que um número crescente de camundongos é estudado, revise os dados acumulados para determinar a idade, o sexo e o modo de estimulação ideais que promovem a FA em camundongos suscetíveis à FA, mas não nos controles.- Analise os dados usando múltiplas definições de suscetibilidade à FA (por exemplo, número de episódios de FA8, duração total da FA 9, incidência de FA 4 e incidência sustentada de FA, comumente definida como 10 s11 ou 15 s 12, e até mesmo até 5 min13,14), pois alguns modelos podem exibir um fenótipode FA para uma, mas não todas as definições 9.
NOTA:A definição de episódio de FA e a suscetibilidade à FA diferem entre os estudos publicados 4,7. Os episódiosde FA 8 são comumente definidos como atividade atrial rápida com resposta ventricular irregularmente irregular ocorrendo por pelo menos 1s (Figura 1). Além da FA, a estimulação atrial também pode induzir flutter atrial com uma resposta ventricular regular ou irregular.
- Analise os dados usando múltiplas definições de suscetibilidade à FA (por exemplo, número de episódios de FA8, duração total da FA 9, incidência de FA 4 e incidência sustentada de FA, comumente definida como 10 s11 ou 15 s 12, e até mesmo até 5 min13,14), pois alguns modelos podem exibir um fenótipode FA para uma, mas não todas as definições 9.
- Use os parâmetros otimizados específicos do modelo e a definição de suscetibilidade à FA para estudos subsequentes em camundongos adicionais.
2. Preparação animal
- Anestesiar o rato numa câmara de indução utilizando isoflurano a 3% (ver Tabela de Materiais) em 1 L/min de oxigénio a 100%.
NOTA: O isoflurano é prejudicial. Pode irritar a pele ou os olhos e pode causar tonturas, fadiga e dor de cabeça, entre outras toxicidades do sistema nervoso central. Use em uma área bem ventilada com um método de limpeza apropriado (por exemplo, recipiente de carvão ativado). - Após a perda do reflexo do pedal, coloque o rato em decúbito dorsal numa almofada de aquecimento concebida para manter a temperatura corporal a aproximadamente 37 °C com os membros posteriores colados à superfície da almofada.
- Aplique pomada lubrificante para os olhos para evitar a secagem.
- Coloque uma máscara anestésica com segurança sobre o nariz do rato. Iniciar a manutenção da anestesia com isoflurano a 1% em 1 L/min de oxigênio a 100%. Certifique-se de que as narinas estejam livres de obstrução, pois os ratos são respiradores nasais obrigatórios.
- Obter um eletrocardiograma de superfície (ECG, derivação I) pela colocação subcutânea de eletrodos de agulha de ECG 27 G (ver Tabela de Materiais) conectados a um amplificador biológico e hardware de aquisição de dados nos membros anteriores. Aterre o sinal colocando um eletrodo de agulha no membro posterior esquerdo.
3. Colocação do cateter
- Remova brevemente a máscara de isoflurano do rato.
- Inserir um cateter de eletrodo octapolar 2-F (largura e espaçamento do eletrodo = 0,5 mm) conectado a um estimulador e isolador de estímulo (ver Tabela de Materiais) no esôfago (Figura 2).
- Insira a uma profundidade que se aproxime da distância da boca (com o pescoço estendido) até logo acima da cartilagem xifoide.
- Reposicione a máscara de isoflurano sobre as narinas do rato.
- Iniciar a aquisição de dados com o registro contínuo do eletrocardiograma I usando um software de análise (consulte Tabela de Materiais).
- Ajuste o modo do isolador de estímulo para bipolar. Use o par de eletrodos mais distal durante a estimulação.
- Posicione corretamente o cateter dentro do esôfago para permitir a captura. Para fazer isso, aplique um estímulo de 1,5 mA com uma largura de pulso de 2 ms em um CL ligeiramente menor que o CL sinusal (por exemplo, use um CL de 100 ms se o CL sinusal for de 120 ms). Posicione cuidadosamente o cateter até obter uma captura atrial consistente.
4. Determinação dos limiares
- Para determinar o limiar de captura diastólica atrial (HT), inicie a estimulação a 1,5 mA com uma largura de pulso de 2 ms no CL usado para a captura atrial. Diminuir a amplitude do estímulo em incrementos de 0,05 mA até a perda da captura atrial, com posterior aumento até a captura.
NOTA: A menor amplitude na qual a captura atrial consistente é obtida é a HT atrial. Devido à preocupação com a estimulação parassimpática em altas amplitudes de estímulo, que é refletida pelo bloqueio AV excessivo durante a estimulação com indução de FA artifactual9, o HT máximo aceitável é de 0,75 mA. Se necessário, reposicione o cateter para obter um HT ≤0,75 mA. - Ajuste a amplitude do estímulo para duas vezes TH.
5. Determinação das propriedades eletrofisiológicas
- Medir parâmetros eletrofisiológicos, incluindo o tempo de recuperação do nó sinusal (SNRT), o comprimento do ciclo de Wenckebach (LCI) e o período refratário efetivo atrioventricular (AVERP) antes da estimulação atrial rápida para indução da FA15.
6. Suscetibilidade à arritmia atrial
- Execute a estimulação em duas vezes HT com uma largura de pulso de 2 ms usando a estimulação de explosão em diferentes CLs ou a estimulação decrésiva, conforme determinado a partir de estudos iniciais (etapas 1.1.-1.4.).
- Para o ritmo de ruptura, ritmo em um CL inicial de 50 ms por 15 s com trens subsequentes ocorrendo em CLs de 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 m e 15 ms 8,10. Pause o ritmo por 30 s após cada trem de estimulação para permitir a recuperação antes de prosseguir. Se a FA ocorrer após um trem de ritmo, aguarde 30 s após o término antes de prosseguir com o ritmo subsequente.
- Para o ritmo decréscimo, ritmo a um CL de 40 ms e diminuir o CL em 2 ms a cada 2 s até a terminação em 20 ms7. Realize trens de ritmo em triplicado16 ou quintuplicado17, com uma pausa de 30 s para recuperação após cada trem. Como acima, se a FA se desenvolver, aguarde 30 s após a rescisão antes de prosseguir.
NOTA: Ao otimizar os parâmetros do protocolo durante experimentos preliminares (ou seja, etapas 1.1.-1.5.), execute a estimulação decréscimo com cinco trens. Realize uma análise post hoc para determinar se três ou cinco trens fornecem a maior sensibilidade. - Termine o procedimento em cima de 30 s de ritmo sinusal após o último trem de estimulação ou após um episódio de 10 minutos de FA, o que ocorrer primeiro.
7. Pós-procedimento
- Pare a aquisição de dados.
- Remova suavemente o cateter e os eletrodos de ECG.
- Pare a anestesia.
- Coloque o rato anestesiado em uma gaiola e observe por 10 minutos para garantir a recuperação.
- Salve o arquivo de dados. No caso de testes seriados, aguarde um mínimo de 24 horas antes de repetir o procedimento de ritmo.
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Representative Results
Estudos de estimulação atrial transesofágica avaliam as propriedades eletrofisiológicas dos linfonodos SA e AV por meio da determinação da SNRT e da AVERP, bem como da suscetibilidade à FA6 (Figura 1). O registro de ECG permite medições da duração da onda P, intervalo PR, duração do QRS e intervalos QT/QTc. O registro contínuo do ECG durante a estimulação atrial rápida pode fornecer as seguintes medidas de vulnerabilidade da FA: o número de episódios induzidos durante o estudo, a duração cumulativa e média dos episódios e o número de episódios de FA sustentada. Episódios de bloqueio AV excessivo durante a estimulação cardíaca podem demonstrar períodos de estimulação parassimpática induzida pela estimulação (Figura 3), significando que a FA associada é um artefato desse fenômeno, e não a fisiopatologia do próprio modelo9.
Figura 1: Resultados representativos da estimulação atrial. Registros de ECG de superfície representando (A) ritmo sinusal e (B) fibrilação atrial após estimulação atrial rápida. A taxa de estimulação excede a CL de Wenckebach, resultando na perda da condução nodal AV 1:1 durante a estimulação. O artefato basal está relacionado à respiração do rato. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação visual do cateter transesofágico e sua proximidade com o plexo ganglionar. (A) Fotografia representando o cateter octapolar 2-F. (B) Representação da proximidade do cateter com o plexo ganglionar atrial posterior esquerdo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos do bloqueio AV excessivo durante a estimulação atrial rápida. Registros de ECG de superfície demonstrando ritmo atrial com (A) e sem (B) bloqueio AV excessivo que pode ocorrer durante a estimulação atrial, especialmente durante a estimulação com maior intensidade de estímulo e em CLs curtos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A estimulação atrial transesofágica não só permite estudos seriados em um mesmo animal, mas sua duração é tipicamente menor do que os estudos intracardíacos (~20 min), minimizando assim o uso de anestésicos e seus efeitos sobre os parâmetros eletrofisiológicos.
É fundamental otimizar os métodos inicialmente para cada modelo de mouse individual. O envelhecimento aumenta a indutibilidade da FA em camundongos normais18,19, e modelos genéticos individuais podem demonstrar a indutibilidade da FA por um período limitado de tempo. A realização de estudos-piloto a cada duas semanas pode determinar uma janela de idade durante a qual o rato fenótipo FA é induzível, mas os ratos de controlo não o são. O sexo pode ser um fator determinante, pois um ou ambos os sexos podem apresentar FAinduzível 9. Além disso, camundongos específicos podem mostrar suscetibilidade à FA em resposta a apenas um tipo de modo de estimulação, enquanto outros demonstram suscetibilidade à FA a um modo diferente ou a vários modos9.
Durante a estimulação atrial rápida, os ratos podem experimentar bloqueio AV excessivo que muitas vezes é coincidente com a indução de FA. Esse fenômeno é causado pela estimulação inadvertida dos plexos ganglionares localizados no átrio posterior esquerdo, resultando em ativação parassimpática9. O bloqueio AV significativo é definido como bradicardia ventricular que dura ≥10% de um único trem de estimulação e é mais frequentemente encontrado quando se encontra estimulação com altas intensidades de estímulo e em CLs de estimulação curta. Esse tipo de indução de arritmia aumenta a incidência de FA em camundongos controle e causa maior variabilidade de arritmia dentro de um grupo experimental. Dadas estas características contaminantes, os animais que apresentam FA nestas condições devem ser excluídos da análise.
Se ocorrer bloqueio AV profundo durante a estimulação apesar do HT ≤0,75 mA, é razoável reduzir a amplitude da estimulação para 1,5x TH7. Além disso, se um fenótipo de FA não for observado durante experimentos preliminares, é concebível tentar novamente usando 10 ms como a menor estimulação CL16. Se um fenótipo de FA não for observado às 12 semanas de idade para um modelo adquirido, considere estudos preliminares quinzenais para explorar os efeitos do aumento da maturidade fenotípica20.
Uma limitação dessa abordagem é o uso de anestesia com isoflurano. Sabe-se que o isoflurano suprime a função autonômica21, e esse efeito não pode ser descartado, apesar de uma exposição relativamente curta. Este protocolo representa o primeiro relato detalhado de uma estratégia otimizada para o desenvolvimento de métodos de PSA transesofágica em camundongos. Embora este estudo enfoque a suscetibilidade à FA, futuras aplicações desse protocolo poderão ser utilizadas para avaliar arritmias ventriculares22,23.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A Figura 2 foi criada com BioRender.com. Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde (HL096844 e HL133127); a American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 e 903918 [MBM]); e o Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais do Instituto Nacional de Saúde (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
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