Summary
この論文では、無傷のゼブラフィッシュ胚内の正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリングのためのプロトコルについて説明します。
Abstract
シトシンメチル化は脊椎動物種全体で高度に保存されており、エピジェネティックプログラミングとクロマチン状態の主要な推進力として、初期胚発生において重要な役割を果たしています。酵素修飾は、シトシンの5-メチルシトシン(5-mC)への活性メチル化および脱メチル化を促進し、続いて5-mCの5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、および5-カルボキシルシトシンへの酸化を促進します。エピジェネティックなリプログラミングは 子宮内 発育中の重要な時期であり、母親の化学物質への曝露は子孫内のエピゲノムを再プログラムする可能性があります。これは、即時の表現型の結果、成人病の感受性に対する長期的な影響、および遺伝性のエピジェネティックマークの世代を超えた影響などの有害な結果を引き起こす可能性があります。バイサルファイトベースのシーケンシングにより、研究者は塩基対分解能でシトシンメチル化を調べることができますが、シーケンシングベースのアプローチはコストがかかりすぎるため、発生段階全体でシトシンメチル化をモニタリングする機能、化学物質ごとに複数の濃度、および処理ごとに胚を複製する能力が妨げられます。自動化された in vivo イメージング、遺伝子操作、子宮 外 発生時間の迅速化、および胚形成中の飼育の容易さにより、ゼブラフィッシュ胚は、初期胚発生中の有害な結果に寄与する生体異物媒介経路を明らかにするための生理学的に無傷のモデルとして引き続き使用されています。そこで、市販の5mC特異的抗体を用いて、ホールマウント免疫組織化学、自動ハイコンテントイメージング、および統計解析前のプログラミング言語を用いた効率的なデータ処理を活用して、個々の無傷のゼブラフィッシュ胚におけるシトシンメチル化を迅速かつ効率的に時空間的にモニタリングするための費用対効果の高い戦略について説明します。現在の知る限り、この方法は、発生初期にゼブラフィッシュ胚内の in situ で5-mCレベルを検出して定量化した最初の方法です。この方法は、細胞塊内のDNAメチル化の検出を可能にし、母体から接合体への移行中に卵黄に局在する母体mRNAのシトシンメチル化を検出する能力も有する。全体として、この方法は、エピジェネティックなリプログラミング中にシトシンメチル化を in situ で破壊する可能性のある化学物質の迅速な同定に役立ちます。
Introduction
酵素修飾は、シトシンの5-メチルシトシン(5-mC)への活性メチル化および脱メチル化、およびそれに続く5-mCの5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、および5-カルボキシルシトシンへの酸化を促進します1,2。リン酸トリス(1,3-ジクロロ-2-プロピル)(TDCIPP)は、米国で広く使用されている難燃剤であり、受精後0.75時間(hpf)から早期原腸形成(6hpf)までの初期胚曝露後のシトシンメチル化の軌跡を変化させることが以前に実証されています3,4,5,6,7,8。.脊椎動物の中では、5-mCとその修飾誘導体は初期胚発生を調節するために重要です9。胚の受精は、親DNAの脱メチル化を引き起こし、続いて母体のmRNA分解、接合子ゲノムの活性化、および接合子ゲノムの再メチル化を引き起こします9。シトシンメチル化を利用する生物学的に関連するプロセスには、ヒストン修飾、転写機構の動員、RNAメチル化、エピジェネティックなリプログラミング、およびクロマチン構造の決定が含まれます10,11。シトシンメチル化は脊椎動物種の間でも保存されており、異常なシトシンメチル化が生物の発生の軌跡にどのように影響するかを理解し、調査することの重要性を強調しています11。さらに、子宮内での発達は母親の曝露に敏感であり、即時の表現型の結果、成人病の感受性に対する長期的な影響、および遺伝性のエピジェネティックマークの世代を超えた影響などの有害な結果を引き起こす可能性があります12,13,14。
長いシトシン-グアニンペア、またはCpGアイランドは、ゲノム全体のシトシンメチル化のダイナミクスを特徴付けることを目的とした研究者の主要な病巣でした15,16,17。全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、還元表現バイサルファイトシーケンシング、バイサルファイトアンプリコンシーケンシングなどのバイサルファイトベースの戦略は、塩基対分解能でシトシンメチル化を調べるためのゴールドスタンダードです。ただし、シーケンシングベースのアプローチはコストがかかりすぎるため、発生段階全体でシトシンメチル化を監視し、化学物質ごとに複数の濃度を監視し、処理ごとに胚を複製する機能がありません。さらに、シーケンシングベースのアプローチでは、影響を受ける可能性のある細胞タイプや発生中の胚内の領域を理解するために重要な空間局在に関する情報は提供されません。同様に、メチル化依存性制限分析、5-mC酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、5-メチル-2'-デオキシシチジン(5-mC)液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)などのグローバルDNAメチル化アッセイは、細胞または組織のホモジネートに依存しているため、無傷の標本内の空間および時間にわたるシトシンメチル化の局在と大きさをモニターする能力が妨げられています12,18。
自動化された in vivo イメージング、遺伝子操作、子宮 外 発生時間の迅速化、および胚発生中の飼育の容易さにより、ゼブラフィッシュ胚は、初期胚発生中の有害な結果に寄与する生体異物媒介経路を明らかにするための生理学的に無傷のモデルとして引き続き広く使用されています。したがって、以下のプロトコルでは、5-mCに特異的な市販の抗体を使用して、ホールマウント免疫組織化学(IHC)、自動化されたハイコンテントイメージング、および統計分析前のプログラミング言語を使用した効率的なデータ処理を活用して、個々の無傷のゼブラフィッシュ胚内のシトシンメチル化を迅速かつ効率的に時空間的にモニタリングするための費用効果の高い戦略について説明します。
現在の知る限り、この方法は、無傷のゼブラフィッシュ胚内の5-mCを監視する最初の方法です。この方法は、細胞塊内のDNAメチル化の検出を可能にし、母体から接合体への移行中に卵黄に局在する母体mRNAのシトシンメチル化を検出する能力も有する。全体として、この方法は、エピジェネティックなリプログラミング中にシトシンメチル化を in situ で破壊する可能性のある化学物質の迅速な同定に役立ちます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
成体ブリーダーは、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物管理使用委員会(IACUC)が承認した動物使用プロトコル(#20180063)に従って取り扱われ、扱われました。
1.ゼブラフィッシュの胚の収集と化学物質への暴露
- 性的に成熟し、生殖的に生存可能な成体のオスとメスのゼブラフィッシュを含むタンク内の繁殖トラップを追加します。収集の少なくとも12時間前に、6 Lタンクごとに少なくとも3つのトラップを追加します ~9:00 タンク内の卵の受精と産卵のおおよその時間です。
- 収集の朝に新鮮な露出溶液を準備してください。露光溶液は、5 mLピペットを使用し、5.0 mLの微粒子を含まないシステム水を60 mmガラスペトリ皿に加えます。
- 次に、10 μLのガラスマイクロキャピラリーピペットを使用して、10 μLのビヒクル(ジメチルスルホキシド、またはDMSO)または化学ストック溶液をガラス皿内のシステム水に移します。
- ガラスのペトリ皿を回転させて、原液が確実に消散します。ガラスペトリ皿にさらに5.0mLのシステム水を加えます。ガラスのペトリ皿を回転させて、露光溶液を均質化します。
- 各治療群について4回の反復で繰り返し、処理ごとに4回の反復が得られる。
- 暴露溶液を調製した後、蒸発を最小限に抑えるためにガラス皿にガラス蓋をします。
- 各タンクから繁殖トラップを取り外すときは、タンクから取り外す前に、各トラップ内の水をタンクに注意深く排出させます。トラップが右側を上にしたままであることを確認してください。
- 繁殖トラップをラボシンクに移し、逆浸透(RO)水で満たされた噴出ボトルを使用して、10%漂白剤に浸して水ですすいだ魚網に入れます。すべての破片が取り除かれ、きれいな胚だけが残るまで胚をすすいでください。
- RO水で満たされた噴出ボトルを使用して、魚網から100mmのプラスチック製ペトリ皿に胚を移します。受精後0.75時間(hpf)で50個の生胚をランダムに選別し、余分なRO水を取り除きます。
- マイクロスパチュラを使用して、選別した胚を処理液に入れます。すべての胚は、午前9時45分までにビヒクルまたは治療液内にある必要があります。ガラス皿を回転させて、胚が処理液内に均一にコーティングされていることを確認します。
- 各治療群に4つの反復ディッシュ(反復あたりN = 50)をセットアップした後、露光ディッシュの上にガラス蓋を置き、すべてのディッシュを28°Cに設定された温度制御インキュベーターに2 hpf、4 hpf、6 hpf、8 hpf、または10 hpfまで移します。
- 暴露終了の少なくとも4時間前に新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)を準備し、4°Cで保存します。
- ホットプレートを115°Cにオンにし、50 mLの遠沈管に20 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)20 mL(10 mLのPBS + 18 mLのRO水)を作り、800 mgのパラホルムアルデヒドを重量で取り除きます。
- 化学ヒュームフード内で、1x PBS溶液を250 mLの三角フラスコに移し、800 mgのパラホルムアルデヒドを加えてから、2 μLの10 N NaOHを加えます。フラスコ内に温度計を置き、フラスコをホットプレートに置き、攪拌しながら温度を確認します。
- 温度が62〜65°Cに達したら、ホットプレートから4%PFAを取り外し、室温(RT)まで冷却します。4%PFAを4°Cで保存します。
- 曝露時間が終了したら、インキュベーターから胚を取り出し、すべての生きている胚を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。1 mLピペットを使用して残留暴露溶液を吸引します。胚を吸引しないでください。
- 500 μLの冷やした4%PFAを1.5 mLの微量遠心チューブに加え、胚を4%PFAに数回反転させて混合します。胚を4%PFAで一晩固定します。
注:胚を12時間以上PFAにとどまらせることはお勧めしません。
2.胚の脱絨毛
- 翌日、4%PFAを吸引し、胚を1x PBSに再懸濁し、30秒間ゆっくりと上下にピペットで移します。必要に応じて、このステップでプロトコルを停止し、胚を1x PBSで4°Cで最大48時間保存します。
- プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、固定した胚をRO水で満たされたガラス皿に注意深く移し、30秒間穏やかに旋回させます。この手順をもう一度繰り返します。
- 標準的な実体顕微鏡を使用して5.0倍の倍率で注射針を使用し、すべての胚を手動で脱絨毛化します。これを行うには、針先を使用して絨毛膜に穴を開け、卵黄と細胞塊からそっと剥がします4。
- 胚が脱絨毛化されたら、ガラスマイクロキャピラリーピペットを使用して、最大25個の無傷の胚を1つの免疫化学(IHC)バスケットに移し、IHCバスケットを96ウェルプレートに入れます。1 mLピペットを使用して、各ウェルからRO水を吸引します。
3. 5-mC特異的抗体を用いた免疫組織化学
- ウェルあたり500 μLのブロッキングバッファー(1x PBST + 2%ヒツジ血清+ 2 mg/mLウシ血清アルブミン)に胚を再懸濁し、プレートをパラフィルムとアルミホイルで包み、光から保護します。オービタルシェーカー(100 rpm)で4°Cで4時間インキュベートします。
- パラフィルムラップとアルミニウムを取り除き、1 mLピペットを使用して各ウェルからブロッキングバッファーを吸引します。ブロッキングバッファー中のモノクローナルマウス抗5-mC抗体の1:100希釈液500 μLと交換します。バックグラウンドノイズを考慮してブロッキングバッファーとともにインキュベートされるビヒクルコントロール胚のサブセットを除く、すべての胚を一次抗体でインキュベートします。このステップ中に胚の完全性を乱したり、胚を吸引したりしないように注意してください。
- プレートをパラフィルムとアルミホイルで再包みし、プレートをオービタルシェーカー(100 rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、各ウェルから一次抗体溶液を取り出し、1x PBS + 0.1% Tween-20(1x PBST)と交換します。各ウェルを1x PBSTで1回、オービタルシェーカー(100 rpm)で1回洗浄する。
- 1x PBSTをブロッキングバッファー中のヤギ抗マウスIgG抗体の1:500希釈液に置き換え、すべての胚を二次抗体でインキュベートします。プレートをオービタルシェーカー(100 rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、二次抗体を除去し、残りの溶液をオービタルシェーカー(100 rpm)で1回1回PBSTで1回洗浄します。
注:IHCバスケットが1x PBSで満たされたクリーンウェルに保管されている場合、プロトコルはここで最大48時間停止できます。 - 1 mLピペットを使用して各ウェルから1x PBSTを吸引し、IHCバスケットをRO水で満たされたガラス製ペトリ皿に入れます。標準的な実体顕微鏡下で、無傷の胚を96ウェルプレートにランダムに分類し、ウェルごとに1つの胚を生成します。
- 1 mLピペットを使用して、個々のウェルからすべてのRO水を取り除き、200 μLの1x PBSと交換します。プレートを1 x gで3分間遠心分離します。
4. 96ウェルプレート内の胚の自動イメージング
- 透過光下で2倍の対物レンズで胚を画像化し、ハイコンテントスクリーニングシステムを使用してFITCを使用します(資料表)。
注:各胚の蛍光画像は、上記の倍率とFITCフィルター19を使用して自動的にキャプチャされました。- [オートフォーカス]を選択して、カメラの焦点がプレートの下部にあり、下部の厚さによってオフセットされていることを確認します。
- 露光時間が 100 ms の FITC波長を選択し、 オートフォーカス を Zオフセットのレーザーに設定します。プレートの取得を開始する前に、いくつかのウェルで適切な画像取得を観察して確認してください。
注:この装置は、胚を含むすべての選択されたウェルから画像を自動的に取得します。96ウェルプレートは、画像取得とデータ保存に約30分かかりました。取得期間中、イメージングシステム内の内部温度はRTに維持されました。
- 画像取得後、ハイコンテントスクリーニングシステムとカスタム自動画像解析手順を使用してデータ解析を実行します。蛍光の総面積および積分強度について分析する96ウェルプレート上の各胚を選択する。
注:分析には、分析からのデータポイントのオーバーレイを含む画像の提供が含まれていました。 - 次に、データポイントを集計し、ハイコンテントスクリーニングシステムからエクスポートするには、[ 測定 ]の下に移動し、[ データログを スプレッドシートに開く]を選択します。プレート取得とデータ分析の部分を 図1に示します。
5.データ分析
- エクスポートしたスプレッドシートをコンピュータープログラムにアップロードし、デプロイヤー(dplyr)パッケージを使用して、各ウェルのデータの並べ替え、合計、およびウェル番号によるフィルタリングを行います。次に、writexl パッケージを使用して、合計データをスプレッドシートにエクスポートします。5mCプログラムコードは補足 ファイル1に示されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルの全体的な目的は、固定および標識されたゼブラフィッシュ胚内の蛍光の総面積と相対強度を評価することにより、処理が5-mCの相対的な存在量に影響を与えるかどうかを判断することです。プロトコルが完了したら、蛍光実体顕微鏡を使用して、最初にホールマウントIHCが成功したかどうかを判断できます。標識された胚をFITCまたはGFPフィルターの下で観察する場合、陽性の結果は胚内の陽性のFITCシグナルによって示され、陰性の結果は対照胚内の蛍光の欠如によって示されます。ハイコンテントスクリーニングシステムを使用して、これらの結果はFITCフィルターを使用した画像取得中にも確認できます。さらに、データ分析中に、カスタムモジュールは蛍光の総面積と積分強度を識別して定量化します。成功した結果の代表的な画像を 図1に示し、取得した画像がカスタムモジュールによって正常に測定され、個々のデータポイント(青いオーバーレイとして表示)が総面積と積分強度の両方で取得されました。
データ抽出中、カスタムモジュール内のしきい値ストリンジェンシーは、S/N比を最大化し、5mCの存在量の治療固有の有意差を検出する確率を高めるために最適化する必要がある追加の変数です。最適化中、この最終的な閾値は、対照群と治療群の中央値の間で最も有意な分離を提供しました(例えば、最大のS/N比)。信号対雑音比に影響を与えるさまざまなカスタムモジュールスレッショルドでの代表的な結果を 図2に示します。
図1:6 hpfゼブラフィッシュ胚に対する5-メチルシトシンのばく露および in situ 検出のプロトコルのグラフィカル表現を提供するフロー図。 フロー図の方向は黒い矢印で示されています。曝露は、処理ごとに4つの複製皿の複製で発生し、複製皿ごとに50の胚で発生しました。略語:cm =細胞量;ys =卵黄嚢。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カスタムモジュールの最適化。 パネルA〜Dは、6 hpfでのゼブラフィッシュ胚内の5-mC特異的総面積および積分強度の中央値および分布を評価することにより、カスタムモジュールの最適化を示す。(A,B)テストされたさまざまなしきい値が右側の凡例に一覧表示され (各しきい値間の差は 100)、厳密性によって順序付けられ、1500 と 2500 はそれぞれテストされた最も厳しいしきい値と最も厳しいしきい値を表します。(C,D)テストされたさまざまなしきい値が右側の凡例に一覧表示され (各しきい値間の差は 250)、厳密性によって順序付けられ、1500 と 2500 はそれぞれテストされた最も厳しいしきい値と最も厳しいしきい値を表します。C,Dの(*)は、賦形剤処理された胚とは有意に異なる閾値を示す(p < 0.05)。A、Bについては、テストされたすべてのしきい値が車両制御から有意でした。x軸は、車両(0.1%DMSO)または0.78μM TDCIPP(ポジティブコントロール)のいずれかへの曝露を示します。y軸は相対蛍光を示す。パネルAは、胚内で検出された5-mCの総面積を処理の関数として表示し、パネルBは、同じ領域内の5-mCの積分強度を表示します。1つの胚は、各処置群について合計N=96の単一のデータ点によって表される。すべての曝露は、ガラス皿あたり50個の胚を用いて、処理ごとに4皿の反復で行われた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:5mCプログラムコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでは、いくつかの重要な手順があります。まず、胚を脱絨毛する場合、発生中の胚のこれらの部分は非常に壊れやすく、穿刺しやすいため、針を胚/卵黄嚢/細胞塊の組織から遠ざけることが重要です。次に、標識された胚を個々のウェルに移すときは、プラスチックピペットに付着するため、ガラスピペットを使用して胚を移植します。第三に、ホールマウントIHCを実行するときは、プレートが光から保護されていることを確認してください。最後に、ホールマウントIHCプロトコルを完了した後、イメージングを妨げる可能性のある自家蛍光を最小限に抑えるため、イメージングの前にプレートを4°Cで一晩1x PBSでインキュベートします。
脱絨毛化またはIHC中に切断された胚がある場合は、これらの胚をプロトコルの残りの部分から除外します。蛍光が検出されない場合は、より長い(最大16時間)インキュベートすることで解決できます。これは5mC特異的抗体であるため、DNAとRNAの両方を標識することができます。空間ローカリゼーションの一般的な理解は重要です。
この方法にはいくつかの制限があります。第一に、これは非標的技術であり、5-mCの正確な量を提供するのではなく、蛍光の総面積と積分強度に基づく相対的な存在量を提供することを意味します。さらに、このプロトコルはセグメンテーションの前に胚でのみテストされているため、発生の後期段階でテストする場合は、追加の最適化が必要になる場合があります。さらに、この方法はIHCベースであるため、非特異的結合の影響を受けやすい可能性があります。したがって、DNAに局在する5-mCのみを染色することは確かではありませんが、RNAに局在する5-mCも染色し得る。最後に、好ましい条件の化学的および厳密性に応じて、データ分析しきい値の最適化が必要になる場合があります。
全体として、この方法は、開発の複数の段階および化学物質濃度にわたって5-mCの迅速かつコスト効率の高い検出を提供します3。したがって、コストのかかるバイサルファイトシーケンシングベースのアプローチに代わるものを提供します。このプロトコルを提供することにより、研究者はこの方法を使用して化学物質を迅速にスクリーニングし、初期胚発生中に5-mCの量がどのように影響を受けるかを評価できます。さらに、この方法は、目的の化学物質が5-mCの存在量に影響を与える濃度範囲、開発期間、および/または感度のウィンドウを特定するための事前スクリーニングツールとして利用することができます。あるいは、この同じ方法を、さらなる最適化が必要であるが、異なるバイオマーカーおよび抗体に利用してもよい。この方法を利用することにより、研究者は、労働集約的なバイサルファイトシーケンシングベースのアプローチに投資する前に、ゼブラフィッシュ胚内の5-mCの相対的な存在量を変化させる化学物質を迅速、効率的、かつ費用効果の高い方法でスクリーニングおよび特定できます。しかし、この方法はゼブラフィッシュ特異的であり、他のモデル生物の初期胚内で5-mCを その場 で検出できるかどうかを決定するには、さらなる研究が必要です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある競合する金銭的利益や個人的な関係は知られていないと宣言しています。
Acknowledgments
研究支援は、SABへのUCR大学院部門フェローシップ、SABへのNRSA T32トレーニングプログラムフェローシップ(T32ES018827)、およびDCVへの国立衛生研究所助成金(R01ES027576)およびUSDA国立食品農業研究所ハッチプロジェクト(1009609)によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
