Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Измерение сжимаемости клеток и ядер на основе акустофлюидного микроустройства

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/64225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sino-French Institute of Nuclear Engineering and Technology, Sun Yat-sen University

Summary

Здесь представлен протокол построения быстрой и неразрушающей системы измерения сжимаемости клеток или ядер на основе акустофлюидного микроустройства. Исследованы изменения механических свойств опухолевых клеток после эпителиально-мезенхимального перехода или ионизирующего излучения, демонстрирующие перспективу применения данного метода в научных исследованиях и клинической практике.

Abstract

Клеточная механика играет важную роль в метастазировании опухоли, злокачественной трансформации клеток и радиочувствительности. Во время этих процессов изучение механических свойств клеток часто является сложной задачей. Обычные методы измерения, основанные на контакте, такие как сжатие или растяжение, склонны вызывать повреждение клеток, влияя на точность измерения и последующую культуру клеток. Измерения в адгезивном состоянии также могут влиять на точность, особенно после облучения, поскольку ионизирующее излучение сплющивает клетки и усиливает адгезию. Здесь разработана система измерения клеточной механики на основе акустофлюидного метода. Сжимаемость ячейки может быть получена путем записи траектории движения ячейки под действием акустической силы, которая может осуществлять быстрое и неразрушающее измерение в подвешенном состоянии. В этой статье подробно описываются протоколы проектирования чипов, подготовки образцов, регистрации траектории, извлечения и анализа параметров. На основе этого метода измеряли сжимаемость различных типов опухолевых клеток. Измерение сжимаемости ядра также достигалось путем регулировки резонансной частоты пьезоэлектрической керамики и ширины микроканала. В сочетании с проверкой на молекулярном уровне экспериментов с иммунофлуоресценцией сравнивали сжимаемость клеток до и после лекарственно-индуцированного эпителиального перехода в мезенхимальный переход (ЭМТ). Далее выявлено изменение сжимаемости клеток после рентгеновского облучения различными дозами. Предложенный в данной работе метод измерения клеточной механики является универсальным и гибким и имеет широкие перспективы применения в научных исследованиях и клинической практике.

Introduction

Механические свойства клеток играют важную роль в метастазировании опухоли, злокачественной трансформации клеток и радиочувствительности 1,2. Чтобы получить глубокое понимание роли механических свойств клеток в вышеуказанном процессе, точное измерение клеточной механики имеет решающее значение, и измерение не должно вызывать повреждения клеток для последующей культивирования и анализа. Процесс измерения должен быть как можно более быстрым, в противном случае жизнеспособность клеток может пострадать, если клетки будут удалены из среды культивирования на длительное время.

Существующие методы измерения клеточной механики сталкиваются с некоторыми ограничениями. Некоторые методы, такие как магнитная скручивающая цитометрия, магнитный пинцет и микрореология отслеживания частиц, вызывают повреждение клеток из-за введения частиц в клетки 3,4,5. Методы, которые измеряют путем контакта с клетками, такие как атомно-силовой микроскоп (AFM), аспирация микропипетки, микросужение и метод параллельных пластин, также подвержены повреждению клеток, и пропускную способность трудно увеличитьна 6,7,8. Кроме того, ионизирующее излучение будет сплющивать клетки и увеличивать их адгезию9; поэтому необходимо измерить механику целых клеток в суспензии.

В ответ на вышеуказанные вызовы была разработана система измерения клеточной механики на основе акустофлюидного метода10,11,12,13,14. Ширина канала соответствует акустической половине длины волны, создавая таким образом узел стоячей волны на средней линии микроканала. Под действием силы акустического излучения ячейки или стандартные шарики могут перемещаться к узлу акустического давления. Поскольку физические свойства стандартных шариков (размер, плотность и сжимаемость) известны, плотность акустической энергии может быть определена. Затем сжимаемость ячейки может быть получена путем записи траекторий движения клеток в акустическом поле. Может быть достигнуто неразрушающее высокопроизводительное измерение ячеек в состоянии суспензии. В этом документе будет представлен дизайн микрофлюидного чипа, создание системы и этапы измерения. Измерение различных типов опухолевых клеток было проведено для проверки точности метода. Область применения этого метода была распространена на субклеточные структуры (такие как ядро) путем регулировки резонансной частоты пьезоэлектрической керамики и ширины микроканала. Кроме того, исследованы изменения сжимаемости клеток после медикаментозного ЭМТ или рентгеновского облучения различными дозами. Полученные результаты демонстрируют широкую применимость данного метода как мощного инструмента для изучения корреляции между биохимическими изменениями и клеточными механическими свойствами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление и сборка акустофлюидного микроустройства

  1. Изготовление микрофлюидного чипа.
    1. Спроектируйте одноканальный чип только с одним входом и выходом, как показано на рисунке 1. Для измерения ячеек держите прямоугольное поперечное сечение микроканала на уровне 740 мкм в ширину и 100 мкм в глубину. Для измерения ядра клетки измените ширину и глубину микроканала на 250 мкм и 100 мкм соответственно.
    2. Подготовьте микроканал на кремниевой пластине с помощью реактивного ионного травления. Запечатайте верхнюю часть микроканала куском прозрачного термостойкого стекла с помощью анодного склеивания15. Мойте чипсы ультразвуковым очистителем в течение 10 минут. Высушите их в сушильной печи при 50 °C для последующего использования.
  2. Изготавливают полидиметилсилоксановые (PDMS) блоки.
    1. Добавьте 30 мл предварительного полимера в стеклянную посуду диаметром 100 мм .. Добавьте 3 мл отверждающего агента к предварительному полимеру шприцем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемное соотношение отверждающего агента и предварительного полимера составляет 1:10.
    2. Энергично смешайте преполимерный и отверждающий агент PDMS со стеклянным стержнем в течение примерно 10 минут. Ищите небольшие и равномерно разделенные пузырьки воздуха в растворе, которые указывают на то, что предполимерный и отверждающий агент PDMS хорошо перемешаны.
    3. Поместите стеклянную посуду в вакуумный осушитель и откусите на 15-25 с. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока в смеси не появятся пузырьки воздуха.
    4. Поместите стеклянную посуду в сушильную печь, установленную при 50 °C в течение 1 часа, чтобы смесь затвердела. После инкубации используйте скальпель, чтобы разрезать PDMS на блоки подходящего размера около 1,2 см длиной и 1 см шириной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина блока PDMS соответствует ширине чипа, а ширина выбирается для обеспечения достаточного пространства в середине для пьезоэлектрической керамики при склеивании двух блоков PDMS на чипе.
  3. Привяжите блок PDMS к чипу.
    1. Перфорационные отверстия в блоке PDMS для впускных и выпускных отверстий с полой иглой диаметром 1 мм. Поместите блоки PDMS и чип (тыльную сторону вверх) в плазмоочиститель на 1 мин.
    2. Выровняйте отверстия на блоках PDMS с входом и выходом стружки. Осторожно прижмите блоки PDMS к чипу в течение 15 с. Это должно привести к склеиванию между блоками PDMS и поверхностью чипа.
  4. Подключите катетер из политетрафторэтилена (PTFE) к чипу (рисунок 2B).
    1. Вырежьте два куска катетера из PTFE с внутренним диаметром 0,8 мм и длиной 10 см. Согните иглу из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,7 мм и длиной 1,5 см на 90° в L-образную форму. Подключите его к одному концу катетера. Подготовьте два таких катетера иглами.
    2. Вставьте иглы из нержавеющей стали в отверстия блоков PDMS. Для входа подключите дозирующую иглу 19 G к другому концу катетера в качестве разъема для шприца.
    3. После выполнения вышеуказанных шагов введите деионизированную воду, чтобы проверить герметичность общего канала. Непроницаемый для воды означает хорошее уплотнение.
  5. Пьезоэлектрическая керамическая сборка (Рисунок 2С)
    1. Используйте алмазный проволочный резак для резки пьезоэлектрических керамических листов диаметром 2 см на четыре полосы шириной 5 мм.
    2. Убедитесь, что резонансная частота пьезоэлектрической керамики соответствует ширине микроканала чипа. Для микроканалов шириной 740 мкм и 250 мкм используют пьезоэлектрическую керамику с резонансными частотами 1 МГц и 3 МГц соответственно.
    3. Сварная проволока с обеих сторон пьезоэлектрической керамики на одном конце.
    4. Приклейте пьезоэлектрическую керамику к середине задней части чипа цианоакрилатным клеем.
    5. Чтобы равномерно распределить клей, поместите каплю клея на пьезоэлектрическую керамику, разгладьте клей зубочисткой и удалите лишний клей. Затем быстро нажмите его на чип и продолжайте настаивать в течение примерно 1 минуты. Убедитесь, что пьезоэлектрическая керамика и чип прочно связаны и равномерно контактируют.
  6. Смонтируйте микроустройство (рисунок 2D).
    1. Вырежьте кусок PDMS (около 1,5 см в длину и 1 см в ширину) в качестве основы микроустройства. Используя двустороннюю ленту, приклейте одну сторону основания к входным и выходным блокам PDMS, а другую сторону к прозрачному стеклянному слайду. Закрепите все микроустройство на ступени микроскопа, чтобы сохранить чип в одной фокальной плоскости.

2. Пробоподготовка

  1. Приготовление растворов стандартных частиц полистирола.
    1. Добавьте 0,05 мл раствора частиц полистирола (диаметром 6 мкм) (2,1 x 108 частиц/мл) в 10 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить погрешность измерения, вызванную изменением плотности акустической энергии, раствор частиц полистирола смешивали с раствором образца в каждом эксперименте в качестве калибровки.
  2. Приготовление клеточных суспензий.
    1. Промывайте адгезивные ячейки (например, MCF7, MDA-MB-231, HCT116) при 90% слиянии (~5 x 105 клеток) с PBS. Добавьте 500 мкл 0,25% трипсина (1x) в течение 1-2 мин при комнатной температуре (25 °C). Удалить трипсин, добавить 1 мл полной среды и сформировать клеточную суспензию путем пипетирования.
    2. Центрифугируют клеточную суспензию при 100 х г в течение 5 мин. Удаляют супернатант и повторно суспендируют в 0,5-1 мл PBS с целью получения клеточной суспензии. Клетки подсчитывали гемоцитометром и концентрация составляла около 3-5 х 105 клеток/мл.
  3. Приготовление суспензии клеточного ядра
    1. Выполните шаг 2.2. Затем удаляют супернатант и добавляют 200 мкл реагента для экстракции цитоплазматического белка А (дополненного 1% PMSF) на гранулу клетки 20 мкл (приблизительно 5 миллионов клеток) и хорошо перемешивают.
    2. Закрутите вышеуказанную смесь по 220 х г в течение 5 с, а затем поместите на ледяную ванну на 10 мин. После инкубации добавляют в раствор 10 мкл реагента для экстракции цитоплазматического белка В.
    3. Вихрь при 220 х г в течение 5 с. Поместите на ледяную ванну на 1 мин и снова вихрь при 220 х г в течение 5 с. Затем, наконец, центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемное соотношение реагентов для экстракции цитоплазматического белка А и В составляет 20:1.
    4. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS. Затем центрифугу при 1000 х г при 4 °C в течение 4 мин. Удаляют супернатант и повторно суспендируют в 100 мкл PBS в виде суспензии клеточного ядра.
    5. Добавьте трипан синего цвета к суспензии ядра вышеуказанной клетки и окрашивайте при комнатной температуре (25 °C) в течение 4 мин. Объемное отношение раствора трипана синего к суспензии ядра составляет 1:1. Подсчитайте количество ядер под инвертированным микроскопом с 10-кратным объективом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для четкой идентификации клеточных ядер под микроскопом требуется окрашивание трипан-синим цветом. Раствор трипан синего должен находиться на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 мин перед использованием для эффективного окрашивания.
    6. Разбавляют вышеуказанную суспензию ядра клетки буфером PBS до концентрации 2-3 х 105 ядер/мл. Отфильтруйте суспензию ядра клетки через сито 70 мкм.

3. Измерение сжимаемости клетки и ядра

  1. Настройка измерительной системы (рисунок 3)
    1. Включите источник света микроскопа и откройте программное обеспечение камеры. Используйте объектив 4x, чтобы найти среднее положение микроканала, то есть положение пьезоэлектрической керамики.
    2. Соедините провода и приварите их к положительным и отрицательным клеммам выхода генератора сигналов на пьезоэлектрической керамике соответственно.
    3. Поместите шприц на микроинъекционный насос и подключите его к входному катетеру. Поместите небольшой контейнер в конце выходного катетера, чтобы удерживать жидкость, вытекающую из микроканала.
  2. Определение параметров измерения
    1. Аспирировать раствор частиц полистирола шприцем и впрыскивать его в микроканал чипа. Избегайте пузырьков воздуха в микроканале чипа, чтобы обеспечить точное измерение. Убедитесь, что частицы равномерно распределены в микроканале чипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение может проводиться без проточного или шприцевого насоса. При необходимости расход микроинъекционного насоса должен быть установлен на надлежащее значение. Здесь диапазон расхода составляет 0-20 мкл/ч.
    2. На выходе генератора сигналов установлен синусоидальный сигнал с частотой 1 МГц (3 МГц для измерения ядра ячейки) и пиковым напряжением (Vpp) 10 В.
    3. Тонкая настройка частоты сигнала до тех пор, пока не будет замечено, что частицы движутся к средней линии микроканала и остаются в прямом движении вдоль средней линии после достижения средней линии (рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость частиц, движущихся к средней линии, определяется амплитудой напряжения, которая может регулироваться между 5 Впп и 20 Впп.
  3. Измерение клеток и ядер
    1. Смешайте 1 мл клеточной или ядерной суспензии со стандартным раствором частиц в соотношении 1:1 и введите его в микроканал шприцем.
    2. Начните запись с помощью ПЗС-камеры, когда клетки или ядра войдут в поле зрения. Затем включите генератор сигналов. Прекратите запись, когда клетки или ядра достигнут средней линии.
    3. Промывайте микроканал деионизированной водой, 75% спиртом и деионизированной водой последовательно для последующего использования.

4. Обработка данных

  1. Отображение траекторий частиц или ячеек.
    1. Импортируйте захваченное видео в программное обеспечение ImageJ: > «Открыть файл> «Выбрать папку». Нажмите на фигуру эллипса на панели инструментов программного обеспечения ImageJ, чтобы выбрать интересующую ячейку и соседнюю с ней частицу (рисунок 5).
    2. Как показано на рисунке 5, предустановленные параметры измерения в программном обеспечении ImageJ как Analyze→ Set Measurement →Area, Centroid, Display Label.
    3. Взятие кадра, где целевая ячейка или частица подвергается продольному смещению в качестве стартового кадра; записывайте положение пикселя и размер ячейки или частицы в каждом кадре, пока они не достигнут средней линии микроканала. Экспортируйте данные в виде файла электронной таблицы и повторяйте шаг до тех пор, пока не будут получены траектории для всех интересующих ячеек.
  2. Преобразование и коррекция координат.
    1. Запишите пиксельные координаты четырех углов микроканала в этом поле зрения как (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Здесь x3 = x4.
    2. Для каждой точки измерения (xi, yi) вычислите новую координату (xi', yi') после коррекции вращения, используя следующие формулы:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
    3. Преобразуйте пиксельные координаты в координаты реального размера. Фактические координаты могут быть получены путем умножения пиксельных координат на отношение. Соотношение представляло собой фактическую ширину микроканала, деленную на ширину пикселей (H) микроканала.
    4. Преобразуйте и исправьте пиксельные координаты ячеек и частиц, полученные на шаге 4.1, в конечные данные траектории движения. Все координаты минус координаты левого нижнего угла, т.е. (0, y2). Частота кадров видео составляет 40 кадров в секунду, поэтому умножьте количество кадров, соответствующих каждой координате, на 0,025 с, чтобы получить время движения частицы, тем самым получив изменение положения в направлении y со временем.
  3. Рассчитайте плотность акустической энергии (рисунок 6A,B).
    1. Движение ячейки или частицы в направлении Y управляется акустической силой Fac и гидродинамической силой FD. Рассчитайте траекторию движения, используя следующие формулы:
      Equation 4(1)
      Equation 5(2)
      Equation 6(3)
      где r и D — радиус и диаметр ячейки или частицы, ρ и β — плотность и сжимаемость, ν — вектор скорости. Подстрочные индексы c и f обозначают ячейку и жидкость соответственно. d — расстояние от ближайшего узла акустического давления, μ — динамическая вязкость жидкости, k — волновое число, e — плотность акустической энергии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность MCF7, HCT116, A549 и ядер клеток составила 1068 кг/м3, 1077 кг/м3, 1073 кг/м3 и 1155 кг/м3, соответственно 12,16,17.
    2. Согласно формулам, описанным на этапе 4.3.1, используйте программное обеспечение MATLAB для получения численного решения для стандартной траектории частиц под акустическим полем методом конечных разностей.
    3. В пределах заданного диапазона акустического поля измените плотность акустической энергии и подойдите к численному решению (полученному на шаге 4.3.2) и измеренной траектории движения (полученной на шаге 4.2) для стандартной частицы. Выберите наилучший результат подгонки в соответствии со средней квадратичной погрешностью подгонки. Полученная здесь плотность акустической энергии используется в качестве параметра для последующего расчета сжимаемости ячейки.
  4. Рассчитайте сжимаемость ячейки (рисунок 6C,D).
    1. Установите плотность акустической энергии на значение, полученное на шаге 4.3.3.
    2. Согласно формулам, описанным на этапе 4.3.1, используйте программное обеспечение MATLAB для получения численного решения траектории ячейки под акустическим полем методом конечных разностей.
    3. Аналогично этапу 4.3.3, в пределах заданного диапазона сжимаемости изменяют сжимаемость и подходят численное решение (полученное на этапе 4.4.2) и измеренная траектория движения ячейки (полученная на этапе 4.2). Используйте коэффициент сжимаемости, соответствующий наилучшему результату подгонки, в качестве измеряемой сжимаемости ячейки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь в работе представлен протокол построения быстрой и неразрушающей системы измерения сжимаемости клеток на основе акустофлюидного микроустройства и продемонстрированы его преимущества для измерения клетки и ядра в различных ситуациях. На рисунке 1 показана схема микрофлюидного канала. Компоненты и сборка акустофлюидного микроустройства показаны на рисунке 2. На рисунке 3 показана настройка измерительной системы. Под действием силы акустического поля ячейки и частицы будут двигаться к средней линии микроканала, как показано на рисунке 4А. Измерение размера и положения ячеек или частиц показано на рисунке 5. Расчет плотности энергии и сжимаемости ячейки путем подгонки показан на рисунке 6. С целью расширения сферы применения этого устройства на клеточные органеллы, особенно ядро, из клеток выделяли ядра высокой чистоты и интактные ядра (рисунок 7А). Регулируя резонансную частоту пьезоэлектрической керамики и ширину микроканала соответственно, была получена траектория движения ядра (рисунок 4B) и достигнуто измерение сжимаемости ядра (рисунок 7B).

На основе этой системы измеряли и сравнивали сжимаемость различных типов раковых клеток (рисунок 8А). Кроме того, были исследованы изменения сжимаемости клеток после лекарственно-индуцированного ЭМТ или рентгеновского облучения различными дозами (Рисунок 8В,С). Для индукции ЭМТ использовались такие факторы роста, как трансформирующий фактор роста бета (TGFβ), эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF). Для облучения мощность дозы составляла 153 мЕд/мин, а используемые дозы составляли 1, 2, 4 и 8 Гр. Эти результаты демонстрируют широкую применимость данного метода как мощного инструмента для изучения корреляции между биохимическими изменениями и клеточными механическими свойствами. Самое главное, что этот метод был измерением без разрушения. Измеренные клетки были собраны и посеяны в чашке для клеточной культуры, и было обнаружено, что не было существенной разницы в пролиферации и жизнеспособности клеток по сравнению с необработанной группой после 48 ч культуры, как показано на рисунке 9, что указывает на то, что измерение не влияет на пролиферацию и выживаемость клеток.

Figure 1
Рисунок 1: Принципиальная схема микроканала микросхемы. На этом изображении показана структура и размеры микроканала чипа с одним входом и выходом. Размер единицы измерения составляет мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Фотография сборки для акустофлюидного микроустройства. (A) Передние и задние фотографии чипа. (B) На этом изображении показан входной катетер из PTFE с прикрепленной дозирующей иглой 19 г и иглой из нержавеющей стали. (C) На этом изображении показана пьезоэлектрическая керамика со сварной проволокой. (D) На этом изображении показана сборка акустофлюидного микроустройства с основанием для фиксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Настройка системы измерения сжимаемости ячеек. На этом изображении показана настройка измерительной системы, состоящей из генератора сигналов, шприцевого насоса, акустофлюидного микроустройства, микроскопа и ПЗС-камеры. Эта цифра была изменена с10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Движение клеток и ядер. На этом рисунке показано движение клеток (А) и клеточных ядер (В) к средней линии микроканала под действием силы акустического поля. Шкала = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Измерение размера и положения ячейки или частицы с помощью программного обеспечения ImageJ. На этом рисунке показано нажатие кнопки для получения таких параметров, как площадь и центроид в программном обеспечении ImageJ. Пиксельные координаты четырех углов микроканала записывались как (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Ширина пикселя была представлена как H. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Расчет плотности энергии и сжимаемости ячейки путем подгонки. (A) Значения средней квадратичной погрешности (LS) при различных плотностях энергии. Плотность акустической энергии была получена из наилучшего результата подгонки. Единицей плотности энергии является Дж/м3. (B) На этом рисунке показана подгонка численного решения и измеренной траектории движения частицы. (C) Средние значения квадратичной погрешности (LS) при различной сжимаемости ячейки. Сжимаемость ячейки была получена из наилучшего подходящего результата. D) На этом рисунке показана подгонка числового решения и измеренной траектории движения ячейки. Единица сжимаемости ячейки составляет 10-10 Па-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Извлечение ядер и измерение сжимаемости. (A) На этом изображении показаны ядра клеток, извлеченные из клеток A549, просматриваемых с объективом 40x. Шкала = 20 мкм. (B) На этом изображении показано измеренное сравнение сжимаемости ячеек A549 (N = 38) и их ядер (N = 45). Единица сжимаемости ячейки составляет 10-10 Па-1. Длина поля представляет собой стандартное отклонение. Для оценки значимости использовались т-тест студента и анализ хи-квадрата. **P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Сжимаемость различных типов раковых клеток и клеток после лекарственно-индуцированного ЭМТ или рентгеновского облучения. (А) Сжимаемость клеток различных типов раковых клеток. HCT116 (N = 36), A549 (N = 68) и MDA-MB-231 (N = 32) были клеточными линиями колоректальной карциномы, аденокарциномы легких и аденокарциномы молочной железы соответственно. (B) Сжимаемость клеток MCF7 и A549 до и после индукции ЭМТ. (C) Сжимаемость клеток, измеренная через 3 ч после облучения различными дозами. Единица сжимаемости ячейки составляет 10-10 Па-1. Конечные полосы квадрата представляют значения 10% и 90% соответственно. Длина поля представляет собой стандартное отклонение. Средняя горизонтальная линия представляет медианное значение. ns означает отсутствие статистической значимости. Для оценки значимости использовались т-тест студента и анализ хи-квадрата. *P < 0,05, **P < 0,01. Часть этого показателя была изменена с 18,19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Пролиферация и жизнеспособность клеток после измерения сжимаемости. На этом рисунке показана пролиферация клеток A549 (A) и жизнеспособность (B) после измерения сжимаемости. Контрольные группы представляют собой необработанные клетки. Тестовые группы представляют собой клетки, выращенные в течение 48 ч после измерения сжимаемости. Каждый эксперимент имеет не менее трех реплик. Для жизнеспособности клеток было подсчитано не менее 300 клеток. Для оценки значимости использовались т-тест студента и анализ хи-квадрата. ns указывает на статистическую значимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Обычно используемыми методами измерения клеточной механики являются AFM, аспирация микропипетки, методы микрофлюидики, метод параллельной пластины, оптический пинцет, оптические носилки и акустические методы20. Методы микрофлюидики могут работать с тремя подходами: микросужиганием, экстенсиональным потоком и сдвиговым потоком. Среди них оптические носилки, оптический пинцет, акустические методы, удлинительный поток и подходы сдвигового потока являются бесконтактными измерениями. В отличие от контактных измерений, бесконтактные измерения могут эффективно избежать проблемы повреждения клеток, вызванной контактной или локальной деформацией. Оптический пинцет очень чувствителен к измерительной среде21. Возмущения в оптических условиях могут вызывать значительные различия в результатах измерений, а высокая мощность лазера во время измерения также может привести к повреждению клеток. Кроме того, оптические носилки и оптический пинцет обычно имеют низкую пропускную способность20,22. Методы микрофлюидики, такие как экстенсиональный поток и сдвиговой поток, не могут измерять микромеханику опухолевых клеток непосредственно23. По сравнению с другими методами, акустические методы имеют преимущества неразрушающего, высокопроизводительного и широкого применения в измерении клеточной механики.

Метод измерения, основанный на акустофлюидном микроустройстве, разработанном в данной работе, использует бесконтактную силу акустического излучения, и наибольшая польза заключается в том, что она не повреждает клетки, что было подтверждено экспериментальными результатами, показанными здесь (рисунок 9). Еще одним преимуществом этого метода является высокая пропускная способность, которую можно регулировать, изменяя концентрацию клеток. В настоящее время скорость измерения около 50-70 ячеек/мин может быть достигнута исходя из предпосылки обеспечения точности последующего анализа данных. Поскольку клетки измеряются в суспензии, измерение неадгезивных клеток также может быть достигнуто, что расширяет сферу его применения. Кроме того, в данной работе было достигнуто измерение сжимаемости клеток после облучения, и выявлена взаимосвязь между сжимаемостью клеток и дозой облучения (рисунок 8). Кроме того, измерение клеток или ядер с различной жесткостью также может быть адаптировано путем регулировки резонансной частоты пьезоэлектрической керамики и ширины микроканала. Как показано на фиг.7, было достигнуто измерение сжимаемости ядра.

Здесь рассматривалось только движение клеток по длине и ширине микрофлюидного канала. Считалось, что клетки находятся в суспензии, потому что плотность клеток близка к плотности жидкости. Если бы произошло осаждение ячейки или трение со дном, это было бы обнаружено в последующем процессе подгонки траектории. Такие данные будут устранены. С целью валидации предложенного способа были испытаны два вида полистирольных шариков с разным диаметром (6 мкм и 10 мкм). В качестве контроля использовались бусины диаметром 6 мкм. Сжимаемость бусин диаметром 10 мкм была получена в виде 2,37 ± 0,11 х 10-10 Па-1, что соответствовало значению (2,1-2,4 х 10-10 Па-1), о котором сообщалось в другом исследовании 15,24.

На основе этого метода измеряли сжимаемость клеток и ядер. Поскольку ядро играет важную роль в механозондировании и механотрансдукции, измерение механических свойств ядра может помочь лучше понять, как они реагируют на внешние стимулы, такие как повреждение ДНК, вызванное ионизирующим излучением (рисунок 8). Кроме того, эксперименты показали, что сжимаемость клеток может служить новым показателем для мониторинга процесса ЭМТ (рисунок 8), показывая перспективы его применения в диагностике рака. Поскольку сила акустического излучения связана с размером клеток, плотностью клеток и сжимаемостью, этот метод также может быть использован для изоляции клеток, таких как отделение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) или их кластеров от образца крови. ЦОК и их кластеры играют важную роль в раннем выявлении метастатических опухолей и мониторинге эффективности лучевой терапии25,26. Таким образом, этот метод имеет большие перспективы клинического применения в раннем скрининге рака и оценке эффективности.

Стоит отметить, что ключевым фактором, влияющим на измерение данным методом, является сопоставление резонансной частоты с шириной микроканала, в результате чего на средней линии микроканала появляется узел стоячей волны. При этом следует обратить внимание на оклейку пьезоэлектрической керамики. Кроме того, чтобы точно идентифицировать и отслеживать траекторию клеток или частиц и избежать проблемы агрегации клеток из-за адгезии, пропускная способность не должна быть слишком высокой. Как изменения других параметров (таких как размер клеток, плотность клеток и т. д.) влияют на измерение сжимаемости, было изучено в предыдущей работе18. Более того, при измерении ядер клеток из-за их мягкости требуется большая движущая сила акустического излучения, чтобы заставить их плавно перемещаться к средней линии микроканала, что требует быстрой камеры для точного захвата траекторий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (номера грантов 12075330 и U1932165) и Фондом естественных наук провинции Гуандун, Китай (номер гранта 2020A1515010270).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  2. Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
  3. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
  4. Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
  5. Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
  6. Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
  7. Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  8. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  9. Jung, J. -W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
  10. Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
  11. Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
  12. Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
  13. Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
  14. Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
  15. Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
  16. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  17. Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
  18. Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
  19. Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
  20. Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
  21. Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
  22. Wei, M. -T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
  23. Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
  24. Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
  25. Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
  26. Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).

Tags

Исследование рака выпуск 185
Измерение сжимаемости клеток и ядер на основе акустофлюидного микроустройства
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu,… More

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter