Summary
Den nuværende protokol bruger en biomolekylær simuleringspakke og beskriver den molekylære dynamik (MD) tilgang til modellering af vildtype-caspase og dens mutantformer. MD-metoden gør det muligt at vurdere den dynamiske udvikling af caspasestrukturen og den potentielle virkning af mutationer eller posttranslationelle modifikationer.
Abstract
Apoptose er en type programmeret celledød, der eliminerer beskadigede celler og styrer udviklingen og vævshomeostase af flercellede organismer. Caspases, en familie af cysteinproteaser, spiller en nøglerolle i apoptoseinitiering og udførelse. Modningen af caspaser og deres aktivitet finjusteres ved posttranslationelle modifikationer på en meget dynamisk måde. For at vurdere effekten af posttranslationelle ændringer muteres potentielle steder rutinemæssigt med restkoncentrationer, der er vedholdende for eventuelle ændringer. For eksempel erstattes serinresten med alanin eller asparaginsyre. Sådanne substitutioner kan imidlertid ændre det caspaseaktive steds konformation, hvilket fører til forstyrrelser i katalytisk aktivitet og cellulære funktioner. Desuden kan mutationer af andre aminosyrerester placeret i kritiske positioner også bryde caspasernes struktur og funktioner og føre til apoptoseforstyrrelse. For at undgå vanskelighederne ved at anvende muterede rester kan molekylære modelleringsmetoder let anvendes til at estimere den potentielle virkning af aminosyresubstitutioner på caspasestruktur. Den nuværende protokol tillader modellering af både vildtype-caspase og dens mutantformer med den biomolekylære simuleringspakke (Amber) og supercomputerfaciliteter for at teste effekten af mutationer på proteinstrukturen og funktionen.
Introduction
Apoptose er en af de mest studerede cellulære processer, der regulerer morfogenese og vævshomeostase af flercellede organismer. Apoptose kan initieres af en bred vifte af eksterne eller interne stimuli, såsom aktivering af dødsreceptorer, forstyrrelse i cellecyklussignalerne, DNA-skade, endoplasmatisk retikulum (ER) stress og forskellige bakterielle og virale infektioner1. Caspaserne - nøgle apoptotiske spillere - er traditionelt klassificeret i to grupper: initiativtagere (caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10) og effektorer (caspase-3, caspase-6 og caspase-7), afhængigt af deres domænestruktur og stedet i caspase-kaskaden 2,3. Ved celledødssignaler interagerer initiatorcaspaserne med adaptermolekyler, der letter nærhedsinduceret dimerisering og autoprocessing for at danne et aktivt enzym. Effektorcaspaserne aktiveres gennem spaltning af initiator-caspaser og udfører nedstrøms udførelsestrin ved at spalte flere cellulære substrater4.
Modningen og funktionen af initiator- og effektorcaspaerne reguleres af et stort antal forskellige intracellulære mekanismer, blandt hvilke den posttranslationelle modifikation spiller en uundværlig rolle i celledødsmodulation5. Tilsætningen af modificerende grupper (phosphorylering, nitrosylering, methylering eller acetylering) eller proteiner (ubiquitination eller SUMOylation) ændrer den enzymatiske aktivitet af caspaser eller proteinkonformationen og stabiliteten, der regulerer apoptose. Site-rettet mutagenese anvendes bredt til at undersøge de potentielle posttranslationelle modifikationssteder og skelne deres rolle. Et formodet modifikationssted erstattes normalt af en anden aminosyre, som ikke kan ændres yderligere. Således muteres potentielt phosphoryleret serin og threonin til alanin, og lysinubiquitineringssteder erstattes med arginin. En anden strategi omfatter erstatning af en aminosyre, der især efterligner posttranslationel modifikation (f.eks. er glutamat og aspartat blevet brugt til at efterligne phosphoryleret serin eller threonin)6. Imidlertid kan nogle af disse substitutioner placeret i nærheden af et aktivt sted eller i kritiske positioner ændre caspasestruktur, forstyrre katalytisk aktivitet og undertrykke apoptotisk celledød7. Lignende virkninger kunne observeres i tilfælde af tumorassocierede missense-mutationer i caspase-gener. For eksempel resulterede den tumorassocierede mutation af caspase-6 - R259H - i konformationsændringer af sløjfer i substratbindingslommen, hvilket reducerede den effektive katalytiske omsætning af substrater8. G325A-aminosyresubstitutionen i caspase-8 identificeret i pladecellecarcinom i hoved og hals kunne hæmme caspase-8-aktivitet, hvilket førte til modulering af nuklear faktor-kB (NF-kB) signalering og fremmet tumorigenese9.
For at vurdere den potentielle virkning af aminosyresubstitutioner på caspasestruktur og funktion kan molekylær modellering anvendes. Den molekylære dynamik (MD) tilgang er beskrevet i dette arbejde til modellering af vildtype caspase og dens mutante former ved hjælp af den biomolekylære simuleringspakke (Amber). MD-metoden giver et billede af den dynamiske udvikling af proteinstrukturen efter introduktionen af mutationer. Amber -pakken blev oprindeligt udviklet af Peter Kollmans gruppe og blev et af de mest populære softwareværktøjer til biomolekylære simuleringer10,11,12,13. Denne software er opdelt i to dele: (1) AmberTools, en samling af programmer, der rutinemæssigt anvendes til systemforberedelse (atomtypetildeling, tilsætning af hydrogener og eksplicitte vandmolekyler osv.) og baneanalyse; og (2) Amber, som er centreret omkring pmemd-simuleringsprogrammet. AmberTools er en gratis pakke (og en forudsætning for at installere Amber selv), mens Amber distribueres med en separat licens- og gebyrstruktur. Parallelle simuleringer på en supercomputer og/eller ved hjælp af grafikbehandlingsenheder (GPU'er) kan i væsentlig grad forbedre ydeevnen for den videnskabelige forskning i proteinstrukturdynamik14. De nyeste tilgængelige softwareversioner er AmberTools21 og Amber20, men de beskrevne protokoller kan også bruges med de tidligere versioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af systemet
BEMÆRK: De molekylære modeller af de oprindelige og mutante proteinformer er bygget baseret på en passende krystalstruktur opnået fra Protein Data Bank15,16.
- For at hente den valgte PDB-struktur skal du bruge rullelisten Download filer og klikke på PDB-format. Fjern bemærkninger og forbindelsesdata, og indsæt et TER-kort mellem separate proteinkæder i PDB-filen. Indstil eventuelt protoneringstilstanden for histidinrester ved at erstatte restnavnet HIS med HIE, HID eller HIP (supplerende fil 1).
BEMÆRK: Det er rimeligt ikke at fjerne krystallografisk opløste vandmolekyler (hvis de findes i PDB-filen). - For at forberede startmodellen skal du starte tleap-programmet (AmberTools-pakken) og derefter indtaste kommandoer, der manipulerer tleap-objekter .
- Start programmet: tleap. Indlæs ff14SB-kraftfeltet for at beskrive proteinet med molekylær mekanik: > kilde leaprc.protein.ff14SB.
- Belastningskraftfelter for vandmolekyler og atomioner (Na +, Cl-): > kilde leaprc.water.tip3p.
- Indlæs PDB-filen og byg koordinater for hydrogener, hvilket skaber et objekt ved navn mol: > mol = loadpdb-protein.pdb.
- Kontroller for interne uoverensstemmelser, der kan forårsage problemer: > kontrollere mol.
BEMÆRK: Disulfidbroer, hvis de findes, skal specificeres manuelt. Erstat navnene på kovalent bundne cysteiner CYS med CYX, og skriv følgende kommando i tleap for at skabe en binding mellem SG-atomer: bindings mol.X.SG mol.Y.SG (X og Y er cysteinrestnumre). - Opret en opløsningsmiddelkasse omkring proteinet (TIP3P vand, 12 Å afstand): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
- Kontroller den samlede ladning: > oplad mol, og tilføj tællere (Na + eller Cl-) for at neutralisere systemet:
> addions mol Na+ 0. - Opret topologi prmtop-filen og koordinatinpcrd-filen (input til kørsel af en simulering): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Afslut tleap-programmet: > afslut.
BEMÆRK: Koordinatfiler i gult format kan let konverteres til PDB-format ved hjælp af ambpdb-værktøjet (se brugervejledningen, se Materialetabel).
2. Energiminimering
BEMÆRK: Energiminimering er nødvendig for at fjerne eventuelle dårlige kontakter og overlapninger mellem atomer i startsystemet, der fører til ustabilitet, når MD køres.
- Udfør den første fase af energiminimeringen (2.500 trin i den stejleste nedstigningsalgoritme + 2.500 trin i den konjugerede gradientalgoritme) for at optimere positionerne for tilsatte hydrogenatomer og vandmolekyler, samtidig med at proteinkoordinaterne holdes fastgjort af positionsbegrænsninger på tunge atomer.
- Kør pmemd-programmet som følger:
pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
-r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd. - Følg de krævede argumenter: -i FILE kontroldata; -p FILE molekylær topologi, kraftfeltparametre, atomnavne; -c FILE indledende koordinater; -o FILE brugerlæsbar log output; -r FILE endelige koordinater; -ref FILE referencekoordinater for positionsbegrænsninger.
- Angiv indstillinger i inputfilen min1.in:
&cntrl
imin = 1, maxcyc = 5000, ncyc = 2500,
cut=10,0, ntb=1,
ntc=1, ntf=1,
ntpr=10,
NTR = 1,
fastholdelsesmaske =': 1-517 & !@H=',
restraint_wt=2,0
/
BEMÆRK: Inputindstillinger: imin = 1 udfører minimering; maxcyc = 5000 maksimalt antal minimeringscyklusser; Ncyc = 2500 minimeringsmetode skiftes fra stejleste nedstigning til konjugeret gradient efter NCYC-cyklusser ; cut=10,0 ikke-bundet cutoff (Å); NTB = 1 periodiske grænser pålægges, konstant volumen; NTC = 1 ingen begrænsninger anvendes på bindingslængder (for bedre energikonvergens); ntf = 1 alle interaktioner beregnes; NTPR = 10 Energiinformation udskrives til OUT-filen hvert NTPR-trin ; NTR = 1 flag til fastholdelse af specificerede atomer ved hjælp af et harmonisk potentiale; restraintmask=':1-517 & !@H=' angiver tilbageholdte atomer; restraint_wt=2,0 vægt (kcal/mol∙Å2) for positionsfastholdelser.
- Kør pmemd-programmet som følger:
- Udfør anden fase af energiminimeringen (5.000 stejleste nedstigningstrin + 5.000 konjugerede gradienttrin) uden begrænsninger for at optimere hele systemet.
- Brug min2.in og protein_min1.rst som input: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
-c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst. - Angiv indstillinger i inputfilen min2.in:
&cntrl
imin = 1, maxcyc = 10000, ncyc = 5000,
cut=10,0, ntb=1,
ntc=1, ntf=1,
NTPR = 10
/
- Brug min2.in og protein_min1.rst som input: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
3. Opvarmning
BEMÆRK: Dette trin sigter mod at opvarme systemet fra 0 K til 300 K. Indledende hastigheder tildeles atomer, da startmodellen baseret på PDB-filen ikke indeholder hastighedsoplysninger.
- Udfør opvarmningsprocessen med positionsbegrænsninger på proteinatomerne (50 ps, konstant volumen).
- Brug heat.in og protein_min2.rst som input: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
-c protein_min2.rst -o protein_heat.out
-r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst - Følg de krævede argumenter: -x FILE koordinatsæt gemt over MD-bane.
- Angiv indstillinger i inputfilen heat.in:
&cntrl
imin = 0, irest = 0, ntx = 1,
nstlim=25000, dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
cut=10,0, ntb=1,
NTPR = 500, NTTWX = 500,
NTT = 3, gamma_ln = 2,0,
tempi = 0,0, temp0 = 300,0,
NTR = 1, fastholdelsesmaske = ': 1-517',
restraint_wt=1,0,
NMRopt =1
/
&wt TYPE='TEMP0',
istep1=0, istep2=25000,
værdi1=0,1, værdi2=300,0 /
&wt TYPE ='SLUT' /
BEMÆRK: Input muligheder: imin = 0 kør MD; irest = 0 køre en ny simulering; ntx=1 ingen starthastigheder læses fra rst-filen ; nstlim = 25000 antal MD-trin; dt = 0,002 tidstrin (ps); ntc = 2-bindinger , der involverer hydrogen, begrænses ved hjælp af SHAKE-algoritmen; NTF = 2 kræfter for de begrænsede bindinger beregnes ikke; ntwx = 500 koordinater skrives til mdcrd-filen hvert ntwx-trin ; NTT = 3 Langevin temperaturregulering; gamma_ln=2,0 kollisionsfrekvens for Langevin-dynamik (ps-1); tempi = 0,0 indledende temperatur; temp0 = 300,0 referencetemperatur; nmropt=1 parametre, der er angivet i en &wt-navneliste , læses; TYPE='TEMP0' varierer måltemperaturen.
- Brug heat.in og protein_min2.rst som input: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
4. Ligevægt
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at justere vandets densitet og opnå proteinets ligevægtstilstand.
- Udfør ækvilibreringen ved 300 K uden begrænsninger (500 ps, konstant tryk).
- Brug equil.in og protein_heat.rst som input: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
-c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd. - Angiv indstillinger i inputfilen equil.in:
&cntrl
imin = 0, irest = 1, ntx = 5,
nstlim = 250000,
dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
cut=10,0, ntb=2, ntp=1, taup=2,0,
ntpr = 1000, ntwx = 1000, ntwr = 50000,
NTT = 3, gamma_ln = 2,0,
temp0=300,0
/
BEMÆRK: Inputindstillinger: irest = 1 genstart simuleringen; NTX=5 koordinater og hastigheder læses fra en tidligere genereret RST-fil ; NTB = 2 periodiske grænser pålægges, konstant tryk; NTP = 1 isotrop trykskalering; taup = 2,0 trykafslapningstid (ps); ntwr = 50000 Hvert ntwr-trin skrives den første fil, hvilket sikrer genopretning fra et nedbrud.
- Brug equil.in og protein_heat.rst som input: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
5. Produktionsdynamik
- Efter at ligevægten er opnået, udføres en produktions-MD-simulering (10 ns eller længere) ved konstant tryk og genererer banefilen til efterfølgende analyse af proteinstrukturen.
- Brug prod.in og protein_equil.rst som input: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
-c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd. - Angiv indstillinger i inputfilen prod.in:
&cntrl
imin = 0, irest = 1, ntx = 5,
nstlim=5000000,
dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
cut=10,0, ntb=2, ntp=1, taup=2,0,
ntpr = 1000, ntwx = 1000, ntwr = 50000,
NTT = 3, gamma_ln = 2,0,
temp0=300,0, ig=-1
/
BEMÆRK: Den parallelle version af pmemd (pmemd. MPI) eller GPU-accelereret version (pmemd.cuda) kan bruges på computerklynger og supercomputere. En lang MD-simulering kan opdeles i flere segmenter og udføres sekventielt. Det anbefales kraftigt at indstille ig = -1 (tilfældig frøindstilling) for hver simuleringsgenstart. Ptraj - eller cpppttrav-programmerne kan bruges til analyse og behandling af koordinatbaner. Du kan finde flere oplysninger i brugervejledningen til softwaren.
- Brug prod.in og protein_equil.rst som input: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuværende protokol kan let anvendes i undersøgelser af posttranslationel modifikation af caspaser eller patogene mutationer. I dette afsnit er MD-modelleringsarbejdsgangen illustreret (figur 1), som med succes er blevet brugt i undersøgelsen af caspase-27. Ved hjælp af in vitro-stedsrettet mutagenese af potentielle phosphoryleringssteder (Ser/Thr til Ala) og biokemiske tilgange blev det påvist, at Ser384Ala-mutationen forhindrede caspase-2-behandling og blokerede enzymatisk aktivitet og induktion af apoptotisk celledød (supplerende figur 1). Hverken massespektrometrianalyse eller Phos-Tag-teknologi bekræftede imidlertid, at Ser384 gennemgår fosforylering7. For at forstå, hvordan Ser384 regulerer caspase-2-aktivitet, blev MD-modellering af den tredimensionelle proteinstruktur udført (figur 1).
De molekylære modeller af vildtype og mutante former for caspase-2 blev konstrueret ved hjælp af 1pyo-krystalstrukturen (tilgængelige caspase-2-strukturer er anført i supplerende tabel 1). Ser384Ala-mutanten blev skabt ved at fjerne O-γ-atomet i Ser384-resten (i PDB skelnes Ser- og Ala-rester ved at haveO-γ-atomet). Hydrogenkoordinater er normalt fraværende i krystalstrukturer. Derfor blev hydrogenatomer tilsat til proteinstrukturen, og derefter blev det opløst af 12 Å tykt lag TIP3P-vand for at muliggøre yderligere eksplicitte opløsningsmiddelsimuleringer. Natriumioner blev tilsat for at neutralisere systemet. De opnåede startmodeller af caspase-2 blev udsat for energiminimering, ækvilibrering og efterfølgende 10 ns MD-simulering i henhold til MD-modelleringsprotokollen ved hjælp af datafilerne min1.in, min2.in, heat.in, equil.in og prod.in kontroldata.
I krystalstrukturen af caspase-2 er Ser384 sammen med Arg219 og Arg378 involveret i dannelsen af hulrummets overflade på det aktive sted. Arg219 og Arg378 danner hydrogenbindinger med substratets carboxylgruppe, mens Ser384 ikke intervenerer i direkte interaktioner med substratet. MD-simuleringer bekræftede, at Ser384Ala-substitutionen ikke påvirkede de katalytiske rester Cys320 (nukleofil) og His277 (generel base), men inducerede en større konformationsændring i Arg378. Dens guanidiniumgruppe vendte sig mod bulkopløsningsmidlet, såledesat N ε atomet ikke kunne danne en essentiel hydrogenbinding med substratets carboxylgruppe (figur 1). I det indfødte enzym forekommer en elektrostatisk interaktion mellem Oγ atomet i Ser384 (delvis negativ ladning) og Arg378 guanidiniumgruppen (positiv ladning). Imidlertid forstyrrer serinsubstitutionen tilsyneladende denne interaktion. Det blev således vist, at Ser384Ala-substitutionen påvirkede substratgenkendelsen af argininresterne i caspase-2-det aktive sted, hvilket forringede enzymatisk aktivitet og evnen til at udløse apoptotisk celledød. Den opdagede mekanisme synes evolutionært bevaret og almindelig for andre caspase familiemedlemmer. Således tillod implementeringen af MD-simuleringer at bekræfte de biokemiske resultater og opnå ny indsigt i den molekylære struktur af det aktive center for caspaser.
Figur 1: MD modellering workflow bruges til at studere caspase strukturen. Vildtypen caspase-2 og dens Ser384Ala-mutant blev undersøgt efter instruktionerne i protokolafsnittet. Det blev afsløret, at Ser384Ala-substitutionen inducerer en vigtig konformationsændring i den aktive restkoncentration Arg378. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Funktion af caspase-2 i celledød. Som reaktion på ydre og iboende stimuli kan vildtype caspase-2 aktiveres ved hjælp af en autoproteolytisk mekanisme. Aktiv caspase-2 spalter Bid, som igen fremmer mitokondrie ydre membranpermeabilisering og apoptotisk celledød. Ser384Ala-mutationen forhindrer caspase-2-aktivering og induktion af celledød. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Caspase-2-strukturer til rådighed i proteindatabanken. Strukturerne er sorteret efter udgivelsesdato. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Forskellige trin i redigering af en PDB-fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne MD-tilgang gør det muligt at modellere både vildtype og mutante former for caspase ved hjælp af de biomolekylære simuleringspakker. Flere vigtige spørgsmål om metoden diskuteres her. For det første skal en repræsentativ krystalstruktur af caspase vælges fra proteindatabanken. Det er vigtigt, at både monomere og dimeriske former for caspase er acceptable. Det er en god idé at vælge strukturer med høj opløsning med et minimum af manglende rester. Protonationstilstanden for nogle rester kan indstilles manuelt i input PDB-filen. For eksempel blev et hydrogenatom i figur 1 bundet til Nε2-atomet (HIE-formen) af den katalytiske rest His277. For det andet skal der oprettes en opløsningsmiddelkasse omkring proteinet til yderligere eksplicitte opløsningsmiddelsimuleringer. Energiminimering er nødvendig for at optimere koordinaterne for tilsatte hydrogenatomer og vandmolekyler. For det tredje skal opvarmningen og ligevægten udføres inden simuleringen af produktionsdynamikken. På opvarmningsstadiet skal man sikre sig, at hulrummene og bindingslommerne på proteinoverfladen fyldes op med vandmolekyler (om nødvendigt kan man øge antallet af MD-trin). På ligevægtsstadiet skal erhvervelsen af ligevægtskonformationen af proteinet bekræftes ved at analysere den rod-middel-kvadratiske afvigelse af dets rygradatomer fra de oprindelige positioner12. For det fjerde er det nødvendigt at overvåge konformationsændringerne i proteinstrukturen under simuleringen af produktionsdynamikken. Til dette formål skal man overlejre banerammer på startstrukturen ved at montere rygradatomerne og derefter analysere konformationsændringerne ved hjælp af et molekylært visualiseringsværktøj (VMD, PyMol osv.) 17. Om nødvendigt kan man øge antallet af MD-trin og / eller opdele simuleringen i flere segmenter udført sekventielt. For det femte anbefales det at bruge den GPU-accelererede version af MD-simuleringsprogrammet (pmemd.cuda), hvis ydeevne væsentligt overstiger det, der kan opnås ved den traditionelle CPU-implementering14,18.
En mulig begrænsning af den beskrevne metode er tilgængeligheden af visse caspasestrukturer i proteindatabanken. Imidlertid findes mere end 900 PDB-poster under "caspase" -anmodningen, hvilket indikerer, at caspase-strukturer er blevet undersøgt i detaljer. Nogle vanskeligheder kan opstå, når en krystalstruktur opnås ved lav opløsning (dvs. på et groft detaljeringsniveau) eller mangler nogle fragmenter, der er vigtige for caspase-funktionen.
Sammenfattende har MD-modelleringsmetoder vist sig effektive til at forudsige strukturelle ændringer af proteiner efter mutationer af deres gener, modifikationer eller intermolekylære interaktioner. Anvendelsen af MD-simulering inden for celledød åbner store muligheder for at studere de molekylære mekanismer for caspaseregulering ved posttranslationelle modifikationer. I denne henseende kunne langsigtet MD-simulering vurdere den dynamiske opførsel af funktionelle regioner og den potentielle virkning af aminosyresubstitutioner for at belyse de molekylære årsager forbundet med muteret eller modificeret caspase-2 såvel som andre caspaser. For eksempel blev missense-mutationer af initiator-caspasegener (caspase-2/caspase-8/caspase-9/caspase-10) påvist i gastrointestinale kræftformer og i tumorer i det centrale og perifere nervesystem19. Sammen er MD-modellering af caspaser en stærk in silico-tilgang til forståelse af de mekanismer, der regulerer programmeret celledød og tilhørende lidelser og til udvikling af nye effektive terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Russian Science Foundation (17-75-20102, protokoludviklingen). Eksperimenter beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater (analyse af fosforylering) blev støttet af Stockholm (181301) og svenske (190345) Cancer Societies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. AMBER 2020. , University of California, San Francisco. (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
