Summary

הפרדת תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בדגימות דם היקפיות מילדים עם מונונוקלאוזיס זיהומית

Published: September 07, 2022
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי הרג טבעיים). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר ולנתח תאים מגנטיים ובעלי תווית פלואורסצנטית.

Abstract

מונונוקלאוזיס זיהומית (IM) היא תסמונת חריפה הקשורה בעיקר לזיהום ראשוני בנגיף אפשטיין-בר (EBV). הסימפטומים הקליניים העיקריים כוללים חום לא סדיר, לימפדנופתיה, ועלייה משמעותית בלימפוציטים בדם היקפי. המנגנון הפתוגני של IM עדיין לא ברור; אין שיטה טיפולית יעילה עבורו, כאשר קיימים בעיקר טיפולים סימפטומטיים. השאלה העיקרית ב- EBV אימונוביולוגיה היא מדוע רק תת-קבוצה קטנה של אנשים נגועים מראה תסמינים קליניים חמורים ואף לפתח ממאירויות הקשורות ל- EBV, בעוד שרוב האנשים הם אסימפטומטיים לכל החיים עם הנגיף.

תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. תאי הרג טבעי (NK) הם לימפוציטים מולדים ציטוטוקסיים החשובים להריגת תאים נגועים ב-EBV. חלקם של תאי CD4+ T פוחת בעוד זה של תאי CD8+ T מתרחב באופן דרמטי במהלך זיהום EBV חריף, וההתמדה של תאי CD8+ T חשובה לשליטה לכל החיים ב- IM. תאי מערכת החיסון האלה ממלאים תפקידים חשובים בהודעות מיידיות, ויש לזהות את תפקודם בנפרד. לשם כך, מונוציטים מופרדים תחילה מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) של אנשים עם הודעות מיידיות באמצעות מיקרובי CD14, עמודה ומפריד מגנטי.

יתר ה-PBMCs מוכתמים בחלבון פרידינין-כלורופיל (PerCP)/ציאנין 5.5 אנטי-CD3, אלופיקוציאנין (APC)/ציאנין 7 אנטי-CD4, פיקואריתרין (PE) אנטי-CD8, פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) אנטי-CD19, APC אנטי-CD56 ונוגדנים APC נגד CD16 למיון תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK באמצעות ציטומטר זרימה. יתר על כן, ריצוף תעתיק של חמש תת-אוכלוסיות בוצע כדי לחקור את תפקידיהן ואת המנגנונים הפתוגניים שלהן ב- IM.

Introduction

נגיף אפשטיין-בר (EBV), נגיף γ-הרפס הידוע גם בשם נגיף הרפס אנושי מסוג 4, נמצא בכל מקום באוכלוסייה האנושית ויוצר זיהום סמוי לכל החיים ביותר מ-90% מהאוכלוסייה הבוגרת1. רוב ההדבקות הראשוניות ב-EBV מתרחשות במהלך הילדות וההתבגרות, כאשר חלק קטן מהחולים מתבטאים במונונוקלאוזיס זיהומי (IM)2, ומראים אימונופתולוגיה אופיינית, כולל תגובה חיסונית פעילה עם תאי CD8+ T בדם והתפשטות חולפת של תאי B נגועים ב-EBV בלוע3. מהלך ה- IM עשוי להימשך 2-6 שבועות ורוב החולים מחלימים היטב4. עם זאת, אנשים מסוימים מפתחים תסמינים מתמשכים או חוזרים דמויי IM עם תחלואה ותמותה גבוהות, המסווגות כזיהום EBV פעיל כרוני (CAEBV)5. בנוסף, EBV הוא נגיף אונקוגני חשוב, הקשור קשר הדוק למגוון ממאירויות, כולל ממאירות אפיתליואידית ולימפואידית כגון קרצינומה של הלוע, לימפומה של בורקיט, לימפומה של הודג’קין (HL) ולימפומה של תאי T/NK6. למרות ש- EBV נחקר במשך למעלה מ -50 שנה, הפתוגנזה שלו והמנגנון שבאמצעותו הוא גורם להתפשטות הלימפוציטים לא הובהרו במלואם.

מספר מחקרים חקרו את החתימות המולקולריות לאימונופתולוגיה של זיהום EBV על ידי ריצוף תעתיק. Zhong et al. ניתחו פרופילים של תעתיק שלם של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מילדים סינים עם IM או CAEBV כדי למצוא שהרחבת תאי T CD8+ נמצאה בעיקר בקבוצת IM7, מה שמרמז על כך שתאי CD8+ T עשויים למלא תפקיד מרכזי ב-IM. באופן דומה, מחקר אחר מצא שיעורים נמוכים יותר של תאי T ו-CD19+ B ציטוטוקסיים ספציפיים ל-EBV ואחוזים גבוהים יותר של תאי CD8+ T בחולים עם IM שנגרם על ידי זיהום EBV ראשוני מאשר בחולים עם IM שנגרם הן על ידי הפעלה מחדש של EBV והן על ידי סוכנים אחרים8. תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. Al Tabaa et al. מצאו שתאי B היו אינטופלסמבלסטים פעילים ומתמיינים באופן פוליקלונלי (CD19+, CD27+ ו-CD20, ו-CD138− תאים) ותאי פלזמה (CD19+, CD27+ ו-CD20 ו-CD138+) במהלך IM9. יתר על כן, Zhong et al. מצאו כי סמני מונוציטים CD14 ו- CD64 היו מווסתים ב- CAEBV, מה שמרמז על כך שמונוציטים עשויים למלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית התאית של CAEBV באמצעות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) ופאגוציטוזה היפראקטיבית7. Alka et al. אפיינו את התעתיק של MACS מיון CD56 dimCD16+ NK תאים מארבעה חולים של IM או HL ומצאו כי תאי NK הן IM והן HL היו בעלי חסינות מולדת מווסתת וגנים לאיתות כימוקין, אשר יכול להיות אחראי על תגובתיות נמוכה של תאי NK10. בנוסף, Greenough et al. ניתחו ביטוי גנים של תאי CD8+ T ממוינים מ-10 PBMCs של אנשים עם IM. הם דיווחו כי חלק גדול מתאי ה-CD8+ T בהודעות מיידיות היו ספציפיים לנגיף, הופעלו, התחלקו והתכוננו להפעיל פעילויות השפעה11. הן תגובות בתיווך תאי T, ספציפיות ל-EBV, והן תגובות לא ספציפיות בתיווך תאי NK, ממלאות תפקידים חיוניים במהלך זיהום EBV ראשוני. עם זאת, מחקרים אלה חקרו רק את תוצאות השעתוק של תערובת מגוונת של תאי חיסון או רק תת-אוכלוסייה מסוימת של לימפוציטים, שאינה מספיקה להשוואה מקיפה של המאפיינים המולקולריים והתפקודים של תת-אוכלוסיות שונות של תאי חיסון אצל ילדים עם IM באותו מצב מחלה.

מאמר זה מתאר שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של PBMCs (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר תאים מגנטיים ומסומנים פלואורסצנטיים באמצעות מפריד מגנטי ו- FACS או לנתח אותם על ידי ציטומטריה של זרימה. ניתן להפיק RNA מהתאים המטוהרים לצורך ריצוף תעתיק. שיטה זו תאפשר אפיון וביטוי גנים של תאי חיסון שונים באותם מצבי מחלה של אנשים עם IM, מה שירחיב את הבנתנו לגבי האימונופתולוגיה של זיהום EBV.

Protocol

דגימות דם התקבלו מחולים עם IM (n = 3), נשאים בריאים של EBV (n = 3) וילדים לא נגועים ב- EBV (n = 3). מתנדבים גויסו מבית החולים לילדים בבייג’ינג, אוניברסיטת קפיטל מדיקל, וכל המחקרים אושרו אתית. אישור אתי הושג על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג’ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: [2021]-E-056-Y). ה?…

Representative Results

התייחסות לאסטרטגיית הגטינגאסטרטגיית המיון המשמשת למיון ארבע תת-אוכלוסיות הלימפוציטים מוצגת באיור 1. בקצרה, לימפוציטים נבחרים (P1) על תרשים נקודה המציג את הגרנולוסיות (SSC-A) לעומת הגודל (FSC-A). לאחר מכן, תאים בודדים נבחרים (P2) בהתוויית נקודה המציגה את הגודל (FSC-A) לעומת ?…

Discussion

פרוטוקול זה מייצג דרך יעילה למיין תת-אוכלוסיות של תאי חיסון היקפיים בדם. במחקר זה, דגימות דם ורידי מחולים עם IM, נשאים בריאים של EBV וילדים לא נגועים ב- EBV נבחרו כמטרת המחקר. עבודה זו באמצעות הדם ההיקפי של חולים של IM מתמקדת בעיקר בניתוח וקביעת הפרופורציות של תת-קבוצות תאים שונות באמצעות ציטומטר…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82002130), קרן בייג’ינג למדעי הטבע (7222059) וקרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026).

Materials

APC anti-human CD16 Biolegend 302012 Fluorescent antibody 
APC anti-human CD56 (NCAM) Biolegend 362504 Fluorescent antibody 
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Biolegend 344616 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) Becton, Dickinson and Company 644832 Cell sort
CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 microbeads
Cell ctng slides BIO RAD 1450016 Cell count
Centrifuge tubes Falcon 35209715 15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium) Beyotime ST1303 EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes Becton, Dickinson and Company  367862  EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19 Biolegend 302206 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
 High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
 High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque
LS Separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Separation columns
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnetic bead separator
PE anti-human CD8 Biolegend 344706 Fluorescent antibody 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 Biolegend 344808 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Polystyrene round bottom tubes Falcon 352235 5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent Ambion 15596024 Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining

References

  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, L., Liu, M., Zhang, M., Ai, J., Tian, J., Wang, R., Xie, Z. Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis. J. Vis. Exp. (187), e64212, doi:10.3791/64212 (2022).

View Video