Summary
Wir beschreiben eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen peripherer mononukleärer Blutzellen (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszierend markierte Zellen gereinigt und analysiert werden.
Abstract
Die infektiöse Mononukleose (IM) ist ein akutes Syndrom, das meist mit einer primären Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) einhergeht. Die wichtigsten klinischen Symptome sind unregelmäßiges Fieber, Lymphadenopathie und signifikant erhöhte Lymphozyten im peripheren Blut. Der pathogene Mechanismus von IM ist noch unklar; Es gibt keine wirksame Behandlungsmethode dafür, da hauptsächlich symptomatische Therapien zur Verfügung stehen. Die Hauptfrage in der EBV-Immunbiologie ist, warum nur eine kleine Untergruppe infizierter Personen schwere klinische Symptome zeigt und sogar EBV-assoziierte Malignome entwickelt, während die meisten Personen für das Leben mit dem Virus asymptomatisch sind.
B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Natürliche Killerzellen (NK) sind zytotoxische angeborene Lymphozyten, die für die Abtötung von EBV-infizierten Zellen wichtig sind. Der Anteil der CD4+ T-Zellen nimmt ab, während der Anteil der CD8+ T-Zellen während einer akuten EBV-Infektion dramatisch zunimmt, und die Persistenz von CD8+ T-Zellen ist wichtig für die lebenslange Kontrolle von IM. Diese Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei IM, und ihre Funktionen müssen separat identifiziert werden. Zu diesem Zweck werden Monozyten zuerst von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von IM-Individuen mit CD14-Mikroperlen, einer Säule und einem Magnetabscheider getrennt.
Die restlichen PBMCs werden mit Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP)/Cyanin 5.5 Anti-CD3, Allophycocyanin (APC)/Cyanin 7 Anti-CD4, Phycoerythrin (PE) Anti-CD8, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Anti-CD19, APC Anti-CD56 und APC Anti-CD16 Antikörpern gefärbt, um CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen mit einem Durchflusszytometer zu sortieren. Darüber hinaus wurde eine Transkriptomsequenzierung von fünf Subpopulationen durchgeführt, um deren Funktionen und pathogene Mechanismen in IM zu untersuchen.
Introduction
Das Epstein-Barr-Virus (EBV), ein γ-Herpesvirus, das auch als humanes Herpesvirus Typ 4 bekannt ist, ist in der menschlichen Bevölkerung allgegenwärtig und etabliert eine lebenslange latente Infektion bei mehr als 90% der erwachsenen Bevölkerung1. Die meisten EBV-Primärinfektionen treten im Kindes- und Jugendalter auf, wobei sich ein Teil der Patienten mit infektiöser Mononukleose (IM)2 manifestiert und eine charakteristische Immunpathologie aufweist, einschließlich einer aktivierten Immunantwort mit CD8+ T-Zellen im Blut und einer vorübergehenden Proliferation von EBV-infizierten B-Zellen im Oropharynx3. Der Verlauf der IM kann 2-6 Wochen dauern und die Mehrheit der Patienten erholt sich gut4. Einige Personen entwickeln jedoch persistierende oder wiederkehrende IM-ähnliche Symptome mit hoher Morbidität und Mortalität, die als chronisch aktive EBV-Infektion (CAEBV) eingestuft wird5. Darüber hinaus ist EBV ein wichtiges onkogenes Virus, das eng mit einer Vielzahl von Malignomen verwandt ist, darunter epithelioide und lymphatische Malignome wie Nasopharynxkarzinom, Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom (HL) und T/NK-Zell-Lymphom6. Obwohl EBV seit über 50 Jahren untersucht wird, sind seine Pathogenese und der Mechanismus, durch den es die Proliferation von Lymphozyten induziert, nicht vollständig aufgeklärt.
Mehrere Studien haben die molekularen Signaturen für die Immunpathologie der EBV-Infektion durch Transkriptomsequenzierung untersucht. Zhong et al. analysierten das Whole-Transkriptom-Profiling von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von chinesischen Kindern mit IM oder CAEBV, um festzustellen, dass CD8+ T-Zellexpansion überwiegend in der IM-Gruppe7 gefunden wurde, was darauf hindeutet, dass CD8+ T-Zellen eine wichtige Rolle bei IM spielen könnten. In ähnlicher Weise fand eine andere Studie niedrigere Anteile an EBV-spezifischen zytotoxischen T- und CD19+ B-Zellen und höhere Prozentsätze von CD8+ T-Zellen bei Patienten mit IM, die durch eine primäre EBV-Infektion verursacht wurden, als bei Patienten mit IM, die sowohl durch EBV-Reaktivierung als auch durch andere Wirkstoffe verursacht wurden8. B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Al Tabaa et al. fanden heraus, dass B-Zellen während IM9 polyklonisch aktiviert und in Plasmablasten (CD19+, CD27+ und CD20− sowie CD138−-Zellen) und Plasmazellen (CD19+, CD27+ und CD20− und CD138+) differenziert wurden. Darüber hinaus fanden Zhong et al. heraus, dass die Monozytenmarker CD14 und CD64 bei CAEBV hochreguliert waren, was darauf hindeutet, dass Monozyten eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort von CAEBV durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und hyperaktive Phagozytose spielen könnten7. Alka et al. charakterisierten das Transkriptom von MACS sortierten CD56dim CD16+ NK-Zellen von vier Patienten von IM oder HL und fanden heraus, dass NK-Zellen sowohl aus IM als auch aus HL eine herunterregulierte angeborene Immunität und Chemokin-Signalgene aufwiesen, die für die Hyporeagibilität von NK-Zellen verantwortlich sein könnten10. Darüber hinaus analysierten Greenough et al. die Genexpression von sortierten CD8+ T-Zellen von 10 PBMCs von Personen mit IM. Sie berichteten, dass ein großer Teil der CD8+ T-Zellen in IM virusspezifisch war, aktiviert, sich teilte und darauf vorbereitet war, Effektoraktivitäten auszuüben11. Sowohl T-Zell-vermittelte, EBV-spezifische Reaktionen als auch NK-Zell-vermittelte, unspezifische Reaktionen spielen eine wesentliche Rolle während der primären EBV-Infektion. Diese Studien untersuchten jedoch nur die Transkriptomergebnisse der vielfältigen Mischung von Immunzellen oder nur eine bestimmte Subpopulation von Lymphozyten, was für den umfassenden Vergleich der molekularen Eigenschaften und Funktionen verschiedener Immunzellsubpopulationen bei Kindern mit IM im gleichen Krankheitszustand nicht ausreicht.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen von PBMCs (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszenzmarkierte Zellen mit einem Magnetabscheider und FACS gereinigt oder mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. RNA kann aus den gereinigten Zellen für die Transkriptomsequenzierung extrahiert werden. Diese Methode wird die Charakterisierung und Genexpression verschiedener Immunzellen in den gleichen Krankheitszuständen von Personen mit IM ermöglichen, was unser Verständnis der Immunpathologie der EBV-Infektion erweitern wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blutproben wurden von Patienten mit IM (n = 3), gesunden EBV-Trägern (n = 3) und EBV-nicht infizierten Kindern (n = 3) entnommen. Freiwillige wurden vom Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert und alle Studien wurden ethisch genehmigt. Die ethische Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: [2021]-E-056-Y). Auf die Einwilligung der Patienten nach Aufklärung wurde verzichtet, da in der Studie nur die verbleibenden Proben für klinische Tests verwendet wurden. Alle Daten wurden vollständig anonymisiert, um die Privatsphäre der Patienten zu schützen.
1. Isolierung von PBMCs aus peripherem Blut
- Sammeln Sie frisches peripheres Blut (2 ml) von Patienten mit IM in K3EDTA-Röhrchen durch Standardvenenpunktion.
HINWEIS: Der Prozess muss schnell sein, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten. - Verdünnen Sie peripheres Blut mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf ein zweifaches Volumen und schichten Sie es in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf das menschliche Lymphozyten-Trennmedium (Dichte: 1,077 ± 0,001 g / ml).
HINWEIS: Das Volumenverhältnis von Blut, PBS und Trennmedium betrug 1:1:1. Geben Sie das Blut langsam in das Trennmedium und zentrifugieren Sie es sofort, um zu vermeiden, dass sich Blut im Trennmedium absetzt. - Bei 800 × g 20 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Übertragen Sie die mittlere Schicht (angereicherte PBMCs) in ein anderes 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Nach der Zentrifugation befinden sich am Boden des Röhrchens Erythrozyten, die mittlere Schicht ist das Trennmedium, die oberste Schicht ist Plasma und zwischen der Plasmaschicht und der Trennflüssigkeitsschicht befanden sich die PBMCs (einschließlich Lymphozyten und Monozyten). - Die PBMCs mit 10 ml PBS waschen und bei 800 × g 20 min bei Raumtemperatur zentrifugieren; Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
- Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren (Schritt 1.4) 2 x. Resuspendieren Sie die PBMCs mit 1 ml PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zählen Sie die Zellen mit einem Trypanblau-basierten, automatisierten Zähler.
2. Isolierung von CD14 + -Monozyten aus PBMCs mit CD14-Mikroperlen
- Bereiten Sie eine Pufferlösung vor, die 0,5% fetales Rinderserum (FBS) und 2 mM EDTA in PBS (pH 7,2) enthält. Den Puffer kalt halten (2−8 °C).
HINWEIS: Entgasen Sie den Puffer vor der Verwendung, da Luftblasen die Säule blockieren könnten. Halten Sie die Zellen kalt, um ein Verschließen der Antikörper auf der Zelloberfläche und eine unspezifische Zellmarkierung zu verhindern. - Zentrifugieren Sie die PBMCs bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig. Resuspendieren Sie die Zellen mit 80 μL des Puffers. 20 μL CD14-Mikrokügelchen in die Zellsuspension geben.
HINWEIS: Wenn ≤107 PBMCs vorhanden sind, verwenden Sie das oben angegebene Volume. Wenn >107 PBMCs vorhanden sind, erhöhen Sie proportional alle Reagenzienvolumina und das Gesamtvolumen. - Mischen Sie die CD14-Mikrokügelchen und die Zellen gut in der 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhre und inkubieren Sie sie 15 Minuten in einem 4 °C-Kühlschrank. Die PBMCs mit 1 ml Puffer waschen und bei 300 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vollständig. Resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μL des Puffers.
HINWEIS: Wenn ≤108 PBMCs vorhanden sind, verwenden Sie das oben angegebene Volume. Wenn >108 PBMCs vorhanden sind, erhöhen Sie das Puffervolumen proportional. - Magnetische Trennung mit Säulen:
- Stellen Sie die Säule auf den magnetischen Perlenabscheider und waschen Sie die Säule mit 3 ml Puffer. Fügen Sie die Zellsuspension (aus Schritt 2.3) zur Spalte hinzu.
- Sammeln Sie die unbeschrifteten Zellen, die durch die Säule gehen, in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Säule mit 3 ml Puffer. Waschen Sie die Säule mit 3 x 3 ml Puffer. Sammeln Sie das gesamte Abwasser in der 15-ml-Zentrifugenröhre.
- Legen Sie die Säule in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie der Spalte 5 ml Puffer hinzu. Drücken Sie den Kolben fest in die Säule, um die magnetisch markierten Zellen sofort in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen auszuspülen.
- Zentrifugieren Sie die magnetisch markierten Zellen bei 300 × g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL PBS in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zur Verwendung in der nachfolgenden Transkriptomsequenzierung.
3. Trennung von Lymphozytenpopulationen aus PBMCs durch fluoreszenzmarkierte Antikörperfärbung und FACS
- Die nicht markierten Zellen (Schritt 2.4.2) werden bei 300 × g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- 2 μL jedes markierten Antikörpers (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) zu den 100 μL Zellsuspension geben (die Volumina und konjugierten Fluorophorinformationen der Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt), 30 min auf Eis inkubieren und vor Licht schützen.
- Waschen Sie die Zellen 2 x durch Zugabe von 1 ml PBS und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL PBS im 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie die Zellsuspension sanft an, bevor Sie Daten auf einem Durchflusszellensortierer-Zytometer erfassen.
4. Einstellung der Durchflusszytometrie-Parameter
- Nehmen Sie 100 μL der Zellsuspension (siehe Abschnitt 1) nach Bedarf in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie eine Negativkontrollprobe, eine CD3-Einzelfärbeprobe, eine CD4-Einzelfärbeprobe, eine CD8-Einzelfärbeprobe, eine CD19-Einzelfärbeprobe und eine CD56/CD16-Färbeprobe ein.
- Geben Sie 2 μL des entsprechenden fluoreszenzmarkierten Antikörpers pro 100 μL der Zellsuspension und des Wirbels hinzu. 30 min im Dunkeln auf Eis brüten. 5 min bei 300 × g zentrifugieren und den Überstand absaugen. Resuspendieren Sie die Pellets mit 500 μL PBS und Vortex.
- Beauftragen Sie den Sortierstrom und verzögern Sie die Tröpfchen mit den fluoreszierenden Perlen wie folgt:
- Öffnen Sie das Zellsortiersystem, führen Sie das Einschaltprogramm aus, installieren Sie die 85-μm-Düse und öffnen Sie den Sortierstrom. Stellen Sie die Sortierspannung auf 4.500 V und die Freq auf 47 ein.
- Passen Sie die Parameter hauptsächlich an, indem Sie den Bruchpunkt des Hauptstromtropfens und die Tröpfchenverzögerung gemäß den Anweisungen des Herstellerseinstellen 12. Richten Sie die erste Droplet-Breakpoint-Position (Drop1) auf 275 und die Lücke auf 8 im Breakoff-Fenster ein. Aktivieren Sie den automatischen Sortiermodus Sweet Spot , damit die Zytometrie automatisch den Tröpfchenamplitudenwert bestimmen kann, um den Stream zu stabilisieren.
- Stellen Sie die Tröpfchenverzögerung im Seitenstromfenster auf 30,31 ein, indem Sie die fluoreszierenden Perlen laden, um sicherzustellen, dass die Perlen eine Seitenstromablenkung von >99% entweder im Anfangs- oder Feinabstimmungsmodus erreichen.
- Beziehen Sie sich auf die in Abbildung 1 dargestellte Gating-Strategie, um das Gating wie folgt durchzuführen:
- Zeichnen Sie mithilfe eines Vorwärtsstreuflächen- (FSC-A)/Seitenstreuflächen-Punktdiagramms (SSC-A) das Polygongatter (P1), um die intakte Lymphozytenpopulation zu identifizieren.
- Zeichnen Sie mithilfe eines FSC-A/FSC-height (FSC-H)-Punktdiagramms das Polygongatter (P2), um die einzelnen Zellen zu identifizieren und Dubletten auszuschließen (Abbildung 1A).
- Zeichnen Sie mit einem CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A-Punktdiagramm das rechteckige Tor (P3), um CD3+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen auszuwählen (Abbildung 1A,B).
- Zeichnen Sie mit einem CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A-Punktdiagramm ein rechteckiges Tor, um CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Marker) auszuwählen.
- Zeichnen Sie mit einem CD56/CD16 APC-A/SSC-A-Punktdiagramm ein rechteckiges Tor, um CD56+/CD16+ NK-Zellen auszuwählen (Abbildung 1C).
- Passen Sie die instrumentellen Parameter anhand der Negativkontrollprobe an:
- Installieren Sie das Negativkontrollrohr am Ladeanschluss und klicken Sie im Erfassungs-Dashboard auf Laden. Wählen Sie die Zytometereinstellungen in der Software.
- Klicken Sie im Informationsfenster auf die Registerkarte Parameter und passen Sie die Spannungen von FSC, SSC und verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen an. FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanin 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanin 5.5: 663.
- Passen Sie die Kompensation mit den einzeln gefärbten Probenan 13.
- Laden Sie die einzeln gefärbten Röhrchen nacheinander auf das Zytometrie und wählen Sie Zytometereinstellungen in der Software. Klicken Sie auf die Registerkarte Vergütung, um die Vergütung anzupassen.
HINWEIS: Die Kompensationsreferenz der Durchflusszytometrie ist in Tabelle 2 dargestellt.
- Laden Sie die einzeln gefärbten Röhrchen nacheinander auf das Zytometrie und wählen Sie Zytometereinstellungen in der Software. Klicken Sie auf die Registerkarte Vergütung, um die Vergütung anzupassen.
5. Zellsortierung und Datenerhebung mittels Durchflusszytometrie
- Vortex die Zellsuspension (getrennte PBMCs gemäß Abschnitte 1-3) kurz, um die Zellen zu resuspendieren, bevor das Röhrchen in das Zytometer geladen wird. Bewahren Sie die restlichen Röhrchen auf Eis auf.
- Geben Sie 200 μL FBS in vier Sammelflussröhrchen, um ein Anhaften der sortierten Zellen an der Röhrchenwand zu vermeiden, und legen Sie sie in die Zytometer-Sammelkammer.
- Sammeln Sie CD3+CD4+ T-Zellen, CD3+CD8+ T-Zellen, CD3−CD19+ B-Zellen und CD3− CD56+/CD16+ NK-Zellen getrennt von der Probe eines Patienten mit IM in den vier Durchflussröhrchen (Abbildung 2A).
- Zentrifugieren Sie die getrennten Zellen bei 300 × g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie den Zellen 200 μL RNA-Isolationsreagenz für die Transkriptomsequenzierung hinzu.
- Trennen Sie die Immunzellsubpopulationen von Proben von gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern gemäß den obigen Schritten (Abbildung 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Referenz der Gating-Strategie
Die Gating-Strategie, die zur Sortierung der vier Lymphozyten-Subpopulationen verwendet wird, ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, werden Lymphozyten (P1) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Granulosität (SSC-A) im Vergleich zur Größe (FSC-A) zeigt. Dann werden einzelne Zellen (P2) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Größe (FSC-A) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC-H) zeigt, während Dublettenzellen ausgeschlossen werden. CD3+ T-Zellen (P3) und CD19+ B-Zellen (Abbildung 1B) werden separat in einem Punktdiagramm ausgewählt, das den CD3 PerCP-Cy5.5-A im Vergleich zu CD19 FITC-A zeigt. CD8+ T-Zellen und CD4+ T-Zellen werden separat in einem Punktdiagramm ausgewählt, das CD8 PE-A gegenüber CD4 APC-Cy7-A von P3 zeigt. CD16+/CD56+ NK-Zellen werden in einem Punktdiagramm ausgewählt, das CD56/CD16 APC-A im Vergleich zu SSC-A von P4 zeigt (Abbildung 1C).
Die repräsentativen Ergebnisse von vier Zellsubpopulationen, die nach der beschriebenen Methode aus den Stichproben von Patienten mit IM sortiert wurden, sind in Abbildung 2A dargestellt. Wir führten auch eine Zellsortierung an Proben von gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern als Kontrollgruppen durch, um die Durchführbarkeit dieses Experiments zu bestätigen. Die repräsentativen Ergebnisse von Zellsubpopulationen, die von der Probe eines gesunden EBV-Trägers getrennt wurden, sind in Abbildung 2B dargestellt. Das repräsentative Ergebnis der Zellsubpopulationen, sortiert aus der Stichprobe von EBV-nicht infizierten Kindern, ist in Abbildung 2C dargestellt. Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurde P1 zur Identifizierung von Lymphozyten gated und Dublettenzellen wurden durch P2 ausgeschlossen; P3 wurde zur Auswahl von CD3+ T-Zellen und P5 zur Auswahl von CD19+ B-Zellen geschlossen; CD3+ CD8+ T-Zellen (P6) und CD3+ CD4+ T-Zellen (P7) wurden getrennt von P3 ausgewählt; CD16+/CD56+ NK-Zellen (P8) wurden aus P4 ausgewählt. Jede dieser Subpopulationen kann einzeln sortiert und für nachgeschaltete Experimente gesammelt werden. Dieses System wurde verwendet, um die Genexpression durch RNA-Extraktion und Transkriptomsequenzierung zu analysieren.
Wie in Tabelle 3 berichtet, wurde ein Anstieg der CD3+ CD8+ T-Zellen bei Patienten mit IM im Vergleich zu gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern beobachtet (46,5 ± 4,0 vs. 27,0 ± 0,1 und 46,5 ± 4,0 vs. 24,7 ± 2,9, % CD3+ CD8+ T-Zellen pro Gesamtlymphozyten); Verringerte Anteile von CD3+ CD4+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen wurden bei Patienten mit IM im Vergleich zu gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern beobachtet (13,4 ± 1,5 vs. 19,3 ± 1,5 und 13,4 ± 1,5 vs. 23,6 ± 3,2, % CD3+ CD4+ T-Zellen pro Gesamtlymphozyten; 1,4 ± 0,3 vs. 7,6 ± 0,7 und 1,4 ± 0,3 vs. 9,0 ± 1,5, % CD19+ B-Zellen pro Gesamtlymphozyten). Verringerte Anteile von CD16+/CD56+ NK-Zellen wurden bei Patienten mit IM im Vergleich zu EBV-nicht infizierten Kindern beobachtet (7,5 ± 0,5 vs. 10,7 ± 0,4, % CD16+/CD56+ NK-Zellen pro Gesamtlymphozyten). Diese Ergebnisse bestätigten die Wirksamkeit dieses Sortierprotokolls und zeigten, dass die Anteile der Lymphozytenuntergruppen bei Patienten mit IM und EBV-nicht infizierten Kindern unterschiedlich sind.
Abbildung 1: Allgemeine Gating-Strategie zur Sortierung von Immunzellsubpopulationen aus PBMCs. (A) Der PerCP-Cy5.5-Filter wurde verwendet, um CD3+ T-Zellen zu trennen. CD8+ T-Zellen und CD4+ T-Zellen wurden separat in einem Punktdiagramm ausgewählt, das CD8 PE-A gegenüber CD4 APC-Cy7-A von P3 zeigt. (B) Der FITC-Filter wurde verwendet, um CD19+ B-Zellen zu identifizieren. (C) Der APC-Filter wurde verwendet, um CD16+/CD56+ NK-Zellen von P4 zu trennen. Abkürzungen: PBMCs= periphere mononukleäre Blutzellen; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; SSC-A = Seitenstreufläche; FSC-H = Vorwärtsstreuhöhe; PerCP = Peridinin-Chrorophyll-Protein; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse von vier Zellsubpopulationen, die mit der beschriebenen Methode erfolgreich isoliert wurden. (A) Repräsentative Zellsortierzahlen aus der peripheren Blutprobe von Patienten mit IM. (B) Repräsentative Zellsortierzahlen aus der peripheren Blutprobe eines gesunden EBV-Trägers. (C) Repräsentative Zellsortierzahlen aus der peripheren Blutprobe von EBV-nicht infizierten Kindern. P1, Dot Plot Gate zur Identifizierung von Lymphozyten; P2, Punktplot-Gate zur Auswahl einzelner Zellen; P3, Dot Plot Gate zur Auswahl von CD3+ T-Zellen; P4, Dot Plot Gate zur Identifizierung von CD3- CD19- Lymphozyten; P5, Punktplot-Gate zur Auswahl von CD19+ B-Zellen; P6, Punktplot-Gate zur Auswahl von CD3+ CD8+ T-Zellen aus P3; P7, Dot Plot Gate zur Auswahl von CD3+ CD4+ T-Zellen aus P3; P8, Punktplot-Gate zur Auswahl von CD16+/CD56+ NK-Zellen von P4. Abkürzungen: EBV = Epstein-Barr-Virus; IM = infektiöse Mononukleose; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; SSC-A = Seitenstreufläche; FSC-H = Vorwärtsstreuhöhe; PerCP = Peridinin-Chrorophyll-Protein; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Antikörper-Target | Konjugiertes Fluorophor | Dosierung | Klonen | Isotyp |
| CD3 | PerCP/Cyanin5.5 | 2 μL | SK7 | Maus IgG1, κ |
| CD4 | APC/Cyanin7 | 2 μL | SK3 | Maus IgG1, κ |
| CD8 | PE | 2 μL | SK1 | Maus IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μL | HIB19 | Maus IgG1, κ |
| CD56 | APC | 2 μL | 5.1H11 | Maus IgG1, κ |
| CD16 | APC | 2 μL | 3G8 | Maus IgG1, κ |
Tabelle 1: Antikörper für die Durchflusszytometrie. Abkürzungen: PerCP = Peridinin-Chrorophyll-Protein; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat.
| Kompensationsreferenz der Durchflusszytometrie (%) | |||||
| PE | APC | APC-Cy7 | FITC | PerCP-Cy5.5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabelle 2: Kompensationsreferenz der Durchflusszytometrie. Abkürzungen: PerCP = Peridinin-Chrorophyll-Protein; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat.
| Anteil der Lymphozyten verschiedener Subpopulationen an den insgesamt sortierten Lymphozyten (%) | |||
| Subpopulation der Lymphozyten | IM | gesunde EBV-Träger | EBV-nicht infizierte Kinder |
| CD3+ T-Zellen | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2,1 |
| CD3+ CD8+ T-Zellen | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| CD3+ CD4+ T-Zellen | 13,4 ± 1,5 | 19,3 ± 1,5 | 23,6 ± 3,2 |
| CD16+/CD56+ NK-Zellen | 7,5 ± 0,5 | 2,2 ± 0,1 | 10,7 ± 0,4 |
| CD3- CD19+ B-Zellen | 1,4 ± 0,3 | 7,6 ± 0,7 | 9,0 ± 1,5 |
Tabelle 3: Anteil sortierter Lymphozyten verschiedener Gruppen. Abkürzungen: EBV = Epstein-Barr-Virus; IM = infektiöse Mononukleose; NK = natürlicher Killer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode dar, um periphere Blutimmunzellsubpopulationen zu sortieren. In dieser Studie wurden venöse Blutproben von Patienten mit IM, gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern als Forschungsziel ausgewählt. Diese Arbeit mit dem peripheren Blut von IM-Patienten konzentriert sich hauptsächlich auf die Analyse und Bestimmung der Anteile verschiedener Zelluntergruppen durch Mehrfarben-Durchflusszytometrie. Die Transkriptomsequenzierung wird hauptsächlich für den Nachweis und die Analyse einer bestimmten Subpopulation von Lymphozyten verwendet, die für den umfassenden und spezifischen Vergleich der molekularen Eigenschaften und Funktionen verschiedener Immunzellsubpopulationen bei Kindern mit IM im gleichen Krankheitszustand unzureichend war. Daher könnte das Aussortieren mehrerer Zelltypen aus dem peripheren Blut und die Durchführung einer Transkriptomsequenzierung zum Vergleich der Unterschiede in den Expressionsgenen und Funktionen dieser Immunzellen signifikante Daten für die Untersuchung der Pathogenese von IM liefern.
Die FACS-Sortierung hat den zusätzlichen Vorteil, lebende, fraktionierte Zellen für weitere In-vitro- oder In-vivo-Experimente verarbeiten zukönnen 14. Die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit ist für nachfolgende Experimente von entscheidender Bedeutung. Wir haben den Sortierschritt optimiert, um die Zelllebensfähigkeit in diesem Protokoll zu verbessern - experimentelle Manipulationen wurden auf Eis oder in einem 4 °C Kühlschrank durchgeführt. Die richtige Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit sind auch entscheidend für die Zellisolierung. Die Ausbeute sortierter Zellen ist auch die Haupteinschränkung bei dieser Methode, und die Verwendung von FBS-beschichteten Röhrchen während der Sortierung kann den Verlust von Zellen, die an den Röhrchen haften, erheblich reduzieren. Die richtigen Einstellungen für den FACS-Sortierer können die Gesamteffizienz der Sortierung verbessern, indem Zellverstopfungen oder Kreuzkontaminationen im Sammelröhrchen vermieden werden. Durch die Optimierung von experimentellen Schritten und Einstellungen kann dieses Protokoll auf die Sortierung anderer Immunzellen extrapoliert werden, indem magnetische oder fluoreszierende Markierungen ersetzt werden. Aufgrund der Spezifität der Kinderproben (geringes Blutentnahmevolumen) untersuchten wir jedoch nur die Hauptpopulationen von Immunzellen (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen), ohne aufgrund der Einschränkung des Flusssortierkanals Subpopulationen zu sortieren. Diese Studie zeigte, dass periphere Blutproben von immunkompetenten Kindern und Proben von IM diese fünf Gruppen von Immunzellen erfolgreich aussortieren konnten; Die Blutproben von Patienten mit hämatologischen Malignomen (z. B. Leukämie, Lymphom), lymphoproliferativen Störungen (z. B. lymphoproliferativen Störungen nach der Transplantation, CAEBV) oder primärer Immunschwäche/erworbenem Immunschwächesyndrom können jedoch möglicherweise nicht erfolgreich nach diesem Protokoll sortiert werden.
IM gilt als selbstlimitierende Erkrankung, und Immunzellen wie γδ-T-Zellen, NKT-Zellen und NK-Zellen spielen eine bedeutende Rolle bei der antiviralen Immunantwort15. EBV-spezifische CD8+ T-Zellen werden weitgehend in Richtung eines Effektor-Phänotyps 10,16 differenziert, und es kommt zu einer Kontraktion des späten Effektorgedächtnisses und der Effektorzellen von IM zur Rekonvaleszenz17. In der Zwischenzeit scheinen NK-Zellen in IM funktionell defekt zu sein, einschließlich fehlender Zellaktivierung10, Verlust der aktivierenden Rezeptorsignalisierung und Degranulation18. Einige Studien haben gezeigt, dass CD4+ T-Zellen nicht nur CD8+ T-Zellen helfen können, EBV-infizierte B-Zellen abzutöten und zu eliminieren, sondern auch die Proliferation von B-Zellen hemmen können, indem sie Zytokine sezernieren und sogar direkt eine tötende Rolle während der EBV-Infektion spielen19,20. Wie in dieser Studie gezeigt, wurde ein erhöhter Anteil an CD3+ CD8+ T-Zellen bei Patienten mit IM im Vergleich zu gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden bei Patienten mit IM im Vergleich zu EBV-nicht infizierten Kindern verringerte Anteile von CD3+ CD4+ T-Zellen, CD19+ B-Zellen und CD16+/CD56+ NK-Zellen beobachtet. Die Funktion und Genexpression dieser verschiedenen Subtypen von Immunzellen im gleichen Krankheitszustand von IM bleibt jedoch unklar. Eine weitere Analyse der Genexpressionsprofile spezifischer Immunzelluntergruppen in IM kann helfen, Einblicke in den pathogenen Mechanismus von IM zu gewinnen.
Wir bieten eine Strategie, die immunmagnetische Bead-Sortierung und FACS kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen in PBMCs zu isolieren und zu analysieren. Monozyten werden zuerst mit CD14-Mikrokügelchen getrennt, und die restlichen PBMCs werden mit entsprechenden fluoreszenzmarkierten Antikörpern angefärbt, um CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen durch FACS zu sortieren. Wir verwendeten diese sortierten Zellen für die RNA-Extraktion und Transkriptomsequenzierung, um die Funktion und Genexpression verschiedener Immunzellen in der Immunpathologie von IM zu charakterisieren. Die Reinheit und Ausbeute der sortierten Zellen war im Allgemeinen ausreichend, um Genexpressionsstudien durchzuführen (Daten nicht gezeigt). Daher kann die Sortiermethode separater Immunzellsubpopulationen verwendet werden, um EBV-assoziierte lymphoproliferative Störungen wie CAEBV, posttransplantierte lymphoproliferative Störung weiter zu erforschen, um pathogene Gene, pathogene Proteine und potenzielle therapeutische Ziele nachzuweisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82002130), der Beijing Natural Science Foundation (7222059) und dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
