Summary

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Published: August 18, 2022
doi:

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all’interno di embrioni intatti di zebrafish.

Abstract

La metilazione della citosina è altamente conservata tra le specie di vertebrati e, come fattore chiave della programmazione epigenetica e dello stato della cromatina, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale precoce. Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina. La riprogrammazione epigenetica è un periodo critico durante lo sviluppo in utero e l’esposizione materna a sostanze chimiche ha il potenziale per riprogrammare l’epigenoma all’interno della prole. Ciò può potenzialmente causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari. Sebbene il sequenziamento basato sulla bisolfito consenta ai ricercatori di interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, come tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. A causa della facilità dell’imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell’allevamento durante l’embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere utilizzati come modello fisiologicamente intatto per scoprire percorsi xenobiotici mediati che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi specifici per 5 mC disponibili in commercio, descriviamo una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all’interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l’immunoistochimica a montaggio intero, l’imaging automatizzato ad alto contenuto e l’elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell’analisi statistica. Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a rilevare e quantificare con successo i livelli di 5-mC in situ all’interno degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo iniziale. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all’interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

Introduction

Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina 1,2. Il tris(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (TDCIPP) è un ritardante di fiamma ampiamente utilizzato negli Stati Uniti che ha precedentemente dimostrato di alterare la traiettoria della metilazione della citosina dopo l’esposizione embrionale precoce da 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) fino alla gastrulazione precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . All’interno dei vertebrati, il 5-mC e i suoi derivati modificati sono fondamentali per regolare lo sviluppo embrionale precoce9. La fecondazione di un embrione innesca la demetilazione del DNA parentale, seguita dalla degradazione dell’mRNA materno, dall’attivazione del genoma zigotico e dalla rimetilazione del genoma zigotico9. I processi biologicamente rilevanti che utilizzano la metilazione della citosina includono la modificazione degli istoni, il reclutamento del macchinario trascrizionale, la metilazione dell’RNA, la riprogrammazione epigenetica e la determinazione della struttura della cromatina10,11. La metilazione della citosina è conservata anche tra le specie di vertebrati, sottolineando l’importanza di comprendere e studiare come la metilazione aberrante della citosina possa influenzare la traiettoria di sviluppo di un organismo11. Inoltre, lo sviluppo in utero è sensibile all’esposizione materna e ha il potenziale di causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari12,13,14.

Lunghi tratti di coppie citosina-guanina, o isole CpG, sono stati i principali focolai dei ricercatori che mirano a caratterizzare la dinamica della metilazione della citosina attraverso il genoma15,16,17. Le strategie basate sul bisolfito come il sequenziamento del bisolfito dell’intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell’amplicone del bisolfito rappresentano il gold standard per interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi. Tuttavia, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, in quanto tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. Inoltre, gli approcci basati sul sequenziamento non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale, che è fondamentale per comprendere i tipi di cellule potenzialmente interessate e le aree all’interno di un embrione in via di sviluppo. Allo stesso modo, i saggi globali di metilazione del DNA come l’analisi di restrizione dipendente dalla metilazione, i saggi immunologici legati all’enzima 5-mC (ELISA) e la cromatografia-spettrometria di massa liquida (LC-MS) 5-metil-2′-deossicitidina (5-mC) si basano su omogenati cellulari o tissutali e, come tali, precludono la capacità di monitorare la localizzazione e l’entità della metilazione della citosina nello spazio e nel tempo all’interno di campioni intatti12,18.

A causa della facilità dell’imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell’allevamento durante l’embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere ampiamente utilizzati come modelli fisiologicamente intatti per scoprire percorsi mediati da xenobiotici che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi disponibili in commercio specifici per 5-mC, il protocollo seguente descrive una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all’interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l’immunoistochimica a montaggio intero (IHC), l’imaging automatizzato ad alto contenuto e l’elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell’analisi statistica.

Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a monitorare 5-mC all’interno di embrioni di zebrafish intatti. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all’interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

Protocol

Gli allevatori adulti sono stati gestiti e trattati in conformità con un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (# 20180063) presso l’Università della California, Riverside. 1. Raccolta di embrioni di zebrafish ed esposizione chimica Aggiungi trappole da riproduzione in vasca alle vasche contenenti pesci zebra maschi e femmine adulti sessualmente maturi e riproduttivamente vitali. Aggiungere almeno tr…

Representative Results

Lo scopo generale di questo protocollo è determinare se un trattamento influisce sull’abbondanza relativa di 5-mC valutando l’area totale e l’intensità relativa della fluorescenza all’interno di embrioni di zebrafish fissi ed etichettati. Dopo aver completato il protocollo, è possibile utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per determinare innanzitutto se l’IHC a montaggio completo ha avuto successo. Quando gli embrioni marcati sono osservati sotto un filtro FITC o GFP, un risultato positivo è indicato da un…

Discussion

Durante questo protocollo, ci sono alcuni passaggi che sono critici. In primo luogo, quando si dechorionano gli embrioni, è importante puntare l’ago lontano dal tessuto dell’embrione / sacco vitellino / massa cellulare, poiché queste porzioni dell’embrione in via di sviluppo sono molto fragili e facili da perforare. In secondo luogo, quando si trasferiscono embrioni marcati a singoli pozzetti, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni in quanto aderiranno a una pipetta di plastica. In terzo luogo, qua…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il supporto alla ricerca è stato fornito da una UCR Graduate Division Fellowship a SAB, una NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) a SAB e una sovvenzione del National Institutes of Health (R01ES027576) e USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) a DCV.

Materials

1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 540225
10-µL glass microcapillary pipette Fisher Scientific 211762B
100-mm plastic Petri dish Fisher Scientific 08757100D
10x phosphate-buffered saline  Fisher Scientific BP399500
1-mL pipette  Fisher Scientific 13690032
250-mL Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB501250
5-mL pipette Fisher Scientific 13690033
60-mm glass petri dishes with lids Fisher Scientific 08747A
96-well plate Fisher Scientific 720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody  Fisher Scientific A21121
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP67110
DMSO Fisher Scientific BP2311
Hotplate  Fisher Scientific 1110016SH
In-tank breeding traps Aquatic Habitats N/A This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System Molecular Devices N/A Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket N/A N/A Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658  Molecular Devices N/A Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula Fisher Scientific 2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody Millipore Sigma MABE146
NaOH Fisher Scientific BP359-500
Orbital shaker  Fisher Scientific 50998290
Parafilm  Fisher Scientific 1337412
Paraformaldehyde  Fisher Scientific 18612139
Plastic transfer pipette Fisher Scientific 1368050
Rstudio RStudio N/A RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum Millipore Sigma S3772-5ML
Stereomicroscope Leica 10450103
Temperature-controlled incubator  Fisher Scientific PR505755L
Tween-20  Fisher Scientific P7949-500ML

References

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Avila-Barnard, S., Volz, D. C. Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (186), e64190, doi:10.3791/64190 (2022).

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