Summary
В этой статье описывается протокол быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга нормального и аберрантного метилирования цитозина в интактных эмбрионах рыбок данио.
Abstract
Метилирование цитозина высоко сохраняется у всех видов позвоночных и, как ключевой фактор эпигенетического программирования и состояния хроматина, играет решающую роль в раннем эмбриональном развитии. Ферментативные модификации приводят к активному метилированию и деметилированию цитозина в 5-метилцитозин (5-мС) и последующему окислению 5-мС в 5-гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и 5-карбоксильцитозин. Эпигенетическое перепрограммирование является критическим периодом внутриутробного развития, и материнское воздействие химических веществ может перепрограммировать эпигеном в потомстве. Это может потенциально вызвать неблагоприятные исходы, такие как немедленные фенотипические последствия, долгосрочные последствия для восприимчивости к заболеваниям у взрослых и трансгенерационные эффекты наследственных эпигенетических меток. Хотя секвенирование на основе бисульфита позволяет исследователям опрашивать метилирование цитозина с разрешением пары оснований, подходы, основанные на секвенировании, являются непомерно дорогостоящими и, как таковые, исключают возможность мониторинга метилирования цитозина на разных стадиях развития, множественных концентраций на химическое вещество и репликации эмбрионов за обработку. Благодаря простоте автоматизированной визуализации in vivo , генетическим манипуляциям, быстрому времени развития ex utero и животноводству во время эмбриогенеза, эмбрионы рыбок данио продолжают использоваться в качестве физиологически неповрежденной модели для выявления ксенобиотически-опосредованных путей, которые способствуют неблагоприятным исходам во время раннего эмбрионального развития. Поэтому, используя коммерчески доступные 5-мС-специфические антитела, мы описываем экономически эффективную стратегию быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга метилирования цитозина в отдельных, интактных эмбрионах рыбок данио с использованием цельной иммуногистохимии, автоматизированной визуализации с высоким содержанием и эффективной обработки данных с использованием языка программирования до статистического анализа. Согласно современным знаниям, этот метод является первым, который успешно обнаруживает и количественно оценивает уровни 5-mC in situ в эмбрионах рыбок данио во время раннего развития. Метод позволяет обнаруживать метилирование ДНК в клеточной массе, а также обладает способностью обнаруживать метилирование цитозина локализованных желтком материнских мРНК во время перехода от матери к зиготе. В целом, этот метод будет полезен для быстрой идентификации химических веществ, которые могут нарушить метилирование цитозина in situ во время эпигенетического перепрограммирования.
Introduction
Ферментативные модификации стимулируют активное метилирование и деметилирование цитозина в 5-метилцитозин (5-мС) и последующее окисление 5-мС в 5-гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и 5-карбоксильцитозин 1,2. Трис(1,3-дихлор-2-пропил) фосфат (TDCIPP) является широко используемым антипиреном в Соединенных Штатах, который, как было ранее продемонстрировано, изменяет траекторию метилирования цитозина после раннего эмбрионального воздействия от 0,75 часа после оплодотворения (HPF) до ранней гаструляции (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . У позвоночных 5-мС и его модифицированные производные имеют решающее значение для регулирования раннего эмбрионального развития9. Оплодотворение эмбриона вызывает деметилирование родительской ДНК, за которым следует деградация материнской мРНК, активация зиготического генома и реметилирование зиготического генома9. Биологически значимые процессы, использующие метилирование цитозина, включают модификацию гистонов, рекрутирование транскрипционного механизма, метилирование РНК, эпигенетическое перепрограммирование и определение структуры хроматина10,11. Метилирование цитозина также сохраняется среди видов позвоночных, подчеркивая важность понимания и изучения того, как аберрантное метилирование цитозина может влиять на траекторию развития организма11. Кроме того, внутриутробное развитие чувствительно к материнскому воздействию и может вызвать неблагоприятные исходы, такие как немедленные фенотипические последствия, долгосрочные последствия для восприимчивости к заболеваниям у взрослых и трансгенерационные эффекты унаследованных эпигенетических меток 12,13,14.
Длинные участки пар цитозин-гуанин, или острова CpG, были основными очагами исследователей, которые стремятся охарактеризовать динамику метилирования цитозина в геноме 15,16,17. Стратегии, основанные на бисульфите, такие как секвенирование бисульфита всего генома, секвенирование бисульфита с пониженным представлением и секвенирование бисульфитного ампликона, представляют собой золотой стандарт для опроса метилирования цитозина при разрешении пары оснований. Однако подходы, основанные на секвенировании, являются непомерно дорогостоящими и, как таковые, исключают возможность мониторинга метилирования цитозина на разных стадиях развития, множественных концентраций на химическое вещество и репликации эмбрионов за обработку. Кроме того, подходы, основанные на секвенировании, не предоставляют информацию о пространственной локализации, что имеет решающее значение для понимания потенциально затронутых типов клеток и областей в развивающемся эмбрионе. Аналогичным образом, глобальные анализы метилирования ДНК, такие как метилирующий зависимый рестрикционный анализ, иммунологические анализы 5-мС (ИФА) и 5-метил-2'-дезоксицитидин (5-мС) жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS), полагаются на гомогенаты клеток или тканей и, как таковые, исключают возможность мониторинга локализации и величины метилирования цитозина в пространстве и времени в неповрежденных образцах12,18.
Благодаря простоте автоматизированной визуализации in vivo , генетическим манипуляциям, быстрому времени развития ex utero и животноводству во время эмбриогенеза, эмбрионы рыбок данио продолжают широко использоваться в качестве физиологически неповрежденных моделей для выявления ксенобиотически-опосредованных путей, которые способствуют неблагоприятным исходам во время раннего эмбрионального развития. Таким образом, используя коммерчески доступные антитела, специфичные для 5-mC, приведенный ниже протокол описывает экономически эффективную стратегию быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга метилирования цитозина в отдельных, интактных эмбрионах рыбок данио с использованием иммуногистохимии (IHC), автоматизированной визуализации с высоким содержанием и эффективной обработки данных с использованием языка программирования до статистического анализа.
Согласно современным знаниям, этот метод является первым для мониторинга 5-mC в интактных эмбрионах рыбок данио. Метод позволяет обнаруживать метилирование ДНК в клеточной массе, а также обладает способностью обнаруживать метилирование цитозина локализованных желтком материнских мРНК во время перехода от матери к зиготе. В целом, этот метод будет полезен для быстрой идентификации химических веществ, которые могут нарушить метилирование цитозина in situ во время эпигенетического перепрограммирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Взрослые заводчики обрабатывались и лечились в соответствии с утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) протоколом использования животных (No 20180063) в Калифорнийском университете в Риверсайде.
1. Сбор эмбрионов рыбок данио и химическое воздействие
- Добавьте ловушки для размножения в аквариуме, содержащие половозрелых и репродуктивно жизнеспособных взрослых самцов и самок рыбок данио. Добавьте не менее трех ловушек на резервуар объемом 6 л не менее чем за 12 ч до сбора в ~9:00 утра, что является приблизительным временем оплодотворения и нереста яиц в резервуарах.
- Приготовьте свежий экспозиционный раствор утром сбора. Экспозиционный раствор готовят с использованием пипетки 5 мл и добавляют 5,0 мл бездисперсной системной воды в стеклянную чашку Петри толщиной 60 мм.
- Затем используйте стеклянную микрокапиллярную пипетку объемом 10 мкл для переноса 10 мкл транспортного средства (диметилсульфоксида или ДМСО) или химического раствора в системную воду в стеклянной посуде.
- Закрутите стеклянную чашку Петри, чтобы убедиться, что запас раствора рассеивается. Добавьте еще 5,0 мл системной воды в стеклянную чашку Петри. Закрутите стеклянную чашку Петри, чтобы гомогенизировать экспозиционный раствор.
- Повторите для каждой группы лечения в репликах из четырех, чтобы получить четыре реплики за лечение.
- После того, как растворы для воздействия были приготовлены, закройте стеклянную посуду стеклянными крышками, чтобы свести к минимуму испарение.
- Снимая ловушки для размножения из каждого резервуара, осторожно позвольте воде внутри каждой ловушки стекать в резервуар перед извлечением из резервуаров. Убедитесь, что ловушки остаются правой стороной вверх.
- Переложите ловушки для размножения в лабораторную раковину и промойте их с помощью бутылки с брызгами, наполненной водой обратного осмоса (RO), в рыбную сеть, предварительно пропитанную 10% отбеливателем и смоченную водой. Промывайте эмбрионы до тех пор, пока не будет очищен весь мусор и не останутся только чистые эмбрионы.
- Перенесите эмбрионы из рыбьей сети с помощью наполненной водой бутылки для брызг в пластиковую чашку Петри толщиной 100 мм. Случайным образом отсортируйте 50 живых эмбрионов через 0,75 ч после оплодотворения (HPF) и удалите избыток воды RO.
- С помощью микропатула поместите отсортированные эмбрионы в лечебный раствор. Все эмбрионы должны находиться в транспортном средстве или лечебном растворе не ранее 9:45 утра. Закрутите стеклянную посуду, чтобы убедиться, что эмбрионы равномерно покрыты в растворе для лечения.
- После установки четырех реплицированных тарелок (N = 50 на репликат) для каждой группы обработки поместите стеклянную крышку поверх посуды для экспозиции и перенесите всю посуду в инкубатор с контролируемой температурой, установленный при 28 °C до 2 л.с.ф., 4 л.с.ф., 6hpf, 8 л.с.ф. или 10 л.с.ф.
- Готовят свежий 4% параформальдегид (ПФА) по меньшей мере за 4 ч до окончания экспозиции и хранят при 4 °C.
- Включите конфорку до 115 °C, сделайте 20 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) (2 мл 10x PBS + 18 мл воды RO) в 50 мл центрифужной трубки и взвесьте 800 мг параформальдегида.
- В химической вытяжке перенесите 1 раствор PBS в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, добавьте 800 мг параформальдегида, а затем добавьте 2 мкл 10 N NaOH. Поместите термометр внутрь колбы, поместите колбу на конфорку и следите за температурой во время перемешивания.
- Когда температура достигнет 62-65 °Cremove 4% PFA с конфорки и дайте ей остыть до комнатной температуры (RT). Хранить 4% PFA при 4 °C.
- Как только продолжительность воздействия закончится, извлеките эмбрионы из инкубатора и перенесите все живые эмбрионы в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Раствор остаточного воздействия аспирата с использованием пипетки 1 мл. Не аспирируйте эмбрионы.
- Добавьте 500 мкл охлажденного 4% PFA в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и смешайте эмбрионы в 4% PFA путем инвертирования несколько раз. Дайте эмбрионам зафиксироваться в 4% PFA в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется позволять эмбрионам оставаться в PFA дольше 12 ч.
2. Дехорионация эмбрионов
- На следующий день аспирируйте 4% PFA, повторно суспендируйте эмбрионы в 1x PBS и осторожно пипеткой вверх и вниз в течение 30 с. При необходимости остановите протокол на этом этапе и храните эмбрионы в 1x PBS при 4 °C в течение 48 ч.
- Используя пластиковую переносную пипетку, аккуратно перенесите неподвижные эмбрионы в наполненную водой стеклянную посуду и осторожно закрутите в течение 30 с. Повторите этот шаг еще раз.
- Используйте шприцевые иглы под 5,0-кратным увеличением с помощью стандартного стереомикроскопа, чтобы вручную дехорионировать все эмбрионы. Сделайте это, используя кончик иглы, чтобы проколоть хорион и аккуратно очистить его от желтка и клеточной массы4.
- После того, как эмбрионы были дехорионированы, используйте стеклянную микрокапиллярную пипетку для переноса до 25 неповрежденных эмбрионов в одну корзину иммунохимии (IHC) и поместите корзину IHC в пластину с 96 лунками. Используйте пипетку объемом 1 мл для аспирации воды RO из каждой скважины.
3. Иммуногистохимия с использованием 5-мС-специфических антител
- Повторно суспендировать эмбрионы в 500 мкл блокирующего буфера (1x PBST + 2% овечьей сыворотки + 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) на лунку и обернуть пластину парапленкой и алюминиевой фольгой для защиты их от света. Инкубировать при 4 °C в течение 4 ч на орбитальном шейкере (100 об/мин).
- Снимите пленку и алюминий и используйте пипетку объемом 1 мл для аспирации блокирующего буфера из каждой лунки. Замените его 500 мкл разведения 1:100 моноклонального мышиного антитела против 5-мС в блокирующем буфере. Инкубировать все эмбрионы с первичными антителами, за исключением подмножества контрольных эмбрионов, которые будут инкубированы с блокирующим буфером для учета фонового шума. Будьте осторожны, чтобы не нарушить целостность эмбрионов или аспирировать эмбрионы во время этого шага.
- Переверните пластину в парапленку и алюминиевую фольгу и дайте пластине инкубироваться при 4 °C в течение ночи на орбитальном шейкере (100 об/мин).
- На следующий день удаляют раствор первичного антитела из каждой лунки и заменяют его 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Промывайте каждую лунку три раза с 1x PBST в течение 15 минут на промывку на орбитальном шейкере (100 об/мин).
- Замените 1x PBST разведением 1:500 козьего антимышьего антитела IgG в блокирующем буфере и инкубируйте все эмбрионы с вторичным антителом. Дайте пластине инкубировать при 4 °C в течение ночи на орбитальном шейкере (100 об/мин).
- На следующий день удалите вторичное антитело и промыть остаточный раствор три раза 1x PBST в течение 15 мин на промывку на орбитальном шейкере (100 об/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен здесь на срок до 48 ч, если корзины IHC хранятся в чистых колодцах, заполненных 1x PBS. - Используйте пипетку 1 мл, чтобы аспирировать 1x PBST из каждого колодца и поместить корзину IHC в стеклянную чашку Петри, наполненную водой RO. Под стандартным стереомикроскопом случайным образом сортируйте неповрежденные эмбрионы в 96-луночную пластину, в результате чего получается один эмбрион на лунку.
- Используя пипетку 1 мл, удалите всю воду RO из отдельных скважин и замените ее 200 мкл 1x PBS. Центрифугировать пластину в течение 3 мин при 1 х г.
4. Автоматизированная визуализация эмбрионов в 96-луночных пластинах
- Визуализируйте эмбрионы с 2-кратным объективом при пропускаемом свете и FITC с помощью системы скрининга с высоким содержанием (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентное изображение каждого эмбриона было получено автоматически с использованием вышеупомянутого увеличения и фильтра FITC19.- Выберите Автофокус , чтобы убедиться, что фокус камеры находится в нижней части пластины и смещен толщиной дна.
- Выберите длину волны FITC с длительностью экспозиции 100 мс и установите автофокус на лазер с Z-смещением. Наблюдение и подтверждение правильного получения изображений в нескольких скважинах до начала сбора плит.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор автоматически получает изображения из всех выбранных скважин, содержащих эмбрионы. Пластине с 96 скважинами требовалось около 30 минут для сбора изображений и хранения данных. В течение всего периода сбора внутренняя температура в системе визуализации поддерживалась на уровне RT.
- После получения изображения выполните анализ данных с использованием системы скрининга с высоким содержанием и пользовательской автоматизированной процедуры анализа изображений. Выберите каждый эмбрион на 96-луночной пластине для анализа общей площади и интегральной интенсивности флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ включал предоставление изображений, которые содержали наложения точек данных из анализа. - Затем сведите точки данных в таблицу и экспортируйте их из системы скрининга с высоким содержанием, перейдя в раздел «Измерение» и выбрав «Открыть журнал данных » в электронную таблицу. Части сбора пластин и анализа данных показаны на рисунке 1.
5. Анализ данных
- Загрузите экспортированную электронную таблицу в компьютерную программу, где пакет deployer (dplyr) используется для сортировки, суммирования данных для каждой скважины и фильтрации по номеру скважины. Затем пакет writexl используется для экспорта суммированных данных в электронную таблицу. Программный код 5mC показан в дополнительном файле 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы определить, влияет ли лечение на относительное изобилие 5-мС путем оценки общей площади и относительной интенсивности флуоресценции в фиксированных и меченных эмбрионах рыбок данио. После завершения протокола можно использовать флуоресцентный стереомикроскоп, чтобы сначала определить, был ли IHC успешным. Когда меченые эмбрионы наблюдаются под фильтром FITC или GFP, положительный результат указывается положительным сигналом FITC внутри эмбриона, тогда как отрицательный результат указывается отсутствием флуоресценции в контрольных эмбрионах. Используя систему скрининга с высоким содержанием, эти результаты также могут быть подтверждены во время получения изображения с помощью фильтра FITC. Кроме того, во время анализа данных пользовательский модуль будет определять и количественно оценивать общую площадь и интегральную интенсивность флуоресценции. Репрезентативные изображения успешных результатов показаны на рисунке 1, где полученные изображения были успешно измерены пользовательским модулем, а отдельные точки данных (показанные в виде синего наложения) были получены как для общей площади, так и для интегральной интенсивности.
Во время извлечения данных пороговая строгость в пользовательском модуле является дополнительной переменной, которую необходимо оптимизировать, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум и увеличить вероятность обнаружения значительной разницы в плотности 5 мС. Во время оптимизации этот конечный порог обеспечил наиболее значительное разделение между медианами контрольной и обрабатывающей групп (например, наибольшее отношение сигнал/шум). Репрезентативные результаты при различных пороговых значениях пользовательских модулей, влияющих на отношение сигнал/шум, представлены на рисунке 2.
Рисунок 1: Блок-схема, обеспечивающая графическое представление протокола воздействия и обнаружения in situ 5-метилцитозина для эмбрионов рыбок данио мощностью 6 л.с. Направление блок-схемы снабжено черными стрелками. Воздействие происходило в репликах четырех реплицированных блюд на обработку и 50 эмбрионов на реплицированное блюдо. Сокращения: см = масса ячейки; ys = желточный мешок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оптимизация пользовательского модуля. Панели A-D показывают оптимизацию пользовательского модуля путем оценки медианы и распределения 5-мС-специфической общей площади и интегральной интенсивности в эмбрионах рыбок данио при 6 л.с. (А,Б) Различные тестируемые пороговые значения перечислены в легенде справа (разница 100 между каждым порогом) и упорядочены по жесткости, где 1500 и 2500 представляют собой наименьшие и наиболее строгие пороговые значения, тестируемые соответственно. (С,Г) Различные тестируемые пороговые значения перечислены в легенде справа (разница 250 между каждым порогом) и упорядочены по строгости, где 1500 и 2500 представляют собой наименьшие и наиболее строгие пороговые значения, тестируемые соответственно. (*) в C,D обозначает пороговые значения, которые значительно отличаются от эмбрионов, обработанных транспортным средством (p < 0,05). Для А,В все испытанные пороговые значения были значительными с точки зрения управления транспортным средством. Ось X обозначает воздействие либо транспортного средства (0,1% DMSO), либо 0,78 мкМ TDCIPP (положительный контроль). Ось Y обозначает относительную флуоресценцию. Панель A отображает общую площадь 5-мС, обнаруженную в эмбрионах, в зависимости от лечения, тогда как панель B отображает интегрированную интенсивность 5-мС в той же области. Один эмбрион представлен одной точкой данных в общей сложности N = 96 для каждой группы лечения. Все воздействия проводились в репликах четырех блюд на обработку с 50 эмбрионами на стеклянную посуду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: программный код 5mC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время этого протокола есть несколько шагов, которые являются критическими. Во-первых, при дехорионации эмбрионов важно направить иглу в сторону от ткани эмбриона/желточного мешка/клеточной массы, так как эти участки развивающегося эмбриона очень хрупкие и легко прокалываются. Во-вторых, при переносе меченых эмбрионов в отдельные лунки используйте стеклянную пипетку для переноса эмбрионов, поскольку они будут прилипать к пластиковой пипетке. В-третьих, при выполнении полного монтажа IHC убедитесь, что пластина защищена от света. Наконец, после завершения протокола IHC с полным креплением, позвольте пластине инкубироваться в 1x PBS при 4 ° C в течение ночи перед визуализацией, так как это минимизирует автофлуоресценцию, которая может помешать визуализации.
Если есть эмбрионы, которые были разорваны во время дехорионации или IHC, исключите эти эмбрионы из остальной части протокола. Если флуоресценция не обнаружена, это может быть решено путем инкубации в течение более длительного времени (до 16 ч). Поскольку это 5-mC-специфическое антитело, могут быть помечены как ДНК, так и РНК. Важно общее понимание пространственной локализации.
В этом методе есть некоторые ограничения. Во-первых, это нецелевой метод, то есть он не обеспечит точное количество 5-мС, а скорее относительное изобилие, основанное на общей площади и интегральной интенсивности флуоресценции. Кроме того, этот протокол был протестирован только на эмбрионах до сегментации, поэтому при тестировании на более поздних стадиях развития может потребоваться некоторая дополнительная оптимизация. Кроме того, поскольку метод основан на IHC, он может быть подвержен неспецифическому связыванию; таким образом, он не уверен, что окрашивает только 5-мС, локализованный в ДНК, но также может окрашивать 5-мС, локализованный в РНК. Наконец, может потребоваться оптимизация порога анализа данных в зависимости от химических веществ и жесткости предпочтительных условий.
В целом, этот метод обеспечивает быстрое и экономичное обнаружение 5-мС на нескольких стадиях разработки и химических концентраций3. Таким образом, он представляет собой альтернативу непомерно дорогим подходам, основанным на секвенировании бисульфитов. Предлагая этот протокол, исследователи могут использовать этот метод для быстрого скрининга химических веществ и оценки того, как обилие 5-мС может быть затронуто во время раннего эмбрионального развития. Кроме того, этот способ может быть использован в качестве инструмента предварительного скрининга для определения диапазона концентраций, периода развития и/или окна чувствительности, в котором интересующее химическое вещество влияет на содержание 5-мС. Альтернативно, этот же метод может быть использован для другого биомаркера и антитела, хотя требуется дальнейшая оптимизация. Используя этот метод, исследователь может быстро, эффективно и экономично проверить и идентифицировать химическое вещество, которое изменяет относительное содержание 5 мС в эмбрионах рыбок данио, прежде чем инвестировать в трудоемкие подходы, основанные на секвенировании бисульфитов. Однако этот метод специфичен для рыбок данио, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли 5-mC быть обнаружен in situ в ранних эмбрионах других модельных организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.
Acknowledgments
Исследовательская поддержка была предоставлена стипендией UCR Graduate Division Fellowship для SAB, стипендией учебной программы NRSA T32 (T32ES018827) для SAB и грантом Национальных институтов здравоохранения (R01ES027576) и проектом Национального института пищевых продуктов и сельского хозяйства США (1009609) для DCV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K.
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F.
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
