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Genetics

सी. एलिगेंस इम्यूनोफ्लोरेसेंस और डीएपीआई धुंधला होने के लिए गोनैड विच्छेदन और फ्रीज क्रैक

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Massachusetts Lowell
* These authors contributed equally

Summary

एलिगेंस गोनाड विच्छेदन के लिए यह आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, जिसके बाद फ्रीज क्रैक होता है, जो एंटीबॉडी धुंधला होने के माध्यम से इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए जर्मलाइन नमूने पैदा करता है, या डीएनए की कल्पना करने के लिए सरल डीएपीआई धुंधला होता है। यह प्रोटोकॉल एक शोध प्रयोगशाला में स्नातक और पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव में स्नातक के लिए सफल रहा है।

Abstract

सी एलिगेंस जर्मलाइन अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाता है, आंशिक रूप से विच्छेदित जानवरों पर साइटोलॉजिकल विश्लेषण करने में आसानी के कारण। पूरे माउंट की तैयारी मियोटिक नाभिक की संरचना को संरक्षित करती है, और महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्येक गोनाड हाथ में अर्धसूत्रीविभाजन के सभी चरण होते हैं, जो एक अस्थायी-स्थानिक प्रगति में संगठित होते हैं जो विभिन्न चरणों में नाभिक की पहचान करना आसान बनाता है। वयस्क हेर्मैफ्रोडाइट्स में दो गोनाड भुजाएं होती हैं, जिनमें से प्रत्येक को एक बंद ट्यूब के रूप में व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें डिस्टल बंद छोर पर जर्मलाइन स्टेम कोशिकाएं और समीपस्थ खुले छोर पर सेलुलर अंडाणु होते हैं, जो गर्भाशय के केंद्र में जुड़ते हैं। विच्छेदन शरीर की गुहा से एक या दोनों गोनैड बाहों को छोड़ता है, जिससे अर्धसूत्रीविभाजन की संपूर्णता की कल्पना की जा सकती है। यहां, रुचि के प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, इसके बाद सभी गुणसूत्रों को चिह्नित करने के लिए डीएपीआई धुंधला हो जाता है। युवा वयस्कों को लेविसोल में स्थिर किया जाता है और दो सिरिंज सुइयों का उपयोग करके जल्दी से विच्छेदित किया जाता है। जर्मलाइन एक्सट्रूज़न के बाद, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज दरार से गुजरने से पहले नमूना तय किया जाता है, जो छल्ली और अन्य ऊतकों को स्थिर करने में मदद करता है। नमूना तब इथेनॉल में निर्जलित किया जा सकता है, पुनर्जलीकृत किया जा सकता है, और प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जा सकता है। DAPI को बढ़ते माध्यम में नमूने में जोड़ा जाता है, जो डीएनए के विश्वसनीय विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत जानवरों को छवि खोजने में आसान बनाता है। इस तकनीक को उन लोगों द्वारा आसानी से अपनाया जाता है जो सी एलिगेंस को संभालने से परिचित हैं, कुछ घंटों के बाद विच्छेदन विधि का अभ्यास करने में खर्च किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को एक शोध प्रयोगशाला में काम करने वाले हाई-स्कूलर्स और अंडरग्रेजुएट्स को पढ़ाया गया है और एक उदार कला कॉलेज में पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव में शामिल किया गया है।

Introduction

अर्धसूत्रीविभाजन एक विशेष कोशिका विभाजन है जिसका उपयोग सभी यौन प्रजनन करनेवाले जीवों में युग्मक (अंडे और शुक्राणु / पराग) बनाने के लिए किया जाता है। क्रॉसओवर पुनर्संयोजन समरूप गुणसूत्रों के बीच डीएनए का पारस्परिक आदान-प्रदान है; यह अर्धसूत्रीविभाजन के लिए आवश्यक है, दोनों आनुवंशिक विविधता का एक महत्वपूर्ण स्रोत प्रदान करते हैं और पीढ़ियों के माध्यम से जीनोम स्थिरता को बढ़ावा देते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान कम से कम एक क्रॉसओवर बनाने में विफल रहने वाले गुणसूत्र बेतरतीब ढंग से अलग हो जाएंगे, जिसके परिणामस्वरूप क्रोमोसोम नॉनडिसजंक्शन हो सकता है, जिससे गुणसूत्रों की गलत संख्या के साथ युग्मक बन सकते हैं - एक ऐसी स्थिति जो आमतौर पर परिणामी संतान3 के लिए घातक होती है। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, क्रॉसओवर को प्रोग्राम किए गए डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक4 द्वारा प्रेरित किया जाता है। इन ब्रेकों के एक उप-समूह को क्रॉसओवर के रूप में मरम्मत की जाएगी जो डीएनए के भौतिक लिंकेज प्रदान करते हैं, जिसे चियास्माटा कहा जाता है, जो कोशिका विभाजन 5 की तैयारी में समरूप गुणसूत्रों को उन्मुख करने में मदद करताहै। सभी यूकेरियोट्स में मीओटिक चरण अत्यधिक संरक्षित होते हैं, और उनके क्रोमोसोमल अनुरूपण उन्हें आसानी से पहचानने की अनुमति देते हैं।

जीव विज्ञान में एक मौलिक अवधारणा के रूप में, अर्धसूत्रीविभाजन एक ऐसा विषय है जिसका छात्रों को विभिन्न जीव विज्ञान पाठ्यक्रमों में कई बार सामना करना पड़ता है। उन्हें अक्सर हाई स्कूल में मियोटिक गुणसूत्र अलगाव के यांत्रिकी से परिचित कराया जाता है, जबकि कॉलेज स्तर के पाठ्यक्रम अलगाव के सेल जीव विज्ञान और क्रॉसओवर पुनर्संयोजन के आनुवंशिक प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, अर्धसूत्रीविभाजनकई छात्रों के लिए एक कुख्यात मुश्किल अवधारणा है। जीन, डीएनए, क्रोमोसोम और अर्धसूत्रीविभाजन के बीच संबंधों को समझने में विफलता छात्र गलतफहमी और समझ में अंतराल उत्पन्न कर सकती है जो आनुवंशिक विरासत 6,7 की पूरी समझको बाधित करती है। अमूर्त विषयों की छात्र समझ में सुधार करने का एक तरीका ठोस, हाथों से गतिविधियां प्रदान करना है। उदाहरण के लिए, अर्धसूत्रीविभाजन सिखाते समय, प्रशिक्षक उन गतिविधियों से चुन सकते हैं जो आणविक विश्लेषण8, 3 डी मॉडल का अनुकरण करते हैं जो छात्रों को अणुओं9 में हेरफेर करने की अनुमति देते हैं, या रोल-प्ले जहां छात्र स्वयं आणविक कोरियोग्राफी1 का कार्य करते हैं। अज्ञात परिणामों के साथ अनुसंधान को शामिल करना छात्र की समझ में सुधार करने का एक विशेष रूप से प्रभावी तरीका है। इस अभ्यास को पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव (CURE) के रूप में जाना जाता है और इसमें छात्र दृष्टिकोण और एजेंसी को मजबूत करने का अतिरिक्त लाभ है, विशेष रूप से उन समूहों से संबंधित लोगों के लिए जो STEM10,11 में कम प्रतिनिधित्व करते हैं। नेमाटोड वर्म केनोरहाब्डिस एलिगेंस विशेष रूप से व्यवहार, प्रजनन क्षमता और आनुवंशिक क्रॉस के कक्षा अध्ययन के लिए उत्तरदायी है, और छात्रों को जैविक अनुसंधानसे परिचित कराने के लिए एक प्रभावी मॉडल है।

एलिगेंस सरल साइटोलॉजिकल विश्लेषण के साथ आणविक आनुवंशिकी के संयोजन से कोशिका जीव विज्ञान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाता है। यह जीव विज्ञान कक्षा 13,14,15 में उपयोग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। वे एक प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए आसान और किफायती हैं, हर 3 दिनों में सैकड़ों संतानों का उत्पादन करते हैं, दोनों मानक कमरे के तापमान पर या 20 डिग्री सेल्सियस पर, सबसे आम इनक्यूबेशन तापमान पर। महत्वपूर्ण रूप से, उन्हें ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में फ्रीज किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जा सकता है, जिसका अर्थ है कि नौसिखिए शोधकर्ताओं द्वारा की गई किसी भी पशुपालन गलतियों को आसानी से ठीक किया जा सकताहै। इसके अलावा, इसका अच्छी तरह से एनोटेट किया गया जीनोम आगे और रिवर्स आनुवंशिकतकनीकों 17,18 के लिए अनुमति देता है, जिससे सी एलिगेंस का उपयोग आणविक से विकासवादी तक जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। एलिगेंस शोधकर्ताओं ने एक सहायक समुदाय बनाया है जो अक्सरनवोदित वैज्ञानिकों के लिए मदद और सलाह प्रदान करने के लिए तैयार है। इन लाभों के कारण सी एलिगेंस को विभिन्न प्रकार के संस्थानों 12,19,20,21,22,23 में कई सीयूआरई में शामिल किया गया है।

अनुसंधान और शिक्षण के लिए इसके लाभों के अलावा, सी एलिगेंस अर्धसूत्रीविभाजन और जर्मलाइन विकास 24,25,26 के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बन गया है। इन जानवरों की ऑप्टिकल स्पष्टता साइटोलॉजिकल दृष्टिकोण27 को सरल करती है, और वयस्कों में, गोनैड जानवर के लगभग आधे हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं, अध्ययन करने के लिए सैकड़ों मिओटिक कोशिकाएं प्रदान करते हैं। गोनैड्स में, मियोटिक जर्मलाइन नाभिक को असेंबली लाइन की तरह व्यवस्थित किया जाता है (चित्रा 1); माइटोटिक प्रतिकृति गोनाड के बाहर के सिरे पर होती है, जिसमें नाभिक मियोटिक चरणों के माध्यम से प्रगति करते हैं क्योंकि वे गोनाड के समीपस्थ छोर की ओर पलायन करते हैं, जहां निषेचित भ्रूण वल्वा से निकलते हैं। क्योंकि रूढ़िबद्ध स्थानिक संगठन अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से एक अस्थायी प्रगति का भी प्रतिनिधित्व करता है, विभिन्न चरणों को उनके क्रोमोसोमल संगठन और गोनाड में स्थान के आधार पर आसानी से पहचाना जा सकता है। अंत में, प्रक्रियाएं जो अर्धसूत्रीविभाजन को बाधित करती हैं और एन्यूप्लोइडी का कारण बनती हैं, वे फेनोटाइप बनाती हैं जो नौसिखियों के लिए भी चिह्नित करने के लिए सरल हैं: बाँझपन, भ्रूण की घातकता, या पुरुषों की उच्च घटना (हिम फेनोटाइप) 28।

यह सी एलिगेंस में मायोटिक गुणसूत्रों की कल्पना करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल है। माउंटिंग, विच्छेदन, फिक्सिंग और एंटीबॉडी धुंधला होना सभी एक ही माइक्रोस्कोप स्लाइड पर किए जाते हैं, जो प्रोटोकॉल को सरल बनाता है और लगभग सही नमूना वसूली की अनुमति देता है। यह विधि क्रोमोसोम की कल्पना करने के लिए सरल डीएपीआई धुंधला करने के लिए काम करती है और इसका उपयोग गोनैड में प्रोटीन के स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए किया जा सकता है। छात्र बुनियादी विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गोनैड्स का विच्छेदन करते हैं, डीएनए या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए पूरे माउंट की तैयारी उत्पन्न करते हैं, और उन्हें एक यौगिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर चित्रित करते हैं। इस प्रोटोकॉल को सी एलिगेंस रिसर्च लैब में काम करने वाले हाई-स्कूल के छात्रों और अंडरग्रेजुएट्स को पढ़ाया गया है और एक उदार कला कॉलेज12 में क्योर में शामिल किया गया है। यद्यपि क्योर का अपेक्षाकृत छोटा वर्ग आकार था, यह प्रोटोकॉल कृमि उपभेदों और अभिकर्मकों की अपेक्षाकृत कम लागत के कारण संस्थानों की एक श्रृंखला में वर्गों के लिए उत्तरदायी होगा। प्रशिक्षकों को केवल उपयोग के लिए उपलब्ध विच्छेदन माइक्रोस्कोप की संख्या से सीमित किया जाएगा। पिछले कार्यान्वयन में छात्रों को एक माइक्रोस्कोप साझा करने के लिए तीन के समूहों में काम करना था और तीन 90 मिनट के सत्रों में हुआ था: पहला विच्छेदन का अभ्यास करने के लिए, दूसरा विच्छेदन और डीएपीआई धुंधला करने के लिए, और तीसरा वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर इमेज स्लाइड्स के लिए। स्नातक अनुसंधान में भागीदारी11,29, अकादमिक और व्यक्तिगत दोनों छात्रों के लिए कई लाभ प्रदान करती है। सीयूआरई के माध्यम से पाठ्यक्रमों में अनुसंधान एम्बेड करने से छात्रों को सामान्य कक्षा समय11,30,31 के दौरान अनुसंधान में भाग लेने की अनुमति मिलती है, जो इन लाभों के संपर्क को अधिक सुलभ और न्यायसंगत बनाता है।

Protocol

1 . सी एलिगेंस पशुपालन

नोट: अधिक विवरण के लिए सी एलिगेंस रखरखाव प्रोटोकॉल16 और एल्गिन एट अल .32 देखें। एलिगेंस उपभेदों को आसानी से केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर (https://cgc.umn.edu) से प्राप्त किया जा सकता है और अमेरिका में किसी भी स्थान पर नियमित मेल के माध्यम से भेज दिया जाता है। प्रत्येक स्ट्रेन की लागत $ 10 है, और प्रत्येक प्रयोगशाला / उपयोगकर्ता $ 30 का वार्षिक शुल्क देता है।

  1. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, 6 सेमी नेमाटोड विकास मध्यम आगर प्लेटें (एनजीएम एगर प्लेट्स) तैयार करें।
    नोट: डाली गई प्लेटों को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपने मूल प्लास्टिक आस्तीन या एयरटाइट कंटेनर में उल्टा संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. एनजीएम एगर प्लेटें बनाने के लिए, 3 ग्राम एनएसीएल, 2.5 ग्राम बैक्टो पेप्टोन, 20 ग्राम एनजीएम एगर, और डीडीएच2ओ से 1 एल (~ 975 एमएल) जोड़ें। एक तरल चक्र का उपयोग करके मीडिया को ऑटोक्लेव करें जो 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर रहता है। 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें, और बाँझ तकनीक का उपयोग करके, 1 एमएल कोलेस्ट्रॉल, 1 एमसीएल2 के 0.5 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4 के 1 एमएल, और 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच 6) के 25 एमएल जोड़ें।
      नोट: 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर बनाने के लिए, 108.3 ग्राम केएच2पीओ4 (मोनोबेसिक) और 35.6 ग्राम के2एचपीओ4 (डिबासिक) मिलाएं; यदि आवश्यक हो, तो KOH का उपयोग करके pH को 6 में समायोजित करें। ddH 2O को 1 L (आमतौर पर ~ 900 mL) तक जोड़ें और 121 °C पर 40 मिनट के लिए ऑटोक्लेव जोड़ें।
  2. सीरोलॉजिकल या ट्रांसफर पाइपेट का उपयोग करके, प्लेटों को ई.कोलाई ओपी 50 बैक्टीरियल कल्चर (~ 150 μL) की तीन बूंदों के साथ स्पॉट करें। प्लेट के केंद्र में स्पॉट करने की कोशिश करें और प्लेट किनारों के बहुत करीब धब्बे रखने से बचें; यह जानवरों को प्लेटों के किनारों पर रेंगने और डिसिकेटिंग करने से हतोत्साहित करेगा।
  3. एक बार जब बैक्टीरियल लॉन सूख जाता है, तो धब्बेदार प्लेटों को कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 सप्ताह तक उल्टा स्टोर करें। उपयोग करने से कम से कम 1-2 दिन पहले प्लेटों को स्पॉट करने से बैक्टीरिया लॉन मोटे हो जाएंगे और जानवरों के उच्च घनत्व का समर्थन करेंगे।
    नोट: ओपी 50 जीवाणु संस्कृतियों को तैयार करने के लिए, ओपी 50 को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर से आदेश दिया जा सकता है। ओपी 50 बैक्टीरिया को एकल कॉलोनियों को सुनिश्चित करने के लिए एलबी प्लेट पर ग्लिसरॉल स्टॉक से लकीरें जाती हैं और 4-6 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। ओपी 50 बैक्टीरियल कल्चर एक ही कॉलोनी से 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एलबी में उगाए जाते हैं - कोई झटका आवश्यक नहीं है। एलबी मीडिया तैयार करने के लिए, 10 ग्राम ट्रिप्टोन, 10 ग्राम एनएसीएल, 5 ग्राम खमीर निकालने, 950 एमएल डीडीएच2ओ जोड़ें, पीएच को 10 एन एनएओएच के साथ 7 में समायोजित करें और अंतिम मात्रा को डीडीएच2ओ के साथ 1 एल में समायोजित करें।
  4. प्रत्येक स्ट्रेन के लिए एक वर्किंग स्टॉक बनाने के लिए, एक स्पॉटेड एनजीएम प्लेट पर तीन एल 4-स्टेज हेर्मैप्रोडाइट्स चुनें। प्लेटों को 15-25 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। मानक संवर्धन की स्थिति 20 डिग्री सेल्सियस है। यदि तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटरों तक पहुंच उपलब्ध नहीं है, तो आरटी पर बेंच टॉप पर संस्कृतियों को बनाए रखें।
    नोट: एल 4-चरण हेर्मैफ्रोडाइट्स को आसानी से आकार (वयस्कों की तुलना में छोटा) और उनके शरीर (विकासशील योनी) के माध्यम से आधे रास्ते में एक अलग आधे सर्कल की उपस्थिति दोनों द्वारा मंचित किया जा सकता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर, जानवर अंडे सेने के 34-46 घंटे बाद एल 4 चरण तक पहुंच जाएंगे (जो भ्रूण बिछाने के बाद लगभग 40-52 घंटे है)। विकास के चरणों के समय के बारे में अधिक जानकारी के लिए कोर्सी एट अल .14 देखें।
    1. विकास की दर को नियंत्रित करने के लिए संस्कृतियों को विभिन्न तापमानों पर स्थानांतरित करें। जानवर उच्च तापमान पर तेजी से और कम तापमान पर धीमी गति से बढ़ेंगे। वे 25 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर बाँझ बनना शुरू कर देंगे।
      नोट: कुछ उत्परिवर्ती जीनोटाइप तापमान-संवेदनशील होते हैं और संवर्धन तापमान के आधार पर विभिन्न फेनोटाइप प्रदर्शित करेंगे।
  5. हर 4 दिनों में एक नई स्पॉटेड एनजीएम प्लेट में तीन एल 4-स्टेज हेर्मैप्रोडाइट्स चुनकर कामकाजी स्टॉक बनाए रखें। ऐसा करने से विकास के चरणों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक निरंतर, अच्छी तरह से पोषित आबादी सुनिश्चित होगी।

2. गोनाड विच्छेदन

  1. आयु-मिलान वाले वयस्कों को इकट्ठा करना: विच्छेदन से 12-24 घंटे पहले, एल 4-चरण हेर्मैप्रोडाइट्स को एक नई चित्तीदार एनजीएम प्लेट में चुनें - ये अगले दिन युवा वयस्कों में विकसित होते हैं, जो विच्छेदन के लिए आदर्श है। एल 4-चरण हेर्मैफ्रोडाइट्स की संख्या साइटोलॉजिकल विश्लेषण किए जाने पर निर्भर करेगी; आमतौर पर, प्रति स्लाइड 10-20 हेर्मैप्रोडाइट्स को विच्छेदित किया जाता है, जिसमें प्रति स्थिति दो से चार स्लाइड उत्पन्न होती हैं।
    नोट: गोनैड्स को अच्छी तरह से खिलाए गए जानवरों में सबसे कुशलता से बाहर निकाला जाता है। काम करने वाले स्टॉक से एल 4 हेर्मैफ्रोडाइट्स चुनना सुनिश्चित करें जो भूखे नहीं हैं (यानी, अभी भी प्लेट पर एक दृश्यमान जीवाणु लॉन मौजूद है)। भूखे जानवर अपूर्ण गोनाड एक्सट्रूज़न से गुजरते हैं, जिससे उन्हें कल्पना करना मुश्किल हो जाता है।
    1. यदि डायकिनेसिस जैसे अर्धसूत्रीविभाजन के बाद के चरणों का आकलन करते हैं, तो पुराने वयस्कों (48 घंटे पोस्ट-एल 4) को विच्छेदित करें क्योंकि वे विश्लेषण को सरल बनाते हुए अधिक डायकिनेसिस-चरण नाभिक जमा करते हैं। हालांकि, शोधकर्ताओं को इस संभावना पर ध्यान देना चाहिए कि कुछ प्रभाव उन्नत मातृ आयु के कारण हो सकते हैं।
  2. विच्छेदन के लिए तैयार रहें।
    1. एम 9 तैयार करें: 3 ग्राम केएच2पीओ4 (मोनोबेसिक), 6 ग्राम एनए2एचपीओ4 (डिबासिक), 5 ग्राम एनएसीएल जोड़ें, और डीडीएच2ओ से 100 एमएल जोड़ें। 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए घोल को ऑटोक्लेव करें, इसे ठंडा होने दें, और फिर बाँझ तकनीक का उपयोग करके 1 एमएल 1 एम एमजीएसओ4 जोड़ें।
    2. विच्छेदन बफर तैयार करें: 10% ट्वीन 20 के 1 μL, 100 mM levamisole के 12 μL, 10x M9 के 10 μL, और ddH2O के 77 μL मिलाएं।
      नोट: ट्वीन 20 को सतह के तनाव को कम करने और ऊतक झिल्ली को आगे बढ़ाने के लिए विच्छेदन बफर में शामिल किया गया है।
    3. फिक्स समाधान तैयार करें (2% PFA [100 μL]): 16% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) के 12.5 μL, 10x M9 के 10 μL, और ddH2O के 77.5 μL मिलाएं; पीएफए के एक ताजा एम्प्यूल का उपयोग करना सुनिश्चित करें (2 सप्ताह से अधिक समय तक नहीं खोला गया)।
      सावधानी: पीएफए एक खतरनाक रसायन है, और फ्यूम हुड में फिक्स समाधान तैयार किया जाना चाहिए।
    4. फ्रीजिंग विधि स्थापित करें-तरल नाइट्रोजन का प्रबंधन करना आसान है, लेकिन यदि आवश्यक हो, तो शुष्क बर्फ के ऊपर एक एल्यूमीनियम ब्लॉक का उपयोग किया जा सकता है।
      1. तरल नाइट्रोजन विधि: एक पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में एक प्लास्टिक बीकर या एक प्लास्टिक कोप्लिन जार सेट करें। बीकर को तरल नाइट्रोजन से भरें (पॉलीस्टाइनिन कंटेनर में अतिप्रवाह ठीक है)। पास में चिमटी सेट करें। आदर्श रूप से, बीकर को माइक्रोस्कोप स्लाइड को पूरी तरह से क्षैतिज-स्लाइड गिरने से रोकने के लिए पर्याप्त संकीर्ण होना चाहिए- स्लाइड को झुकाव पर होना चाहिए और चिमटी के साथ पकड़ना आसान होना चाहिए।
        नोट: तेजी से ठंडा होने के कारण बिखरने से बचने के लिए कांच के बजाय तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
      2. सूखी बर्फ विधि:
        1. पॉलीस्टाइनिन कंटेनर या आयताकार बर्फ की बाल्टी में सूखी बर्फ पर एक सपाट एल्यूमीनियम ब्लॉक रखें। स्लाइड्स को फ्रीज करना आसान है यदि ब्लॉक का शीर्ष कंटेनर के शीर्ष के ऊपर बैठता है।
        2. दस्ताने पहने हुए, सूखी बर्फ के साथ अच्छा संपर्क सुनिश्चित करने और शीतलन प्रक्रिया को तेज करने के लिए एल्यूमीनियम ब्लॉक पर धीरे से दबाएं (यह धातु के तेजी से ठंडा होने पर एक चीख जारी कर सकता है)। पास में एक रेजर ब्लेड सेट करें।
        3. एल्यूमीनियम ब्लॉक को सूखी बर्फ पर कम से कम 30 मिनट के लिए फ्रीज-क्रैक स्टॉप से पहले छोड़ दें ताकि पूर्ण ठंडा हो सके, जो त्वरित फ्रीज के लिए आवश्यक है।
          नोट: आदर्श रूप से, सूखी बर्फ के ठोस ब्लॉकों का उपयोग किया जाना चाहिए, जो सतह को स्तर बनाए रखने में मदद करता है। यदि आवश्यक हो, तो एल्यूमीनियम ब्लॉक को सूखी बर्फ के छर्रों पर रखा जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि सतह स्तर बनी रहे।
        4. एल्यूमीनियम ब्लॉक की सतह ठंढ एकत्र करेगी, जो स्लाइड और ब्लॉक के बीच घनिष्ठ संपर्क को रोक सकती है। सतह से ठंढ को खुरचने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें, प्रत्येक स्लाइड के लिए एक क्षेत्र को साफ करें। पॉलीस्टाइनिन कंटेनर को ढक्कन के साथ कवर करने से अत्यधिक ठंढ संचय को रोकने में मदद मिलेगी।
    5. 95% इथेनॉल के ~ 40 एमएल के साथ एक कोप्लिन जार भरें।
    6. पीबीएस-टी के ~ 40 एमएल के साथ तीन कोप्लिन जार भरें।
      नोट: पीबीएस-टी बनाने के लिए, 10x PBS के 100 mL, Triton X-100 के 5 mL और 0.5 M EDTA (pH 8) के 2 mL मिलाएं। ddH2O के 873 mL जोड़ें। ट्राइटन एक्स -100 को भंग करने के लिए जोर से हिलाएं। 10x PBS बनाने के लिए, Na 2 HPO4.7H 2 O के25.6ग्राम, NaCl के80 ग्राम, KCl के 2 g और KH 2 PO4 के2g को मिलाएं। 121डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए मात्रा को 1 एल तक लाने के लिए डीडीएच 2 ओ जोड़ें। डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स -100 को सतह के तनाव को कम करने और स्लाइड पर पूरे माउंटेड जानवरों के प्रतिधारण को बढ़ाने के लिए वॉश बफर पीबीएस-टी में शामिल किया गया है।
  3. 18 मिमी x 18 मिमी ग्लास कवरलिप पर जानवरों को विच्छेदित करें। विच्छेदन बफर के वाष्पीकरण के कारण यह कदम समय-संवेदनशील है। विच्छेदन को पूरा करने में 5 मिनट से कम समय लगना चाहिए।
    नोट: लेवामिसोल का उपयोग जानवरों को विच्छेदन करने में आसान बनाने के लिए किया जाता है, लेकिन उन्हें बहुत लंबे समय तक लेविसोल में छोड़ने से खराब गोनाड एक्सट्रूज़न होगा। 5 मिनट की समय सीमा के भीतर फिट होने के लिए प्रति स्लाइड विच्छेदित जानवरों की संख्या को कम करना सबसे आसान है।
    1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर एक होल्डिंग स्लाइड रखें- होल्डिंग स्लाइड का उपयोग कवरस्लिप को अधिक आसानी से स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है, और अनिश्चित काल तक पुन: उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 2 ए, बाएं फोटो)।
    2. कवरस्लिप को होल्डिंग स्लाइड के शीर्ष पर रखें और विच्छेदन समाधान के 4 μL को कवरस्लिप के केंद्र में रखें। दृश्य को मुक्त करने के लिए होल्डिंग स्लाइड को मंच के एक तरफ ले जाएं।
    3. विच्छेदन समाधान की बूंद में 10-20 हेर्मैप्रोडाइट्स चुनें। ~ 10 प्रति स्लाइड छवि बनाने के लिए पर्याप्त जानवरों का चयन करें, लेकिन इतने अधिक नहीं कि उन्हें 5 मिनट के भीतर विच्छेदित नहीं किया जा सके।
    4. दो सिरिंज सुइयों का उपयोग करके जानवरों को विच्छेदित करें, प्रत्येक हाथ के लिए एक (चित्रा 2 ए)।
      1. एक्स-आकार बनाने के लिए सुइयों के बिंदुओं को पार करें और कवरस्लिप की सतह पर एक वयस्क को पिन करने के लिए एक्स के निचले हिस्से का उपयोग करें।
        नोट: कोण और रोटेशन के संदर्भ में प्रत्येक सुई को पकड़ने का सबसे अच्छा तरीका खोजने के लिए अभ्यास करना पड़ सकता है। सुइयों को उनके तिरछे किनारे के साथ पकड़कर शुरू करें। एक बड़ी मात्रा में विच्छेदन करने के लिए पहले सीखने पर सुझावों के लिए चर्चा देखें (चित्रा 2 डी)।
      2. एक्स-आकार को ग्रसनी के ठीक पीछे रखें, एक युवा वयस्क के शरीर की लंबाई का लगभग 1/5, या सिर के स्पष्ट भाग के ठीक नीचे (चित्रा 2 ए, दाएं आरेख)।
      3. जानवर को एक कैंची गति से काट दें (जैसे चाकू और कांटे के साथ भोजन का टुकड़ा करना)। एक अच्छा एक्सट्रूज़न के परिणामस्वरूप गोनैड (या कभी-कभी दोनों हाथ) का एक हाथ शरीर की गुहा से पूरी तरह से निकल जाएगा, साथ ही आंत के एक या दोनों हिस्सों (चित्रा 2 बी, बाईं छवि)। आंत गहरे और समान चौड़ाई की दिखाई देगी, जबकि गोनाड एक डिस्टल टेपर्ड टिप के साथ स्पष्ट दिखाई देगा।
        1. प्रत्येक जानवर को केवल एक बार काटा जाना चाहिए; यदि काटने के बाद गोनाड बाहर नहीं निकलता है, तो बस अगले जानवर पर जाएं। पहली कटौती शरीर में हाइड्रोस्टेटिक दबाव को काफी कम कर देती है, जिससे किसी भी और कटौती के परिणामस्वरूप बेहतर एक्सट्रूज़न होने की संभावना नहीं है। अपूर्ण या खराब एक्सट्रूज़न इमेजिंग के दौरान आसानी से दिखाई देते हैं और इसे अनदेखा किया जा सकता है (चित्रा 2 बी, सही छवि)।
          नोट: गोनाड को शव से अलग करने का प्रयास न करें-ऐसा करने से आमतौर पर ऊतक फट जाएगा और मिओटिक चरणों की संख्या सीमित हो जाएगी जिनका विश्लेषण किया जा सकता है।
      4. कवर स्लिप पर शेष जानवरों के लिए विच्छेदन दोहराएं।
  4. फॉर्मलाडेहाइड के साथ नमूना ठीक करें।
    1. धीरे से काम करते हुए, कवरस्लिप पर फिक्स समाधान का 4 μL जानवरों के साथ बूंद के बहुत करीब है। आदर्श रूप से, बूंदें विलय करने के लिए काफी करीब हैं; विच्छेदन बूंद में सीधे पाइपिंग से बचें और विच्छेदित शवों को विस्थापित करें।
    2. एक उंगली का उपयोग करके कवरस्लिप को होल्डिंग स्लाइड पर पिन करें। दूसरी ओर, बूंदों को मिलाने के लिए कवरस्लिप को धीरे से कुछ बार फ्लिक करें। अंतिम फिक्स एकाग्रता 0.8% पीएफए है।
    3. सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड को सामने की तरफ पकड़ते हुए, स्लाइड के केंद्र में कवरस्लिप को उठाने के लिए इसका उपयोग करें। धीरे से नमूना ड्रॉप को स्पर्श करें, और बूंद की सतह तनाव कवरस्लिप को उठाएगा।
      नोट: सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड्स में एक इलेक्ट्रोस्टैटिक कोटिंग होती है जो ऊतकों को नमूना हानि को रोकने के लिए सतह का पालन करने में मदद करती है।
      1. यदि वांछित हो, तो कवरस्लिप को तिरछे रूप से रखें, जैसे कि एक कोना स्लाइड के ऊपरी या निचले किनारे से 1 मिमी तक लटका हो। ओवरहैंग छोड़ने से ठंड के बाद कवरस्लिप को तोड़ना आसान हो जाएगा (चित्रा 2 सी)।
    4. बेंच पर स्लाइड सेट करें और आरटी पर ठीक 5 मिनट के लिए तय करें। इस दौरान स्लाइड को पेंसिल से लेबल करें।
      नोट: नमूनों को ओवर-फिक्स करना आम है, जिसे नाभिक या यहां तक कि सभी ऊतकों से एंटीबॉडी के बहिष्करण से पता लगाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, कुछ एंटीबॉडी विशेष रूप से फॉर्मलाडेहाइड के प्रति संवेदनशील होते हैं। इन मामलों में, निर्धारण समय को कम करें, या उपयोग किए गए फॉर्मलाडेहाइड की अंतिम एकाग्रता को कम करें।
  5. फ्रीज-क्रैक
    1. फिक्स के तुरंत बाद, स्लाइड्स को फ्रीज करें।
      1. तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते समय: ट्वीज़र्स के साथ स्लाइड के लेबल किनारे को पकड़ें और धीरे से इसे तरल नाइट्रोजन में कम करें। स्लाइड को इस तरह छोड़ें कि यह बीकर के किनारे पर झुक जाए, कवर-साइड ऊपर। स्लाइड 10 सेकंड के भीतर जमे हुए हैं (एक बार जब तरल उबलना बंद हो जाता है)।
      2. सूखी बर्फ का उपयोग करते समय: रेजर के साथ एल्यूमीनियम ब्लॉक की सतह से ठंढ को खुरचें। स्लाइड के लेबल वाले किनारे को मजबूती से पकड़ें और इसे साफ़ सतह पर सेट करें, ब्लॉक के साथ पूर्ण संपर्क सुनिश्चित करने के लिए नीचे की ओर कुछ दबाव डालें। कवरस्लिप पूरी तरह से ब्लॉक की सतह पर होना चाहिए। ठंड 10 सेकंड के भीतर होती है और इसे नेत्रहीन रूप से पुष्टि की जा सकती है क्योंकि कवरस्लिप के नीचे नमूना बर्फ में बदल जाता है।
      3. दोनों विधियों के लिए, स्लाइड्स को पूरी तरह से फ्रीज करने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
        नोट: एक बार जमे हुए होने के बाद, स्लाइड्स को तरल नाइट्रोजन में या ब्लॉक पर 15-20 मिनट के लिए छोड़ा जा सकता है, जब तक कि वे जमे हुए रहते हैं। यह क्रैकिंग चरण पर आगे बढ़ने से पहले इस स्तर पर कई स्लाइड एकत्र करने की अनुमति देता है।
    2. जल्दी से काम करते हुए, नमूने से कवरस्लिप को क्रैक करें। यह कदम समय के प्रति संवेदनशील है। कवरस्लिप को हटा दें और नमूना पिघलना शुरू होने से पहले स्लाइड को इथेनॉल में डुबो दें।
      1. जमे हुए स्लाइड को हटा दें (तरल नाइट्रोजन के लिए चिमटी का उपयोग करके)।
      2. स्लाइड के लेबल वाले छोटे किनारे को मजबूती से पकड़ें और बेंच के खिलाफ एक लंबे किनारे को ब्रेस करें।
      3. दूसरे हाथ से, एक रेजर को मजबूती से पकड़ें, और कवरस्लिप को नमूने से दूर और दूर करने के लिए रेजर के किनारे को स्लाइड के नीचे स्लाइड करें। यह चरण थोड़ा आसान है यदि कवरस्लिप को एक कोने के ओवरहैंग (चित्रा 2 सी) के साथ तैनात किया गया है।
  6. आरटी में 95% इथेनॉल युक्त कोप्लिन जार में स्लाइड को तुरंत रखें। इथेनॉल में स्लाइड को कम से कम 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
    नोट: स्लाइड्स को थोड़ी देर के लिए इथेनॉल में छोड़ा जा सकता है-यह वॉश पर आगे बढ़ने से पहले इस चरण में कई स्लाइड एकत्र करने की अनुमति देता है। स्लाइड्स को कई दिनों तक इस चरण पर भी संग्रहीत किया जा सकता है। भंडारण करते समय, इथेनॉल में स्लाइड के कोप्लिन जार को -20 डिग्री सेल्सियस तक ले जाएं।
  7. RT पर 5 मिनट के लिए PBS-T में स्लाइड्स को तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए ताजा PBS-T का उपयोग करें।
  8. यदि एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाता है, तो चरण 3 (एंटीबॉडी धुंधला) पर आगे बढ़ें। यदि क्रोमोसोम की कल्पना करने के लिए केवल DAPI के साथ धुंधला हो जाता है, तो चरण 4 (माउंटिंग और इमेजिंग) पर आगे बढ़ें।

3. एंटीबॉडी धुंधला होना

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    नोट: नए एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त स्थितियों का काम करते समय, फ्लोरोसेंट सिग्नल की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए निम्नलिखित नकारात्मक नियंत्रणों को शामिल करना महत्वपूर्ण है: 1) एक स्लाइड जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी की कमी होती है और केवल द्वितीयक एंटीबॉडी होता है; 2) केवल एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक स्लाइड जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी की कमी होती है। इन नकारात्मक नियंत्रणों में से प्रत्येक को संकेत की पूरी कमी पैदा करनी चाहिए। यदि प्रतिदीप्ति को द्वितीयक एंटीबॉडी-केवल स्लाइड पर पहचाना जाता है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को बढ़ाया जाना चाहिए या एक अलग माध्यमिक का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि प्रतिदीप्ति को प्राथमिक एंटीबॉडी-केवल स्लाइड पर पहचाना जाता है, तो यह ऑटोफ्लोरेसेंस या अन्य संभावित दूषित पदार्थों के कारण होने की संभावना है।
    1. एंटीबॉडी तनुकरण बफर (50 मिलीग्राम बीएसए + 50 μL का 10% सोडियम एज़ाइड + 10 एमएल पीबीएस-टी) में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें - प्रति स्लाइड 20-30 μL का उपयोग करने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
    2. एक आर्द्र कक्ष तैयार करें: नम पेपर तौलिए के साथ एक एयरटाइट ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर के तल को पंक्तिबद्ध करें। पेपर तौलिए के शीर्ष पर ग्लास पाश्चर पिपेट की एक परत बिछाएं। ये पिपेट एक सतह बनाते हैं जो स्लाइड्स को स्तर पर रहने की अनुमति देता है और उन्हें पेपर तौलिए से ऊंचा रखता है।
      नोट: आर्द्र कक्षों के लिए, स्नैप ढक्कन के साथ प्लास्टिक खाद्य भंडारण कंटेनरों का उपयोग करना सबसे अच्छा है, जिससे भीतर स्लाइड को बाधित किए बिना कंटेनर को खोलना और बंद करना आसान हो जाता है। एक की तलाश करें जो पाश्चर पिपेट के लिए काफी लंबा है, लेकिन स्लाइड्स को पूरी तरह से क्षैतिज आराम करने की अनुमति देने के लिए इंडेंटेशन के बिना अपेक्षाकृत सपाट तल भी है।
    3. स्लाइड को अंतिम पीबीएस-टी वॉश से निकालें। नमूने को हर समय गीला रखने और वाष्पीकरण से बचने के लिए इस कदम से जल्दी से काम करें। यदि नमूना सूख जाता है, तो एंटीबॉडी धुंधला नकारात्मक रूप से प्रभावित होगा।
    4. एक कॉम्पैक्ट आयत में मुड़े हुए पोंछने वाले ऊतक का उपयोग करके स्लाइड की पूरी सतह को सुखाएं। स्लाइड के सामने और पीछे पोंछें, लेकिन नमूने के चारों ओर बहुत सारी जगह छोड़ दें। नमूने के पास की सतह को सुखाते समय विशेष ध्यान रखें- नमूने के बहुत करीब जाने से बचें, जो कवरस्लिप के आकार के बारे में एक क्षेत्र छोड़ देता है। हालांकि, सुनिश्चित करें कि नमूने की परिधि अगले चरण के लिए सूखी है।
    5. हाइड्रोफोबिक पीएपी पेन का उपयोग करके नमूने के चारों ओर एक सर्कल खींचें। पूरे नमूना क्षेत्र को संलग्न करने के लिए देखभाल का उपयोग करें, लेकिन स्लाइड की सतह पर दिखाई देने वाले जानवरों के शवों को बाधित करने से बचें। बाधा को पूरी तरह से सूखने की अनुमति देने के लिए ~ 5 सेकंड तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को शामिल करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा आवश्यक है क्योंकि स्लाइड की सतह को पीबीएस-टी में लेपित किया गया है, जिसमें एक डिटर्जेंट होता है। पीएपी पेन सूखी स्लाइड सतह पर सबसे अच्छा काम करता है, इसलिए नमूने के चारों ओर एक सूखी परिधि बनाना महत्वपूर्ण है। नमूने के निकटतम क्षेत्र को छोड़कर इस चरण के दौरान नमूने की रक्षा करता है
    6. जल्दी से काम करते हुए, हाइड्रोफोबिक बैरियर के भीतर नमूने से तरल को दूर करने के लिए मुड़े हुए पोंछने वाले ऊतक के कोने या किनारे का उपयोग करें। जानवरों के शवों को बाधित करने से बचने के लिए ध्यान रखें।
    7. हाइड्रोफोबिक बैरियर द्वारा बनाई गई अंगूठी में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के तुरंत 20 μL को पाइप करें। शवों को बाधित करने से रोकने के लिए धीरे से और एक कोण पर पाइप करने का ध्यान रखें। किसी भी शव पर सीधे पाइपिंग से बचें।
    8. यह सुनिश्चित करने के लिए स्लाइड को धीरे से झुकाएं कि हाइड्रोफोबिक बाधा के भीतर पूरी सतह समाधान द्वारा कवर की गई है।
      नोट: यह सबसे अच्छा है यदि हाइड्रोफोबिक बाधाओं में 1-1.5 सेमी की आंतरिक परिधि होती है, जो एंटीबॉडी समाधान के 20 μL द्वारा पूरी तरह से कवर की जाती है। परिधि की चौड़ाई इस बात पर निर्भर करेगी कि फ्रीज-क्रैक चरण के दौरान शवों को कैसे वितरित किया जाता है। व्यापक बाधाओं के लिए एंटीबॉडी समाधान की उच्च मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। यदि वांछित हो, तो पैराफिल्म के छोटे वर्ग (18 मिमी x 18 मिमी कवरस्लिप के आकार में कटे हुए) को नमूने के शीर्ष पर धीरे से रखा जा सकता है। पैराफिल्म वर्ग यह सुनिश्चित करेगा कि एंटीबॉडी समाधान पूरे नमूने को कवर करता है और वाष्पीकरण को रोकने में भी मदद करेगा।
    9. शेष स्लाइड्स के लिए चरण 3.1.3-3.1.8 दोहराएँ।
    10. स्लाइड्स को सावधानीपूर्वक आर्द्र कक्ष में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि समाधान हाइड्रोफोबिक बाधा के भीतर निहित है और स्लाइड पूरी तरह से स्तर पर आराम कर रहे हैं।
    11. एंटीबॉडी के आधार पर, इस चरण को 6 घंटे तक छोटा किया जा सकता है या आर्द्र कक्ष को ठंडे कमरे या रेफ्रिजरेटर में रखकर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रदर्शन किया जा सकता है।
      नोट: आर्द्र कक्ष और हाइड्रोफोबिक बाधाओं का उपयोग करना आमतौर पर एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पर्याप्त होता है, यहां तक कि लंबे समय तक रात भर ऊष्मायन के लिए भी। हालांकि, यदि वाष्पीकरण एक समस्या साबित होता है, तो पैराफिल्म के छोटे वर्गों को प्रत्येक नमूने पर धीरे से रखा जा सकता है, जो वाष्पीकरण को रोकने में मदद करेगा। इन्हें पहले वॉश स्टेप में हटाया जा सकता है: प्रत्येक स्लाइड को पीबीएस-टी (जिसमें कोई अन्य स्लाइड नहीं है) से भरे कोप्लिन जार में डुबोएं, और पैराफिल्म को नमूने से दूर तैरने की अनुमति दें। अगली स्लाइड से पैराफिल्म को हटाने के लिए उसी जार का उपयोग करने से पहले कोप्लिन जार से पैराफिल्म निकालें।
  2. कोप्लिन जार में ~ 40 एमएल पीबीएस-टी युक्त स्लाइड्स को आरटी पर 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए ताजा पीबीएस-टी का उपयोग करें।
    1. इन धोने के दौरान, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें। प्रति स्लाइड 20-30 μL का उपयोग करने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी करें। एलेक्सा फ्लूर संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करना आम है जो 1: 200 पर पतला होता है।
  3. द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. स्लाइड को अंतिम पीबीएस-टी वॉश से निकालें। नमूने को हर समय गीला रखने और वाष्पीकरण से बचने के लिए इस कदम से जल्दी से काम करें।
    2. मुड़े हुए पोंछने वाले ऊतक का उपयोग करके स्लाइड को सुखाएं। हाइड्रोफोबिक बैरियर द्वारा निहित क्षेत्र को सुखाने से बचें।
    3. जल्दी से काम करते हुए, हाइड्रोफोबिक बैरियर के भीतर नमूने से तरल को दूर करने के लिए मुड़े हुए पोंछने वाले ऊतक के कोने या किनारे का उपयोग करें। जानवरों के शवों को बाधित करने से बचने के लिए ध्यान रखें।
    4. हाइड्रोफोबिक बैरियर द्वारा बनाई गई अंगूठी में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के तुरंत 20 μL को पाइप करें। शवों को बाधित करने से रोकने के लिए धीरे से और एक कोण पर पाइप करने का ध्यान रखें।
    5. किसी भी शव पर सीधे पाइपिंग से बचें। सुनिश्चित करें कि हाइड्रोफोबिक बाधा के भीतर पूरी सतह समाधान द्वारा कवर की गई है। व्यापक बाधा परिधि को एंटीबॉडी समाधान की उच्च मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। यदि वांछित हो, तो नमूने को पैराफिल्म के एक छोटे वर्ग के साथ कवर करें (चरण 3.1.8 के नीचे नोट देखें)।
    6. सावधानीपूर्वक स्लाइड को आर्द्र कक्ष में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि समाधान हाइड्रोफोबिक बाधा के भीतर निहित है और स्लाइड पूरी तरह से स्तर पर आराम कर रही है। स्लाइड को अंधेरे में रखने के लिए आर्द्र कक्ष पर ढक्कन बदलें।
    7. शेष स्लाइड्स के लिए चरण 3.3.1-3.3.6 दोहराएँ।
    8. आरटी पर 4 घंटे के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
      नोट: एंटीबॉडी के आधार पर, इस चरण को 2 घंटे तक छोटा किया जा सकता है या 6 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है। यदि आर्द्र कक्ष अंधेरा नहीं है, तो इसे दराज में रखें या इसे कार्डबोर्ड बॉक्स से कवर करें। वैकल्पिक रूप से, आर्द्र कक्ष को अंधेरे में स्लाइड रखने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जा सकता है।
  4. कोप्लिन जार में ~ 40 एमएल पीबीएस-टी युक्त स्लाइड्स को आरटी पर 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए ताजा पीबीएस-टी का उपयोग करें।

4. माउंटिंग और इमेजिंग

  1. मध्यम + DAPI (2 μg / mL), 18 मिमी x 18 मिमी ग्लास कवरलिप्स, और पहुंच के भीतर नेल पॉलिश करके नमूने को बढ़ाने के लिए तैयार रहें।
  2. स्लाइड को अंतिम धोने से निकालें और मुड़े हुए पोंछने वाले ऊतक का उपयोग करके सुखाएं। हाइड्रोफोबिक बैरियर द्वारा निहित क्षेत्र को सुखाने से बचें।
  3. मुड़े हुए पोंछने वाले ऊतक के कोने का उपयोग करके, बैरियर के अंदर नमूने से तरल को सावधानीपूर्वक दूर करें। इस चरण में अधिकांश तरल को हटा दें, लेकिन शवों को पूरी तरह से सूखने दिए बिना।
  4. जल्दी से काम करते हुए, नमूने में बढ़ते माध्यम के 8 μL जोड़ें। शवों को बाधित करने से रोकने के लिए धीरे से और एक कोण पर पाइप करें। शवों पर सीधे पाइपिंग से बचें।
  5. अभी भी जल्दी से काम करते हुए, सावधानीपूर्वक नमूने पर एक ग्लास कवरस्लिप को कम करें।
    1. हवा के बुलबुले इमेजिंग को बाधित कर सकते हैं और नमूना गिरावट का कारण बन सकते हैं। हवा के बुलबुले को कम करने के लिए, नमूने के बगल में स्लाइड पर कवरस्लिप के एक किनारे को आराम दें, इसलिए इसे नमूने के ऊपर विकर्ण पर रखा जाता है। यह पेंसिल या चिमटी पर कवरस्लिप के उच्च किनारे को आराम करने में मदद कर सकता है। फिर धीरे-धीरे कवरस्लिप के उच्च किनारे को नीचे गिराएं- यह आंदोलन बढ़ते माध्यम को एक किनारे से दूसरे किनारे तक प्रगति करने वाली तरल सील बनाने की अनुमति देता है।
  6. शेष स्लाइड्स के लिए चरण 4.2-4.5 दोहराएँ।
  7. नेल पॉलिश के साथ कवरलिप्स को सील करें। कवरस्लिप (जो नमूने को कुचल देगा) पर दबाव डालने या कवरस्लिप को क्षैतिज रूप से हटाने से बचने के लिए ध्यान रखें (जो नमूने को मल देगा)।
    1. कवरस्लिप (~ 1 मिमी चौड़ा) के प्रत्येक कोने में नेल पॉलिश का एक छोटा बिंदु जोड़ें। ये कवरस्लिप को जगह पर रखने में मदद करेंगे। डॉट्स को पूरी तरह से सूखने दें।
    2. जब कोने पूरी तरह सूख जाएं तो किनारों को नेल पॉलिश से सील कर दें। सुनिश्चित करें कि पॉलिश कवरस्लिप और स्लाइड के बीच के अंतर को पूरी तरह से भर देती है, लेकिन कवरस्लिप को कवर करने से बचें। कवरस्लिप पर 1 मिमी ओवरलैप बनाए रखना सबसे अच्छा है। केवल उतना ही नेल पॉलिश का उपयोग करें जितनी आवश्यकता है। बहुत अधिक उपयोग करने या अतिरिक्त पॉलिश रखने से बचें, जिसे सूखने में लंबा समय लग सकता है और माइक्रोस्कोप उद्देश्य को नुकसान पहुंचाने का खतरा होता है।
      नोट: स्पष्ट के बजाय रंगीन नेल पॉलिश का उपयोग करना बेहतर है, जो सील की सीमा को देखना आसान बनाता है और नेल पॉलिश सीमा के नीचे स्थित इमेजिंग जानवरों को रोकने में मदद करता है।
    3. इमेजिंग से पहले नेल पॉलिश को पूरी तरह से सूखने दें। यह कदम महत्वपूर्ण है, क्योंकि गीली नेल पॉलिश माइक्रोस्कोप उद्देश्यों को गंभीर रूप से नुकसान पहुंचा सकती है।
      नोट: स्लाइड्स को यहां से जितना संभव हो सके अंधेरे में रखा जाना चाहिए। बेंच पर सूखने के दौरान उन्हें कवर करने के लिए एक फ्लैट कार्डबोर्ड बॉक्स का उपयोग करें।
  8. इमेजिंग से पहले 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड्स स्टोर करें। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइड्स को लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. मानक प्रतिदीप्ति यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि।
    1. प्रत्येक स्लाइड के लिए, पहले, डीएपीआई चैनल में 10x पर पूरे नमूने की जांच करें ताकि अच्छी तरह से एक्सट्रूडेड गोनैड्स की पहचान की जा सके और उनके प्लेसमेंट को नोट किया जा सके। अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, किसी भी गोनैड्स की इमेजिंग से बचें जो जानवर के दूसरे हिस्से द्वारा अलग, अपूर्ण या आंशिक रूप से कवर किए गए हैं। अधिकांश जानवरों के लिए, केवल एक गोनाड हाथ पूरी तरह से बाहर निकाला और दिखाई देगा।
      नोट: बाद में अभिविन्यास के लिए उपयोग करने या विशिष्ट नाभिक के स्थान की पहचान करने के लिए डीएपीआई चैनल में पूरे गोनैड के 10x पर कम-आवर्धन छवि लेना सहायक हो सकता है।
    2. आवेदन के आधार पर, छवियों को 40x, 63x, या 100x पर लिया जा सकता है। यदि पूरे गोनैड पर कब्जा करना है, तो अतिव्यापी सीमाओं के साथ एक मोंटेज बनाएं। इमेजिंग करते समय, याद रखें कि गोनाड एक खोखली ट्यूब है, जिसमें नाभिक शीर्ष और नीचे सबसे घने होते हैं।

Representative Results

DAPI डीएनए को दृढ़ता से बांधता है, और इसका धुंधलापन विभिन्न प्रकार की स्थितियों (चित्रा 3 ए, बी) के तहत भी मजबूत है। यह सभी नाभिकों में मौजूद होना चाहिए और इसलिए स्लाइड पर किसी भी कीड़े ऊतक की उपस्थिति और माइक्रोस्कोप पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने की क्षमता के लिए एक प्रभावी सकारात्मक नियंत्रण बनाता है। धुंधला होना तब प्रभावी होता है जब एंटीबॉडी मियोटिक नाभिक (चित्रा 3 ए, बी) के भीतर मौजूद होता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 ए, बी डीएपीआई के साथ सना हुआ मध्य-पचिटेन नाभिक और आरएडी -51 को लक्षित करने वाला एक एंटीबॉडी दिखाता है, जो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के लिए एक मार्कर है। केएलई -2 संघनित का एक घटक है, एक अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जो माइटोसिस और अर्धसूत्रीविभाजन की तैयारी में गुणसूत्रों की संरचना करता है। केएलई -2 / + उत्परिवर्ती में गुणसूत्र संरचना में मामूली दोष होते हैं, जैसा कि थोड़ा अव्यवस्थित डीएपीआई धुंधला होने और आरएडी -51 फॉसी की उच्च संख्या में परिलक्षित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक संख्या में वृद्धि से पता चलता है (चित्रा 3 बी)। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक आम गलती नमूने को बहुत लंबे समय तक फिक्स समाधान में छोड़ना है। ओवर-फिक्सिंग से असफल धुंधलापन हो सकता है क्योंकि यह आमतौर पर एंटीबॉडी को नाभिक में फैलने से रोकता है। इस गलती की पहचान तब की जा सकती है जब एंटीबॉडी गोनैड के साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों में फैल जाती है, लेकिन नाभिक से बाहर रखी जाती है।

जर्मलाइन (चित्रा 1) में, नाभिक डिस्टल टिप पर माइटोटिक रूप से प्रसार करते हैं, संक्रमण क्षेत्र के दौरान अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करते हैं, और डिप्लोटिन और अंत में डायकिनेसिस में प्रवेश करने से पहले पचिटेन (जिसे अक्सर कई नाभिक पंक्तियों द्वारा तीन समान चरणों में विभाजित किया जाता है) के माध्यम से प्रगति करते हैं। डायकिनेसिस में अंडाणुओं को शुक्राणुओं से उनकी निकटता के आधार पर गिना जाता है, जिसमें -1 अंडाणु शुक्राणु के सबसे समीपस्थ होता है, -2 अंडाणु अगला डिस्टल होता है, और इसी तरह। एलिगेंस में छह गुणसूत्र होते हैं , जो डायकिनेसिस नाभिक में कॉम्पैक्ट अंडाकार के रूप में प्रकट होते हैं। इनमें से प्रत्येक एक चियास्मा द्वारा एक साथ रखे गए दो बहन क्रोमैटिड की एक समरूप जोड़ी का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे द्विसंयोजक भी कहा जाता है (चित्रा 3 सी)। म्यूटेंट, जैसे एसपीओ -11, जो क्रॉसओवर गठन को बाधित करते हैं, चियास्माटा बनाने में विफल रहेंगे; इसलिए, डायकिनेसिस नाभिक में 12 अलग-अलग डीएपीआई निकाय (जिसे यूनिवेलेंट भी कहा जाता है), प्रत्येक बहन क्रोमैटिड के लिए एक (चित्रा 3 डी) होगा।

Figure 1
चित्र 1: जर्मलाइन नाभिक को स्थानिक-अस्थायी तरीके से सरणीबद्ध किया जाता है जो अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से उनकी प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। गोनाड और मियोटिक चरणों को डिस्टल टिप (तारांकन) से समीपस्थ क्षेत्र (-1 अंडाणु, एक तीर के साथ इंगित) तक रेखांकित किया गया है, जिसमें शुक्राणु (त्रिकोण) होता है। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (B) DAPI के साथ सना हुआ विच्छेदित हर्मैप्रोडाइट गोनैड की अनुमानित प्रतिदीप्ति छवि। मीओटिक चरणों को निरूपित किया जाता है, जिसमें प्रतिनिधि नाभिक को इनसेट में दिखाया जाता है (सभी इनसेट को एक दूसरे के साथ स्केल करने के लिए दिखाया जाता है)। नाभिक को जर्मलाइन और विशिष्ट गुणसूत्र आकृति विज्ञान में उनके स्थान के आधार पर आसानी से मंचित किया जा सकता है, जो डिस्टल टिप (तारांकन) पर माइटोटिक क्षेत्र से संक्रमण क्षेत्र तक, पचीटेन, डिप्लोटिन और डायकिनेसिस के माध्यम से प्रगति करता है। शुक्राणु को एक त्रिकोण द्वारा चिह्नित किया जाता है। इस आंकड़े को लाइसेंस CC BY 3.028 के तहत हिलर्स एट अल से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: विच्छेदन सेटअप का प्रदर्शन। (A) विच्छेदन के दौरान माइक्रोस्कोप चरण। जानवरों को होल्डिंग स्लाइड पर रखे गए कवरस्लिप पर 4 μL विच्छेदन समाधान में विच्छेदित किया जाता है, जिसका उपयोग कवरस्लिप को दृश्य में स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। आरेख आदर्श सुई प्लेसमेंट दिखाता है। सुइयों को नीचे की ओर एक घुमावदार किनारे के साथ रखा जाता है, जिसे ग्रसनी क्षेत्र के ऊपर पार किया जाता है। गुलाबी तीर सुइयों के लिए कैंची जैसी गति का प्रदर्शन करते हैं। गुलाबी डैश्ड लाइन आदर्श कट स्थान दिखाती है। (बी) विच्छेदित जानवरों की छवियां, एक पूर्ण एक्सट्रूज़न और एक अपूर्ण एक्सट्रूज़न के उदाहरण के साथ। एक्सट्रूडेड गोनाड और हिम्मत के वर्गों को लेबल किया जाता है। (सी) फ्रीज-क्रैक चरण का प्रदर्शन करने वाली छवि। स्लाइड को एक हाथ में मजबूती से रखा जाना चाहिए, कवरस्लिप साइड को शरीर से दूर रखा जाना चाहिए। विपरीत किनारे को बेंच के खिलाफ खड़ा किया गया है। रेजर को दूसरे हाथ में रखा जाना चाहिए। गुलाबी तीर रेजर के लिए स्लाइड से कवरस्लिप को फ्लिक करने के लिए आंदोलन की दिशा को इंगित करता है, जिसमें थोड़ा सा मोड़ होता है कि कवरस्लिप फ्लिक शरीर से दूर हो जाता है। ध्यान दें कि कवरस्लिप को इस तरह रखा गया है कि स्लाइड के लंबे किनारे पर एक कोना लटका हुआ है। (डी) ग्लास भ्रूण धुंधला डिश में विच्छेदन अभ्यास के लिए सेटअप की छवि। जानवरों को विच्छेदन समाधान के 50-200 μL में रखा जाता है, जो वाष्पीकरण की समस्या को नकारता है और विच्छेदन के लिए समय बढ़ाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: जर्मलाइन नाभिक के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति परिणाम । (ए, बी) जेड-स्टैक अनुमान (ए) जंगली प्रकार और (बी) क्ले -2 / + हेटरोजाइगोट्स में आरएडी -51 एंटीबॉडी (हरे) और डीएपीआई (लाल) से सना हुआ लेट पैचिटेन नाभिक। (C, D) (सी) जंगली-प्रकार (छह डीएपीआई धुंधला निकायों के साथ) और (डी) एसपीओ -11 उत्परिवर्ती (12 डीएपीआई धुंधला निकायों के साथ) में डीएपीआई के साथ दाग वाले एकल डायकिनेसिस नाभिक के जेड-स्टैक अनुमान। स्केल पट्टियाँ 5 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यौन प्रजनन के लिए अगुणित युग्मकों के निर्माण की आवश्यकता होती है, जो अर्धसूत्रीविभाजन के विशेष कोशिका विभाजन के माध्यम से उत्पन्न होते हैं। एलिगेंस अपनी ऑप्टिकल पारदर्शिता, सुविधाजनक जर्मलाइन एनाटॉमी और शक्तिशाली आनुवंशिकी28 के कारण अर्धसूत्रीविभाजन के साइटोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बन गया है। प्रयोगशाला या कक्षा में कई सवालों को संबोधित करने के लिए प्रजनन क्षमता और भ्रूण की घातकता का आकलन करने वाले सरल जीव प्रयोगों को आणविक आनुवंशिकी के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, क्योंकि क्रॉसओवर उचित गुणसूत्र अलगाव के लिए आवश्यक हैं, इसलिए उनके गठन या संकल्प को बाधित करने वाली प्रक्रियाएं एन्यूप्लोइड युग्मक उत्पन्न करेंगी। बदले में, एन्यूप्लोइडी अव्यवहार्य संतान की ओर जाता है, जिसे आसानी से संतान की गिनती करके, या भ्रूण की घातकता निर्धारित करने की थोड़ी अधिक जटिल विधि के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। साइटोलॉजिकल रूप से, क्रॉसओवर की कमी डायकिनेसिस के दौरान देखे गए डीएपीआई-धुंधला निकायों की संख्या को प्रभावित करेगी। DAPI धुंधलापन की मजबूती और स्कोरिंग में आसानी इसे साइटोलॉजिकल तकनीकों को सिखाने के लिए एक आदर्श प्रयोग बनाती है। हेर्मैप्रोडाइट जर्मलाइन में नाभिक का अस्थायी-स्थानिक लेआउट समय में एक ही क्षण में अर्धसूत्रीविभाजन के प्रत्येक चरण का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। नाभिक को जर्मलाइन के डिस्टल माइटोटिक छोर से समीपस्थ छोर तक आगे बढ़ने में लगभग 54 घंटे लगते हैं (उदाहरण के लिए, देखें जारामिलो-लैम्बर्ट एट अल.33, स्टैम्पर एट अल.34 और लिबुडा एट अल.35)। मियोटिक प्रगति का यह अच्छी तरह से स्थापित समय पल्स-चेज़ लेबलिंग या डीएनए हानिकारक प्रयोगों की अनुमति देता है।

क्योंकि DAPI धुंधला लगभग हमेशा काम करता है, यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपयोगी तकनीकी नियंत्रण के रूप में कार्य करता है (और माइक्रोस्कोपी-इन-ट्रेनिंग के लिए संतुष्टि प्रदान कर सकता है)। एंटीबॉडी धुंधला अधिक परिवर्तनशील हो सकता है और प्रतिकृति के बीच प्रजनन क्षमता का एक अच्छा उपाय है। सी.एलिगेंस गोनाड को लगातार ठीक करना मुश्किल हो सकता है, क्योंकि इस कदम के लिए क्रोमोसोमल संरचना को संरक्षित करने के बीच संतुलन की आवश्यकता होती है, जबकि पर्याप्त एंटीबॉडी प्रसार की अनुमति भी होती है। फॉर्मलाडेहाइड के साथ फिक्सिंग क्रोमोसोमल आकृति विज्ञान को सबसे अच्छी तरह से संरक्षित करती है, और पैराफॉर्मलडिहाइड एम्प्यूल्स से फॉर्मलाडेहाइड को ताजा तैयार करने से सबसे अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान किए गए हैं। फॉर्मेलिन (37% जलीय फॉर्मलाडेहाइड और मेथनॉल) से तैयार फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करना भी संभव है। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारण शक्ति और समय को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक तरीकों में चरण 2.4 में फॉर्मलाडेहाइड निर्धारण को छोड़ना और फ्रीज-क्रैक के बाद, -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% इथेनॉल में विसर्जन, या 10 मिनट के लिए 100% मेथनॉल में विसर्जन और इसके बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 100% एसीटोन में विसर्जन शामिल है। ये फिक्स स्थितियां बेहतर एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देती हैं लेकिन ऊतक आकृति विज्ञान को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेंगी (क्रोमोसोम फटे हुए और फूले हुए दिखेंगे)।

चरण 2 में उल्लिखित चरणों को विच्छेदन और ठीक करने के लिए समय बहुत महत्वपूर्ण है। क्योंकि विच्छेदन समाधान की मात्रा इतनी कम है, वाष्पीकरण अंतिम फिक्स एकाग्रता को प्रभावित कर सकता है, जिससे परिवर्तनीय एंटीबॉडी धुंधला हो जाएगा। एलिगेंस हैंडलर शुरू (चरण 2.3) से 2 मिनट से भी कम समय में एक स्लाइड तैयार कर सकता है (चरण 2.4)। मुख्य तकनीकी बाधा जानवरों को विच्छेदन समाधान की बूंद में लेने और जल्दी से उन्हें विच्छेदित करने की क्षमता है। बड़ी मात्रा में विच्छेदन करना सीखना आसान हो सकता है। नए प्रशिक्षु पहले जानवरों को कांच के भ्रूण धुंधला डिश (चित्रा 2 डी) में विच्छेदन समाधान के 50-200 μL में चुनकर शुरू करते हैं; व्यापक सतह अच्छे गोनैड एक्सट्रूज़न के लिए एक आदर्श सुई की स्थिति की पहचान करते समय पैंतरेबाज़ी करने के लिए अधिक जगह प्रदान करती है, जबकि तरल की बड़ी मात्रा वाष्पीकरण को एक समस्या से कम बनाती है। एक बार विच्छेदन की गति के साथ सहज होने के बाद, प्रशिक्षु डिश में केवल 50 μL का उपयोग करके विच्छेदन शुरू करते हैं, फिर स्लाइड पर 20 μL में विच्छेदन पर स्विच करते हैं। एक बार स्लाइड पर विच्छेदन करने के बाद, प्रशिक्षु जल्दी से समाधान की मात्रा को कम करना शुरू कर सकते हैं जब तक कि वे वाष्पीकरण को नगण्य बनाने के लिए 4 μL में काम करने में पर्याप्त तेज न हों।

यदि विच्छेदन का समय एक मुद्दा बना रहता है, तो प्रशिक्षु चरण 2.3 के दौरान विच्छेदन समाधान के 8 μL में विच्छेदन कर सकते हैं। फिर, चरण 2.4 के दौरान, वे फिक्स समाधान के 8 μL जोड़ सकते हैं, धीरे-धीरे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए पाइप कर सकते हैं (यह सुनिश्चित करने के लिए बारीकी से देख रहे हैं कि शव बाधित या दूर नहीं हैं), और मिश्रित घोल से 8 μL हटा सकते हैं। इस वैकल्पिक दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप 8 μL की एक ही अंतिम मात्रा और एक ही अंतिम फिक्स एकाग्रता होगी; यह मात्रा यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चरण 2.5 में फ्रीज-क्रैक के दौरान शव कवरस्लिप और स्लाइड सतह दोनों से संपर्क करते हैं। यदि प्रत्येक स्लाइड को तैयार करने का समय बड़े विच्छेदन खंडों में भी एक मुद्दा बना हुआ है, तो जर्मलाइन इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए एक निलंबन विधि गेर्वाइस और अरूर26 द्वारा वर्णित है।

सीटू में प्रोटीन की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने की प्रमुख सीमा एक विशेष प्रोटीन को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की उपलब्धता है। हालांकि, अगर प्रोटीन का टैग किया गया संस्करण इंजीनियर किया गया है, तो इस प्रोटोकॉल को प्रोटीन टैग की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फ्लैग, एचए, या जीएफपी जैसे सामान्य टैग को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी आमतौर पर उपलब्ध होते हैं। जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट टैग को अक्सर निर्धारण चरणों द्वारा बुझाया जा सकता है, इसलिए देशी प्रतिदीप्ति संकेत पर भरोसा करने के बजाय जीएफपी को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि यह एक ही समय सीमा के भीतर जर्मलाइन को पकड़ता है (हालांकि ओजेनेसिस के सभी चरणों को जर्मलाइन के भीतर दर्शाया जाएगा)। इसलिए, यह तकनीक गतिशील परिवर्तनों को याद कर सकती है जो ओजेनेसिस के माध्यम से अंडाणु की प्रगति के रूप में हो सकते हैं। हालांकि, सी एलिगेंस में गैमेटोजेनेसिस के समय का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है; एक जंगली प्रकार के युवा वयस्क में, एक अंडाणु को जर्मलाइन (माइटोटिक ज़ोन) के बाहर के सिरे से डायकिनेसिस33 तक प्रगति करने में लगभग 60 घंटे लगते हैं। इसलिए, एक पल्स चेज़ या विकिरण जैसे विशिष्ट हस्तक्षेप के बाद एक टाइम कोर्स अर्धसूत्रीविभाजन के विभिन्न चरणों में प्रभावों के अवलोकन की अनुमति देगा।

अंत में, यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस गोनाड विच्छेदन का वर्णन करता है जिसके बाद डीएपीआई और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एंटीबॉडी धुंधला होता है। उत्पन्न स्लाइडों की संख्या के आधार पर विच्छेदन और फिक्सिंग (चरण 2) में 60-90 मिनट लगते हैं। एंटीबॉडी धुंधला (चरण 3) ज्यादातर हाथों से बंद होता है और एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय के आधार पर कम से कम 7 घंटे से 1.5 दिनों तक हो सकता है। माउंटिंग (चरण 4.1-4.7) में लगभग 15 मिनट लगते हैं। जर्मलाइन क्रोमोसोम और गोनैड की कल्पना करने के लिए इस सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग किसी भी प्रोटीन के साइटोलॉजिकल अध्ययन के लिए किया जा सकता है यदि एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट टैग अभिकर्मक मौजूद है। अपने सरलतम रूप में, डायकिनेसिस नाभिक के DAPI धुंधला होने का उपयोग मायोटिक पुनर्संयोजन को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच के लिए किया जा सकता है। जब संतान संख्या, पुरुषों की घटनाओं (हिम फेनोटाइप), और भ्रूण की घातकता के जीव विश्लेषण के साथ जोड़ा जाता है, तो यह साइटोलॉजिकल दृष्टिकोण जनसंख्या-आधारित विश्लेषणों के लिए एक एकल-कोशिका काउंटरपॉइंट प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है। इस पांडुलिपि की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है। यह आवश्यक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान या राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Acknowledgments

ली लैब में काम को राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या 1R15GM144861 के तहत और राष्ट्रीय बाल और मानव विकास संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या 1R15HD104115 के तहत समर्थित किया गया था, दोनों राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान। डीए को यूएमएल कैनेडी कॉलेज ऑफ साइंसेज साइंस स्कॉलर्स प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। एनडब्ल्यू को एक यूएमएल ऑनर्स कॉलेज फैलोशिप और एक यूएमएलएसएएमपी फैलोशिप (अनुदान संख्या एचआरडी -1712771 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित) द्वारा समर्थित किया गया था। हम आरएडी -51 एंटीबॉडी के लिए ए गार्टनर को धन्यवाद देते हैं। एलिगेंस उपभेदों को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे पुरस्कार संख्या पी 40 ओडी010440 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रमों के कार्यालय द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody Molecular Probes 711-545-152
Aluminum heating/cooling block Millipore Sigma Z743497
Bacto Peptone Gibco DF0118 17 0
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches Fisherbrand 13 678 20B Used to make worm picks
BSA, Bovine Serum Albumin VWR 97061 420
C. elegans wild type (ancestral) Caenorhabditis Genetics Center N2 (ancestral)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants Caenorhabditis Genetics Center VC768 The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants.
C. elegans spo-11 (me44) mutants Caenorhabditis Genetics Center TY4342 The full genotype of this strains is: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants.
Calcium Chloride Anhydrous VWR 97062 590
Cholesterol Sigma Aldrich 501848300
DAPI Life Technologies D1306
EDTA, Disodium Dihydrate Salt Apex Bioresearch Products 20 147
Embryo Dish, glass, 30mm cavity Electron Microscopy Services 100492-980 Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic
Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
Food storage container, plastic various n/a Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred
Glass Coplin Jar DWK Life Sciences Wheaton 08-813E
Hydrophobic Barrier PAP Pen ImmEdge NC9545623
Kimwipes Kimtech Science 06 666A
Levamisole Hydrochloride Sigma Aldrich L0380000
Magnesium Sulfate Anhydrous Fisher Chemical M65 500
Needles, Single-use, 25 G BD PrecisionGlide 14 821 13D blue, 1 inch
NGM Agar, Granulated Apex Bioresearch Products 20 249NGM
Parafilm Bemis 16 101
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 50 980 487
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) Fisher BioReagents BP399500
Petri Dishes, 60-mm Tritech Research NC9321999 Non-vented, sharp edge
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) Tritech Research PT 9010 Used to make worm picks
Potassium Chloride Fisher BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH Chemicals BDH9266 500G
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH Chemicals BDH9268 500G
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm Fisherbrand 12-548-AP 0.13–0.17 mm thickness
Razor Blades, Single Edge VWR 55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant Molecular Probes S36937 Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging.
Sodium Azide Fisher BioReagents BP922I 500
Sodium Chloride Fisher Chemical S271 500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Sigma Aldrich 7558 79 4
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate Sigma Aldrich S9390
Styrofoam box various n/a Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 22 037 246
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 500
Tryptone Apex Bioresearch Products 20 251
Tween 20 Fisher Chemical BP337 500
Yeast Extract Apex Bioresearch Products 20 254

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References

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आनुवंशिकी अंक 187
<em>सी. एलिगेंस</em> इम्यूनोफ्लोरेसेंस और डीएपीआई धुंधला होने के लिए गोनैड विच्छेदन और फ्रीज क्रैक
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Ananthaswamy, D., Croft, J. C., Woozencroft, N., Lee, T. W. C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining. J. Vis. Exp. (187), e64204, doi:10.3791/64204 (2022).

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