Immunology and Infection

स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान कैंडिडा अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों में मॉर्फोजेनेसिस फेनोटाइप्स के लिए स्क्रीन करने के लिए विवो इमेजिंग में उपयोग

Published: October 12, 2022 doi: 10.3791/64258

Rohan S. Wakade¹, Damian J. Krysan^1,2, Melanie Wellington¹

¹Department of Pediatrics, Carver College of Medicine, University of Iowa, ²Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

यह पांडुलिपि गैर-इनवेसिव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस फेनोटाइप के लिए मध्यम आकार के कैंडिडा अल्बिकन्स उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का वर्णन करती है।

Abstract

कैंडिडा अल्बिकन्स एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ है। आकृति विज्ञान रूपों के बीच स्विच करने की इसकी क्षमता इसके रोगजनन के लिए केंद्रीय है; इन आकृति विज्ञान परिवर्तनों को पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में नियंत्रित एक जटिल सिग्नलिंग नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इन नियामक घटकों का अत्यधिक अध्ययन किया गया है, लेकिन लगभग सभी अध्ययन फिलामेंटेशन को ट्रिगर करने के लिए विभिन्न प्रकार के इन विट्रो उत्तेजनाओं का उपयोग करते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि रोगजनन प्रक्रिया के दौरान मोर्फोजेनेसिस को कैसे विनियमित किया जाता है, हमने स्तनधारी मेजबान के भीतर हाइफल गठन से गुजरने वाले जीवों की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए एक इनविवो माइक्रोस्कोपी सिस्टम विकसित किया। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों के छोटे संग्रह को स्क्रीन करने के लिए इस प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जिससे हमें मॉर्फोजेनेसिस के प्रमुख नियामकों की पहचान करने की अनुमति मिलती है क्योंकि यह संक्रमण की साइट पर होता है। प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं, यह दर्शाते हुए कि मॉर्फोजेनेसिस के कुछ नियामक, जैसे कि ट्रांसक्रिप्शनल नियामक ईएफजी 1, में विट्रो और विवो में लगातार फेनोटाइप होते हैं, जबकि अन्य नियामकों, जैसे कि एडेनिल साइक्लेज (साइर 1) में इन विट्रो की तुलना में विवो में काफी अलग फेनोटाइप होते हैं।

Introduction

कैंडिडा अल्बिकन्स एक आम मानव कवक रोगज़नक़ है, जिससे म्यूकोक्यूटेनियस रोग, प्रसारित रोग और स्थानीय ऊतक संक्रमण^होता है। अल्बिकन्स फिजियोलॉजी की एक प्रमुख विशेषता इसकी जटिल बहुरूपी वृद्धि है, जो एक कॉमेंसल और एक रोगज़नक़ ^2,3,4 दोनों के रूप में इसकी भूमिका से जुड़ी हुई है। 30 डिग्री सेल्सियस पर विट्रो में समृद्ध पोषक तत्वों की स्थिति के तहत, यह आमतौर पर एक ओवॉइड नवोदित खमीर के रूप में बढ़ता है। पोषक तत्वों की कमी, पीएच परिवर्तन, 37 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि, सीरम के संपर्क में, और अगर में एम्बेडेड होने पर विकास सहित विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय ट्रिगर्स के परिणामस्वरूप ध्रुवीकृत विकास पैटर्न में संक्रमण होता है, जिसके परिणामस्वरूप सच्चे हाइफे और / या स्यूडोहिफे⁵ का गठन होता है। ध्रुवीकृत विकास की शुरुआत और फिलामेंटस जीवों के परिणामस्वरूप विकास को मोर्फोजेनेसिस के रूप में जाना जाता है।

जीव की उग्रता में मोर्फोजेनेसिस के महत्व के कारण, हाइफल गठन के विनियमन का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है ^6,7. सिग्नलिंग मार्गों और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का एक जटिल नेटवर्क है जो मॉर्फोजेनेसिस को ट्रिगर करता है। रोगजनन के साथ सी अल्बिकन्स मॉर्फोजेनेसिस के संबंध के बावजूद, मॉर्फोजेनेसिस की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययनों ने हाइफल गठन को ट्रिगर करने के लिए इन विट्रो उत्तेजनाओं का उपयोग किया है। यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि फिलामेंटेशन के विभिन्न इन विट्रो मॉडल उत्तेजित व्यक्तिगत नियामक मार्गों के संदर्भ में समान नहीं हैं। इसके अलावा, कोई भी इन विट्रो विकास की स्थिति मेजबान के जटिल वातावरण के साथ कसकर मेल नहीं खाती है। मानव रोगज़नक़ के रूप में सी अल्बिकन्स के महत्व को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मध्यम थ्रूपुट वाली प्रणाली का उपयोग करके स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान इसके मोर्फोजेनेसिस की जांच करना है, इस प्रकार एक अन्वेषक को सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की जांच करने की अनुमति मिलती है।

इन जांचों को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक इनविवो इमेजिंग सिस्टम विकसित किया गया था जो हमें उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ^8,9,10 का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड माउस के पिन्ना के संक्रमण के दौरान सी अल्बिकन्स कोशिकाओं की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है। क्योंकि पिन्ना की त्वचा काफी पतली है, इन छवियों को ऊतक विच्छेदन की आवश्यकता के बिना प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार, मात्रात्मक फेनोटाइप डेटा को मेजबान ऊतक के भीतर सक्रिय संक्रमण की साइट पर मापा जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट^11,12 के साथ एक संदर्भ तनाव और एक या अधिक उत्परिवर्ती उपभेदों का परिवर्तन शामिल है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त उपभेदों को तब मिश्रित किया जाता है और इंट्राडर्मल रूप से सह-इंजेक्शन दिया जाता है। संक्रमण स्थापित होने के बाद, कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग फिलामेंटेशन की आवृत्ति और गठित फिलामेंट्स की लंबाई दोनों को मापने के लिए किया जाता है। उत्परिवर्ती उपभेदों से प्राप्त डेटा को संदर्भ तनाव से प्राप्त किया जाता है, जो एक ही ऊतक क्षेत्र में मौजूद होता है, इस प्रकार एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है। इस प्रणाली ने हमें सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों की कई श्रृंखलाओं को सफलतापूर्वक स्क्रीन करने की अनुमति दी है, जिनमें से कई में विट्रो ^9,10 में मॉर्फोजेनेसिस दोष हैं। इनमें से कई उपभेदों में विवो में आसानी से फिलामेंट होता है, जो मोर्फोजेनेसिस की जांच के लिए विवो मॉडल के महत्व पर प्रकाश डालता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में अध्ययन आयोवा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किए गए थे। बीएसएल 2 जीवों के साथ काम करने के लिए उपकरण और प्रक्रियाओं के लिए सीडीसी^{दिशानिर्देशों} का संदर्भ लें।

1. कैंडिडा अल्बिकन्स उपभेदों की तैयारी

सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए एक उपयुक्त संदर्भ तनाव की पहचान करें। सुनिश्चित करें कि यह तनाव अपने वंश और आनुवंशिक जोड़तोड़ के संदर्भ में प्रयोगात्मक उपभेदों से निकटता से मेल खाता है।
नोट: यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए, उत्परिवर्ती होमन, एट अल .¹⁴ में वर्णित उपभेदों से बनाए गए थे, जिनका निर्माण एसएन 152 से किया गया था। ये उत्परिवर्ती ^{Arg-हैं}। इसलिए, चयनित संदर्भ तनाव एसएन 250 था, जिसे एसएन 152 से भी बनाया गया था और यह ^{एआरजी-भी} है। पोषण संबंधी तनाव खमीर सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया¹⁵ में ध्रुवीकृत विकास के नियमन में महत्वपूर्ण हैं; अल्बिकन्स और अन्य कवक^16,17,18 में फिलामेंटेशन में भी ^{फंसाया} गया है। इसलिए, पोषण संबंधी तनाव से संभावित भ्रामक प्रभावों से बचने के लिए जब भी संभव हो प्रयोगात्मक उपभेदों के साथ ऑक्सोट्रॉफी के लिए संदर्भ तनाव का मिलान किया जाना चाहिए।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति संरचनाओं का चयन करें। विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक उपभेदों की जांच करते समय, एक संदर्भ तनाव बनाएं जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है और उत्परिवर्ती उपभेदों को चिह्नित करने के लिए अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करता है।
नोट: यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा संदर्भ तनाव के लिए एनईओएन और उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए आईआरएफपी का उपयोग करता है। किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है यदि यह अत्यधिक व्यक्त, अपेक्षाकृत उज्ज्वल है, और उपयोग किए जा रहे माइक्रोस्कोप द्वारा उत्तेजित / पता लगाने में सक्षम है। विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले संदर्भ उपभेदों की तुलना करने वाले नियंत्रण प्रयोगों ने मॉर्फोजेनेसिस पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के किसी भी प्रभाव का प्रदर्शन नहीं किया है।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति संरचनाओं के साथ उपभेदों को बदलें।
नोट: कई संस्थानों को सी अल्बिकन्स के साथ काम करने के लिए जैविक सुरक्षा स्तर 2 सावधानियों के उपयोग की आवश्यकता होती है। सभी कार्यों में स्थानीय सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए। स्थानीय नियमों के बावजूद, सी अल्बिकन्स के साथ काम करने वाले जांचकर्ताओं को जीव की सुरक्षित हैंडलिंग में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए।
1. मानक लिथियम एसीटेट प्रोटोकॉल 19 का उपयोग करके संदर्भ और प्रयोगात्मक^{उपभेदों} को बदलें।
  नोट: यहां वर्णित प्रयोगों में पीईएनओ 1-नियॉन-एनएटी^आर और पीईएनओ 1-आईआरएफपी-एनएटी^आर प्लास्मिड का उपयोग किया जाता है, जो डॉ रॉबर्ट व्हीलर^11,12 द्वारा उदारतापूर्वक प्रदान किया जाता है। प्लास्मिड को नोटी⁹ का उपयोग करके रैखिक किया गया था।
2. नोरसियोथ्रिसिन या अन्य प्रासंगिक चयन माध्यम पर विकास के आधार पर ट्रांसफॉर्मेंट्स का चयन करें।
3. सफल ट्रांसफॉर्मेंट्स की पहचान करें। टूथपिक का उपयोग करके प्रत्येक कॉलोनी से कोशिकाओं का एक छोटा सा डाब चुनें और फिर उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पानी की 2.5 μL बूंद में मिलाएं। एक कवरलिप लागू करें और 10x-40x आवर्धन पर जांच करें। एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम (प्रोटोकॉल के बाकी हिस्सों के लिए उपयोग किया जाता है) या किसी भी मानक वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ जांच करें। उपयुक्त ट्रांसफॉर्मेंट्स के पास उचित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक उज्ज्वल संकेत होगा।
  नोट: प्रतिनिधि परिणामों के लिए, नियॉन व्यक्त करने वाले उपभेदों को 472/30 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर, 520/35 एनएम बैंडपास उत्सर्जन फिल्टर और 495 एनएम सिंगल-एज डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर के साथ एक लंबे पास फिल्टर सेट के साथ एक सीधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा गया था। चूंकि आईआरएफपी आंखों से दिखाई नहीं देता है, इसलिए आईआरएफपी व्यक्त करने वाले उपभेदों को विवो इमेजिंग में उपयोग किए जाने वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके कल्पना की गई थी, उत्तेजना के लिए 638 एनएम लेजर का उपयोग करना और 655-755 एनएम से उत्सर्जन प्रकाश का पता लगाना।
  1. वैकल्पिक रूप से, फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी, हैंड-हेल्ड फ्लोरेसेंस उत्तेजना प्रणाली, या फ्लोरेसेंस डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके मैक्रोस्कोपिक कॉलोनी फ्लोरेसेंस का मूल्यांकन करें जो आमतौर पर जैल और वेस्टर्न ब्लोट्स के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. चयनित ट्रांसफॉर्मेंट्स के फ्रीजर स्टॉक बनाएं।
इंजेक्शन से 3 दिन पहले फ्रीजर स्टॉक से फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त संदर्भ और प्रयोगात्मक उपभेदों के साथ वाईपीडी (खमीर निकालने वाले पेप्टोन डेक्सट्रोज) ठोस मीडिया को टीका लगाएं, फ्रीजर स्टॉक से वाईपीडी ठोस मीडिया में जीवों के एक डाब को स्थानांतरित करने के लिए टूथपिक का उपयोग करें। 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
प्रत्येक स्ट्रेन के लिए, इंजेक्शन से 1 दिन पहले कई कॉलोनियों से ली गई सी अल्बिकन्स कोशिकाओं के साथ 25 एमएल वाईपीडी युक्त फ्लास्क का टीका लगाएं। एक कॉलोनी से वाईपीडी में जीवों के एक डाब को स्थानांतरित करने के लिए टूथपिक का उपयोग करके ऐसा करें; कई अलग-अलग कॉलोनियों से कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कई बार दोहराएं। 175 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर इनक्यूबेटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
नोट: इनोकुलम के स्रोत के रूप में कई कॉलोनियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि सी अल्बिकन्स में सहज आनुवंशिक परिवर्तनों की उच्च आवृत्ति है। इनोकुलम संस्कृति शुरू करते समय कई कॉलोनियों का उपयोग करने से इस संभावना को कम किया जाता है कि इनोकुलम में सभी जीव महत्वपूर्ण सहज परिवर्तनों के साथ माता-पिता से उत्पन्न होते हैं।
इंजेक्शन के दिन:
1. 500 x g पर 2 मिनट के लिए संस्कृति का सेंट्रीफ्यूज 1 एमएल ।
2. 1 एमएल बाँझ डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के साथ संस्कृति को तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, 1 एमएल बाँझ डीपीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें।
3. 1:100 पर धुली हुई संस्कृति के एक नमूने को पतला करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती करें।
4. डीपीबीएस का उपयोग करके धोए गए संस्कृति के घनत्व को 1 x 10⁸ जीव प्रति एमएल में समायोजित करें।
5. इंजेक्ट किए जाने वाले उपभेदों के प्रत्येक सेट के लिए, संदर्भ तनाव और प्रयोगात्मक तनाव (ओं) के समान मात्रा को मिलाकर इनोकुलम बनाएं। यह प्रति एमएल 1 x 10⁸ जीवों पर इनोकुलम के घनत्व को बनाए रखता है।
  नोट: प्रति कान मूल्यांकन किए जा सकने वाले उपभेदों की संख्या प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से सिग्नल को स्पष्ट रूप से भेदभाव करने के लिए उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपी प्रणाली की क्षमता से सीमित है।
6. एक बार इनोकुलम तैयार हो जाने के बाद, सीधे पशु इंजेक्शन पर आगे बढ़ें। उपयोग करने से पहले इनोकुलम को स्टोर न करें।

2. पशु तैयारी

स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति या संबंधित स्थानीय शासी निकाय से अनुमोदन प्राप्त करें।
विक्रेता या प्रजनन कार्यक्रम से 6-12 सप्ताह के चूहों को प्राप्त करें। उस सुविधा में चूहों को रखें जिसमें वे टीकाकरण से पहले कम से कम 1 सप्ताह के लिए प्रयोग के दौरान रहेंगे।
नोट: प्रतिनिधि परिणामों के लिए, 6 सप्ताह की मादा डीबीए 2 / एन चूहों का उपयोग किया गया था।
टीकाकरण से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए जानवरों को क्लोरोफिल-मुक्त चाउ खिलाएं।

3. बालों को हटाना और टीकाकरण

संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान को प्रेरित करें (चित्रा 1)।
सावधानी: इनहेल्ड एनेस्थेटिक एजेंट खतरनाक सामग्री हैं और आंखों या त्वचा की जलन के साथ-साथ तंत्रिका तंत्र विषाक्तता का कारण बन सकते हैं। इनहेल्ड एनेस्थेटिक्स के उपयोग के लिए सभी संस्थागत नीतियों और प्रक्रियाओं और सामान्य प्रयोगशाला सुरक्षा प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए। केवल इनहेल्ड एनेस्थेटिक्स के उपयोग में प्रशिक्षित व्यक्ति इन चरणों को कर सकते हैं। मानक प्रथाओं में दस्ताने पहनना, एक प्रयोगशाला कोट, आंखों की सुरक्षा, एनेस्थीसिया स्कैवेंजर सिस्टम का उपयोग और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार सावधानीपूर्वक रिकॉर्डकीपिंग शामिल है।
1. एक माउस को पूर्व-गर्म संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में रखें। सामान्य संज्ञाहरण के दौरान जानवर को गर्म वातावरण में रखें। इस उद्देश्य के लिए डिज़ाइन किए गए वार्मिंग पैड और एक गर्म माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करके इसे पूरा करें। ओवर-द-काउंटर हीटिंग पैड का उपयोग न करें क्योंकि यह ओवरहीट कर सकता है और जलन पैदा कर सकता है।
2. प्रेरण कक्ष को 2% -3% आइसोफ्लुरेन प्रदान करें जब तक कि माउस ने अपना राइटिंग रिफ्लेक्स नहीं खो दिया है और श्वसन धीमा और स्थिर है। संज्ञाहरण के प्रेरण कक्ष को शुद्ध करें और जानवर को 1% -2% आइसोफ्लुरेन प्रदान करने वाले गैर-रिब्रीदर नाक शंकु में स्थानांतरित करें।
3. पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स या अन्य सत्यापन तंत्र का उपयोग करके संज्ञाहरण के विमान को मान्य करें। प्रयोग के दौरान, जानवर के श्वसन पैटर्न और एनेस्थेटिक विमान की निगरानी करें, और आवश्यकतानुसार एनेस्थेटिक एकाग्रता को समायोजित करें।
4. कॉर्नियल निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंख स्नेहक लागू करें।
बाल हटाने (चित्रा 1 सी, डी)
1. कॉटन-टेड स्वैब का उपयोग करके दोनों कानों की आंतरिक और बाहरी सतह पर उदारतापूर्वक एक ओवर-द-काउंटर डिपिलेटरी क्रीम लागू करें।
2. 2-3 मिनट के बाद (या निर्माता के निर्देशों के अनुसार), सभी क्रीम और बालों को हटाने के लिए धीरे से सूखी धुंध पैड के साथ कान को पोंछें। डेपिलेटरी क्रीम अवशेषों को पूरी तरह से हटाने के लिए बाँझ पानी में संतृप्त धुंध पैड के साथ दो बार और पोंछें। सभी डिपिलेटरी क्रीम को हटाने में विफलता के परिणामस्वरूप त्वचा में जलन / सूजन होगी।
इंजेक्शन (चित्रा 1 ई, एफ)
1. 70% इथेनॉल में संतृप्त धुंध पैड के साथ इंजेक्ट किए जाने के लिए कान की सतह को पोंछें और हवा को सूखने दें।
2. इनोकुलम को कई बार मोड़कर या भंवर को अच्छी तरह से मिलाएं।
3. इंसुलिन सिरिंज में 20-30 μL इनोकुलम खींचें। सुई को ऊपर की ओर इशारा करते हुए, सिरिंज को धीरे से टैप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बैरल में कोई भी हवा शीर्ष पर है। सावधानीपूर्वक हवा और अतिरिक्त इनोकुलम को इनोकुलम ट्यूब या अपशिष्ट ट्यूब में वापस निकालें ताकि प्लंजर 10 μL के निशान पर हो।
4. गैर-प्रमुख हाथ की उंगली या अंगूठे पर थिम्बल पहनकर, कान को थिम्बल के पार लपेटकर स्थिर करें। वैकल्पिक रूप से, ओवर-द-काउंटर डबल-साइडेड स्किन टेप (फैशन टेप) को एक छोटे शंक्वाकार या गोल-तल वाले प्लास्टिक ट्यूब पर लागू करें और टेप के पार कान को लपेटें। इस बात का ध्यान रखें कि ऐसा करते समय एनेस्थीसिया नाक शंकु को हटा न दें। यह काम की सतह पर नाक को टेप करने में सहायक हो सकता है।
  नोट: जांचकर्ता के भौतिक आराम के आधार पर कान के आंतरिक या बाहरी पक्ष को इंजेक्ट किया जा सकता है। माइक्रोस्कोपी के लिए, माउस को रखना सुनिश्चित करें ताकि इंजेक्शन दिए गए कान का किनारा उद्देश्य लेंस की ओर हो।
5. सिरिंज सुई को त्वचा के लगभग पूरी तरह से समानांतर रखते हुए और किसी भी बड़ी नसों से बचते हुए, सुई की नोक को त्वचा की सबसे बाहरी परत में डालें जब तक कि बेवेल सिर्फ कवर न हो जाए।
6. धीरे-धीरे इनोकुलम को इंट्राडर्मल रूप से इंजेक्ट करें। एक अच्छा इंट्राडर्मल इंजेक्शन त्वचा में एक छोटा बुलबुला उठाएगा। रिसाव को कम करने के लिए सुई को कान से हटाने से पहले 15-20 सेकंड के लिए रखें।
  1. यदि जानवर के कान का निचला हिस्सा नम हो जाता है, तो सुई बहुत गहरी थी और पूरी तरह से कान से गुजरती थी। उस स्थिति में, कान के एक अलग क्षेत्र में इंजेक्शन को दोहराएं।
7. जानवर के दूसरे कान का उपयोग करके प्रक्रिया को दोहराएं। यह एक प्रतिकृति के लिए या सी अल्बिकन्स उपभेदों के एक अलग सेट के साथ एक ही सी अल्बिकन्स उपभेदों के साथ किया जा सकता है।
8. यदि तुरंत इमेजिंग नहीं की जाती है, तो जानवर को गर्म वसूली कक्ष में रखें। जानवर का निरीक्षण करें जब तक कि वह संज्ञाहरण से ठीक नहीं हो जाता है और फिर इसे अपने आवास पिंजरे में वापस कर देता है।
9. संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, स्पष्ट रूप से बायोहैजार्ड लेबल के साथ पिंजरे को चिह्नित करें और संकेत दें कि पिंजरे में जानवर कैंडिडा अल्बिकन्स से संक्रमित हैं।
10. पशु संज्ञाहरण और किसी भी अन्य आवश्यक संस्थागत प्रथाओं से संबंधित सभी आवश्यक रिकॉर्डकीपिंग को पूरा करें।
11. पशु जैविक सुरक्षा स्तर 2 सावधानियों का उपयोग करके पशु सुविधा स्थितियों में जानवर को रखें।

4. विवो परिणामों की तुलना के लिए इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस की मात्रा निर्धारित करें

इनोकुलम तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली उसी धुली हुई संस्कृतियों का उपयोग करके, आरपीएमआई 1640 + 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम में जीवों का 1:50 कमजोर पड़ना बनाएं और 4 घंटे के लिए टंबलिंग के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य मीडिया जो विट्रो में मोर्फोजेनेसिस को उत्तेजित करते हैं, का उपयोग किया जा सकता है।
नमूने को 500 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और डीपीबीएस के 0.5 एमएल में पुन: निलंबित करें।
नमूने को 1: 10 के अनुपात में पतला करें, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पतला नमूने के 2.5 μL रखें, और इसे कवरस्लिप के साथ कवर करें।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नमूने की जांच करें। कम से कम 100 कोशिकाओं की गणना करें, प्रत्येक तनाव के लिए खमीर और फिलामेंटस कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड करें। यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों में, एक फिलामेंटस सेल को किसी भी सेल के रूप में परिभाषित किया गया है जिसकी लंबाई मदर सेल की लंबाई से दोगुनी से अधिक है।
नोट: इन विट्रो मोर्फोजेनेसिस का परिमाणीकरण उसी दिन किया जा सकता है जिस दिन जानवरों का टीकाकरण किया जाता है। इंजेक्शन के लिए इनोकुलम तैयार करते समय इन विट्रो मोर्फोजेनेसिस परख शुरू करना और 4 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के दौरान जानवरों का टीकाकरण करना संभव है। यदि सभी पशु प्रक्रियाएं 4 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के अंत से पहले पूरी हो जाती हैं, तो इन विट्रो उत्तेजित कोशिकाओं की परीक्षा के लिए सीधे आगे बढ़ें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को डीपीबीएस (चरण 4.2 में) में 3.7% फॉर्मलाडेहाइड में फिर से निलंबित किया जा सकता है और कई दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। निश्चित जीवों को तब निर्धारित किया जा सकता है क्योंकि समय अनुमति देता है। इन विट्रो परिमाणीकरण परख के लिए जानवरों के टीकाकरण में देरी नहीं की जानी चाहिए।

5. विवो इमेजिंग में तैयारी

माइक्रोस्कोप तैयार करें (चित्रा 2 ए)।
1. सभी माइक्रोस्कोपी उपकरण चालू करें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  1. यदि उपलब्ध हो, तो किसी भी पूर्व-निर्धारित इमेजिंग सेटिंग्स को लोड करें।
  2. उपयोग किए जा रहे फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक लेजर और डिटेक्टरों को सक्रिय करें।
2. गर्म माइक्रोस्कोप चरण को चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होने दें।
  नोट: गर्म चरण के बजाय पूरी तरह से संलग्न पर्यावरण कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करना संभव है।
3. कवरस्लिप की शीर्ष सतह पर फोकस के विमान के साथ एक जेड-अक्ष संदर्भ बिंदु सेट करें। यह मंच खोलने के ऊपर जगह पर एक कवरस्लिप टैप करके और कवर स्लिप पर पानी की एक बूंद डालकर किया जा सकता है। पानी की बूंद के किनारे पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कम आवर्धन (10x) "शुष्क" उद्देश्य का उपयोग करें और फिर z-अक्ष संदर्भ बिंदु सेट करें। स्टेज से हटाने से पहले कवरस्लिप से पानी को अवशोषित करने के लिए तौलिए के टुकड़े का उपयोग करें।
4. बहुत लंबी कार्य दूरी के उद्देश्य को जगह में घुमाएं और लेंस पर विसर्जन द्रव की एक बूंद रखें। कवरस्लिप रखते समय संभावित क्षति से बचने के लिए लेंस को कम करें।
5. मंच खोलने के ऊपर # 1.5 कवरस्लिप रखें और इसे जगह पर टेप करें। सुनिश्चित करें कि टेप कवरस्लिप के सभी किनारों को पूरी तरह से कवर करता है ताकि किसी भी तरल पदार्थ को माइक्रोस्कोप में कवरस्लिप के नीचे बात करने से रोका जा सके। उद्देश्य को जेड-अक्ष संदर्भ बिंदु तक उठाएं ताकि विसर्जन द्रव उद्देश्य लेंस और कवरस्लिप दोनों के संपर्क में हो।
6. दबाव-संवेदनशील टेप के कई टुकड़े तैयार करें ताकि वे नोज़कोन और माउस को स्थिति देते समय उपयोग करने के लिए तैयार हों।
माउस में सामान्य संज्ञाहरण को ऊपर के रूप में चित्रित करने के लिए प्रेरित करें (चरण 3.1)।
माउस की स्थिति (चित्रा 2 बी-डी)।
1. माइक्रोस्कोप चरण पर एक संज्ञाहरण नाक शंकु को सुरक्षित करें ताकि जब जानवर इमेजिंग के लिए स्थिति में हो तो यह जानवर की नाक को पूरी तरह से कवर कर सके। यह दो जांचकर्ताओं के साथ अधिक आसानी से पूरा किया जा सकता है। पहले अन्वेषक ने एनेस्थेटाइज्ड माउस की नाक को नोज़कोन में रखा और जानवर की नाक पर नोज़कोन को पकड़ना जारी रखते हुए माउस को इमेजिंग के लिए स्थिति में ले जाएं। दूसरे अन्वेषक को नाक और टयूबिंग को टेप करने दें ताकि यह माउस की नाक पर स्थिर रूप से बैठे। एक बार जब नोज़कोन को जगह पर टैप किया जाता है, तो इसे इमेजिंग सत्र के शेष भाग के लिए छोड़ दें।
2. नोज़कोन रखने के लिए सबसे अच्छी जगह स्थापित करने के बाद, इसकी स्थिति पर ध्यान दें। बाद के इमेजिंग सत्रों के लिए, माइक्रोस्कोप में एक जानवर को लाने से पहले नोजकोन को मंच पर सुरक्षित किया जा सकता है।
3. ऑब्जेक्टिव लेंस के ऊपर कवरस्लिप पर बाँझ पानी की एक बूंद रखें।
4. माइक्रोस्कोप स्टेज पर माउस रखें। सुनिश्चित करें कि कान पानी की बूंद के शीर्ष पर है और कवरस्लिप के खिलाफ सपाट है।
5. कान को समतल करने के लिए एक दूसरे (शीर्ष) कवरस्लिप का उपयोग करें।
  1. माउस के शरीर के समानांतर कवरस्लिप के किनारे को रखें, किनारे माउस को छूते हुए जहां कान सिर से मिलता है।
  2. एक हिंज गति के साथ माइक्रोस्कोप चरण में कवरस्लिप के मुक्त किनारे को कम करें। जैसे ही कवरस्लिप माइक्रोस्कोप चरण के खिलाफ आता है, यह कान को समतल कर देगा। ध्यान रखें कि कान में सिलवटें या लकीरें न बनें।
  3. शीर्ष कवरस्लिप को सुरक्षित रूप से टेप करें ताकि यह कान को सपाट रखने के लिए पर्याप्त दबाव बनाए रखे। ध्यान रखें कि टेप में माउस के बाल या मूंछें न पकड़ें।
6. जब तक एक पर्यावरणीय कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग नहीं किया जाता है, तब तक माउस के शरीर को एक बाँझ ड्रेप के साथ कवर करें ताकि एक नॉर्मोथर्मिक वातावरण को बनाए रखा जा सके।
रुचि के क्षेत्र की पहचान करें।
1. सुनिश्चित करें कि उद्देश्य z-अक्ष संदर्भ बिंदु पर है।
2. वाइड-फील्ड इमेजिंग का उपयोग करके, फोकस प्लेन को कान के ऊतकों में समायोजित करें। एक अच्छी रणनीति रक्त वाहिकाओं पर ध्यान केंद्रित करना है- यदि कोई रक्त वाहिकाओं में लाल रक्त कोशिकाओं को चलते हुए देख सकता है, तो फोकस का विमान ऊतक के भीतर है।
3. यदि माइक्रोस्कोप वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस क्षमता से लैस है, तो रुचि के क्षेत्र की पहचान करने के लिए इसका उपयोग करें। यदि नहीं, तो कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करें। सामान्य तौर पर, रुचि के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना तेज होता है और कान के ऊतकों के कम विकिरण की आवश्यकता होती है।
  1. संदर्भ तनाव में व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक फिल्टर क्यूब का उपयोग करते हुए, एक क्षेत्र की पहचान करें जिसमें संदर्भ तनाव से फ्लोरोसेंट सिग्नल है। ध्यान रखें कि आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश व्यक्तिगत जीवों पर ध्यान केंद्रित करने की क्षमता को रोक देगा। इस कदम का लक्ष्य कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए रुचि के क्षेत्र की पहचान करना है।
  2. एक फिल्टर क्यूब में बदलें जो प्रयोगात्मक तनाव (ओं) द्वारा व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाएगा और चयनित क्षेत्र में उनकी उपस्थिति को सत्यापित करेगा।

6. इमेजिंग

सेटिंग्स निर्धारित करें.
1. जबकि इमेजिंग सॉफ्टवेयर लाइव कॉन्फोकल मोड में है, रुचि के क्षेत्र की जांच करें क्योंकि फोकल प्लेन को जेड-अक्ष के माध्यम से स्थानांतरित किया जाता है। उपयोग किए जा रहे सभी फ्लोरोसेंट प्रोटीन से एक मजबूत संकेत के साथ एक जेड-अक्ष विमान चुनें।
2. एक मजबूत पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति और / या इमेजिंग गति को समायोजित करें जैसे कि आकृति विज्ञान को दृश्य के क्षेत्र में सभी कोशिकाओं के लिए निर्धारित किया जा सकता है। ऊतक क्षति से बचने के लिए, सबसे कम संभव लेजर शक्ति का उपयोग करें।
  नोट: सभी इमेजिंग के साथ, लेजर पावर, अधिग्रहण की गति और रिज़ॉल्यूशन के बीच संतुलन है। उन सेटिंग्स की पहचान करें जो कान के ऊतकों के विकिरण को कम करने के लिए गति और लेजर शक्ति को संतुलित करते हुए जीव आकृति विज्ञान की स्पष्ट रूप से पहचान करते हैं। चूंकि इमेजिंग बाहरी डर्मिस के माध्यम से हो रही है, इसलिए उत्तेजना के लिए उच्च लेजर शक्ति की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर स्लाइड पर लगाए गए पारंपरिक नमूनों के कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए आवश्यक होती है। सौभाग्य से, आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए आवश्यक स्थानिक संकल्प का स्तर चरम नहीं है। इस प्रकार, ऊतक क्षति के बिना जीव आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए पर्याप्त संकेत के साथ छवियां प्राप्त करना आसानी से प्राप्त करने योग्य है।
3. एक बार जब ये पैरामीटर स्थापित हो जाते हैं, तो बाद के इमेजिंग सत्रों के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में सेवा करने के लिए इमेजिंग सत्र में इनका उपयोग करें। इस प्रकार इमेजिंग सेटिंग्स को सहेजना सहायक है।
  नोट: संक्रमण के व्यक्तिगत क्षेत्र ऊतक के भीतर उथले या गहरे हो सकते हैं। गहरे क्षेत्रों में लेजर शक्ति में वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है। क्योंकि यह परख इसकी तीव्रता के बजाय सिग्नल के स्थानिक वितरण पर निर्भर करती है, आवश्यकतानुसार फ़ील्ड के बीच छवि सेटिंग्स को बदलना स्वीकार्य है।
चित्र प्राप्त करें.
1. एक ऐसा क्षेत्र चुनें जिसमें संदर्भ तनाव में स्पष्ट फिलामेंट गठन हो और जहां अधिकांश जीव पर्याप्त रूप से फैले हुए हों कि उनकी आकृति विज्ञान निर्धारित किया जा सके।
2. जेड-स्टैक के लिए फोकस के शीर्ष और निचले विमानों को सेट करें। संक्रमित क्षेत्र की पूरी गहराई को कवर करना आवश्यक नहीं है, लेकिन ध्यान रखें कि छवि की मात्रा के शीर्ष या नीचे के जीवों को आमतौर पर विश्लेषण से बाहर रखा जाता है।
3. जेड-स्टैक छवियों को प्राप्त करें, प्रत्येक तनाव को अलग करने के लिए प्रत्येक चैनल को छद्म रंग दें, और चैनलों को ओवरले करें। छवियों को सहेजें।
4. दृश्य के अन्य क्षेत्रों के लिए दोहराएँ. मॉर्फोजेनेसिस स्थान से स्थान तक भिन्न हो सकता है; इसलिए, प्रत्येक कान से कम से कम तीन क्षेत्रों को प्राप्त करना और विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है।

7. मैनुअल दो आयामी विश्लेषण: फिलामेंटेशन की आवृत्ति

दो-आयामी छवि में जेड-स्टैक के अधिकतम प्रक्षेपण को करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। यहां दिए गए निर्देश फिजी / छवि जे के लिए हैं।
1. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी छवियों को खोलें।
2. यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक चैनल पर एक छद्म रंग लागू करें ताकि प्रत्येक सी अल्बिकन्स तनाव की सीधी पहचान की जा सके। इसके लिए इमेज > लुकअप टेबल > एलयूटी कलर पर क्लिक करें और चुने हुए छद्म रंग का चयन करें।
3. स्टैक फ़ाइल को अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण दो-आयामी छवि में कनवर्ट करें:
  1. z-स्टैक फ़ाइल का चयन करें। जेड प्रोजेक्शन > इमेज > स्टैक्स पर क्लिक करें।
  2. शीर्ष और नीचे के विमान का चयन करें और प्रक्षेपण प्रकार मैक्स तीव्रता का चयन करें।
तनाव प्रकार (चैनल रंग द्वारा प्रतिष्ठित) और आकृति विज्ञान द्वारा अधिकतम प्रक्षेपण छवियों में देखे गए प्रत्येक जीव की गणना करें।
1. जीव जो काफी अतिव्यापी हैं या बहुत अधिक जीव घनत्व वाले क्षेत्रों को सटीक रूप से गिनना मुश्किल होगा। इन्हें गिनती से बाहर रखें, लेकिन फिलामेंटस रूपों के खिलाफ पूर्वाग्रह पेश न करने का ध्यान रखें, जो ओवरलैप होने की अधिक संभावना रखते हैं।
2. जेड-स्टैक के सीधे अंदर या बाहर प्रोजेक्ट करने वाले फिलामेंटस फॉर्म अधिकतम प्रक्षेपण में छोटे गोल वस्तुओं के रूप में दिखाई देंगे। इसी तरह, जो जीव छवि की सीमा से कट जाते हैं, वे खमीर प्रतीत हो सकते हैं क्योंकि फिलामेंट दृश्य के क्षेत्र से बाहर है। इस प्रकार, दो-आयामी विश्लेषण हमेशा खमीर रूपों के प्रतिशत का अनुमान लगाएगा। चूंकि यह संदर्भ और प्रयोगात्मक तनाव (ओं) के साथ समान रूप से होगा, हमेशा प्रयोगात्मक परिणामों की तुलना संदर्भ तनाव से करें।
प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्धारित परिणामों की सांख्यिकीय तुलना करें।

8. मैनुअल दो आयामी विश्लेषण: फिलामेंट लंबाई

अल्बिकन्स के लिए, असामान्य फिलामेंट गठन हो सकता है क्योंकि: ए) कम "मां" खमीर कोशिकाएं मॉर्फोजेनेसिस से गुजरती हैं, बी) फिलामेंट्स धीमी दर से बढ़ते हैं, या सी) फिलामेंटस विकास शुरू होता है लेकिन बनाए नहीं रखा जाता है। इन संभावनाओं का मूल्यांकन करने के लिए, वास्तविक त्रि-आयामी लंबाई (नीचे चर्चा की गई) के लिए सरोगेट के रूप में अधिकतम प्रक्षेपण छवि में प्रत्येक फिलामेंट की वक्र पथ लंबाई की मात्रा निर्धारित करें।
1. जब एक कली एक मां कोशिका पर विकसित हो रही है, तो यह बताना संभव नहीं है कि यह फिलामेंट या खमीर बन जाएगा या नहीं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि इस विश्लेषण में केवल फिलामेंटस कोशिकाओं को शामिल किया गया है, केवल उन जीवों को मापें जिनमें बेटी कोशिका मातृ कोशिका की लंबाई से कम से कम दोगुनी है।
चरण 7 में बनाई गई अधिकतम प्रक्षेपण छवि खोलें।
ImageJ टूलसेट पर, स्ट्रेट/सेगमेंटेड लाइन टूल पर राइट-क्लिक करें और सेगमेंटेड लाइन का विकल्प चुनें। खंडित लाइन विकल्प उपयोगकर्ता को घुमावदार पथ के साथ फिलामेंट लंबाई को मापने की अनुमति देता है, जो सी अल्बिकन्स फिलामेंट्स की प्लास्टिसिटी को देखते हुए एक आवश्यकता है।
कली गर्दन से फिलामेंट के बढ़ते छोर तक फिलामेंट की लंबाई को मापें। कली गर्दन पर बाएं क्लिक करें; पॉइंटर एक छोटे वर्ग में बदल जाएगा। फिलामेंट की लंबाई के साथ उसका पता लगाएं, हर बार फिलामेंट के केंद्र पर क्लिक करें जब फिलामेंट की लंबी धुरी का वक्र, मोड़ या परिवर्तन होता है। फिलामेंट के बढ़ते सिरे पर डबल क्लिक करें।
प्रेस नियंत्रण + एम। यह एक पॉप-अप विंडो खोलेगा जो क्षेत्र, माध्य, मिन, मैक्स और लंबाई माप को सारणीबद्ध करता है। प्रत्येक फिलामेंट को मापने के बाद, माप की तालिका में वर्तमान माप जोड़ने के लिए नियंत्रण + एम को फिर से दबाएं।
जब सभी फिलामेंट्स को मापा गया है, तो डेटा विश्लेषण फ़ाइल में लंबाई माप को कॉपी और पेस्ट करें।
संदर्भ तनाव और उत्परिवर्ती तनाव में फिलामेंट लंबाई के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

9. मैनुअल त्रि-आयामी विश्लेषण

मॉर्फोजेनेसिस का अधिक सटीक माप प्राप्त करने के लिए जो खमीर रूपों की अतिवृद्धि से बचता है और स्यूडोहिफे और हाइफे के बीच भेदभाव की अनुमति दे सकता है, तीन आयामों में प्रत्येक जीव की आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करते हुए जेड-स्टैक के माध्यम से मैन्युअल रूप से ऊपर और नीचे स्क्रॉल करें।
वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक जेड-स्टैक की एक त्रि-आयामी छवि बनाएं और छवि को घुमाते समय प्रत्येक जीव के आकार का विश्लेषण करें।

10. स्वचालित विश्लेषण

इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, जीवों की गणना और उनकी आकृति विज्ञान को दो या तीन आयामों में स्वचालित करें।
नोट: आकृति विज्ञान प्रकारों के भेदभाव के लिए कुछ एल्गोरिदम पूर्वाग्रह पेश कर सकते हैं। इस प्रकार, प्रयोगात्मक डिजाइन के संबंध में स्वचालन रणनीतियों को सावधानीपूर्वक मान्य करने की आवश्यकता है। अच्छी तरह से डिज़ाइन और मान्य स्वचालित छवि विश्लेषण विश्लेषण चरण के थ्रूपुट को बढ़ा सकता है।

Representative Results

यहां प्रस्तुत परिणाम पहले प्रकाशित रिपोर्ट ^9,10 पर आधारित हैं। इस विश्लेषण का लक्ष्य सक्रिय संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस से गुजरने के लिए उत्परिवर्ती सी अल्बिकन्स उपभेदों की क्षमता का मात्रात्मक मूल्यांकन करना है। विशिष्ट पैरामीटर जो स्यूडोहिफे को हाइफे से अलग करते हैं, विवो पर्यावरण में एक परिसर में तीन आयामों में बढ़ने वाले जीवों में मूल्यांकन करना मुश्किल हो सकता है। यह विशेष रूप से सच है जब कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा बनाए गए दो-आयामी क्रॉस-सेक्शन को देखते हैं। इसलिए, यह स्क्रीनिंग विश्लेषण फिलामेंटस बनाम खमीर के रूप में बढ़ने वाले जीवों की पहचान करने पर केंद्रित है। त्रि-आयामी पुनर्निर्माण सहित अधिक गहन विश्लेषण का उपयोग करके अनुवर्ती अध्ययनों के लिए, इस विधि को खमीर, हाइफे और स्यूडोहिफे को भेदभाव करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

अल्बिकन्स के संदर्भ या उत्परिवर्ती तनाव में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति विवो (चित्रा 3 और चित्रा 4) में तनाव आकृति विज्ञान का सीधा पता लगाने की अनुमति देती है। सामान्य तौर पर, मात्रात्मक प्रकाश माइक्रोस्कोपी विश्लेषण सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है जब छवि में कुछ से कोई भी पिक्सेल संतृप्त नहीं होता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, हालांकि, छवि की संतृप्ति अक्सर विश्लेषण को सरल बनाती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्थानीयकरण पूरे सेल में समान नहीं है और अक्सर फिलामेंट्स की तुलना में मां खमीर में अधिक होता है। सौभाग्य से, मोर्फोजेनेसिस की जांच के लिए, सिग्नल का स्थानिक वितरण, इसकी तीव्रता के बजाय, परिणाम को परिभाषित करता है। इसलिए, जिन छवियों में कई पिक्सेल संतृप्त होते हैं, उन्हें प्राप्त करने से इस परख में मॉर्फोजेनेसिस को मापने की क्षमता में सुधार होता है।

विवो में मॉर्फोजेनेसिस के मूल्यांकन के महत्व को स्पष्ट करने के लिए, संदर्भ तनाव (एसएन 250) और दो उत्परिवर्ती के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं: एक में प्रतिलेखन कारक ईएफजी 1 की कमी है और दूसरे में एडेनिल साइक्लेज साइर 1 की कमी है। विट्रो में, इनमें से कोई भी उपभेद फिलामेंट्स^20,21 के रूप में ^{नहीं बढ़ता} है। जब आरपीएमआई माध्यम में 10% सीरम के साथ पूरक किया जाता है, तो संदर्भ तनाव तेजी से फिलामेंट्स बनाता है, जबकि ईएफजी1 ए और साइर 1ए ओ उपभेद नहीं करते हैं (चित्रा 3 और चित्रा 4)। इन स्थितियों के तहत, efg13 उत्परिवर्ती कुछ हद तक ध्रुवीकृत विकास प्रदर्शित करता है, जिसमें बेटी कोशिकाएं मां कोशिकाओं की तुलना में थोड़ी लम्बी होती हैं। यह फिलामेंटेशन की स्पष्ट परिभाषा का उपयोग करने के महत्व पर जोर देता है। ऐसी कोई भी परिभाषा डिफ़ॉल्ट रूप से मनमानी है, लेकिन फेनोटाइप के लगातार मूल्यांकन के लिए यह आवश्यक है। इन अध्ययनों के लिए, विकास के एक फिलामेंटस पैटर्न को एक जीव के रूप में परिभाषित किया गया है जिसमें बेटी कोशिका का सबसे लंबा आयाम मां कोशिका से दोगुना से अधिक है। इस परिभाषा का उपयोग करते हुए, लम्बी efg1Δ33कोशिकाएं फिलामेंटस नहीं हैं।

अपने इन विट्रो फेनोटाइप के अनुरूप, efg1 Δ32 विवो में एक महत्वपूर्ण फिलामेंटेशन दोष प्रदर्शित करता है: लगभग 9% efg133 कोशिकाएं विवो में फिलामेंट्स के रूप में बढ़ीं (चित्रा 3)। इसके विपरीत, 53% Cyr1Oउत्परिवर्ती कोशिकाएं विवो में फिलामेंट्स के रूप में बढ़ीं (चित्रा 4)। यद्यपि विवो में फिलामेंटेशन से गुजरने वाली साइर 1एओ उत्परिवर्ती कोशिकाओं की संख्या संदर्भ तनाव की तुलना में काफी कम थी, विवो में फिलामेंट्स बनाने के लिए साइर 1एओ म्यूटेंट की क्षमता विट्रो में मॉर्फोजेनेसिस की पूर्ण कमी से पर्याप्त परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करती है। नेत्रहीन रूप से, Cyr1Oउत्परिवर्ती द्वारा गठित फिलामेंट्स संदर्भ तनाव की तुलना में छोटे प्रतीत होते हैं। मात्रात्मक रूप से इसका मूल्यांकन करने के लिए, फिलामेंटस कोशिकाओं की वक्र पथ लंबाई को विवो छवियों (चित्रा 4 ई) के दो-आयामी प्रक्षेपण का उपयोग करके मापा गया था। संदर्भ तनाव के फिलामेंट्स की तुलना में साइर 1एओ फिलामेंट्स की औसत लंबाई 29% कम थी।

चित्र 1: संज्ञाहरण और टीकाकरण। (ए) प्रेरण कक्ष का उपयोग करके संज्ञाहरण का प्रेरण। (बी) एनेस्थीसिया को नाक शंकु का उपयोग करके बनाए रखा जाता है, जिससे माउस को आवश्यकतानुसार पुनर्स्थापित किया जा सकता है। (सी) बाल हटाने वाली क्रीम को कपास-टिंप एप्लिकेटर का उपयोग करके लगाया जाता है। एनेस्थीसिया के दौरान आंखों की सुरक्षा के लिए आई लुब्रिकेशन जेल लगाया गया है। (डी) दाहिने कान के बालों को प्रभावी ढंग से हटाना। अनुपचारित बाएं कान की तुलना करें। (ई) माउस कान में सी अल्बिकन्स का इंट्राडर्मल इंजेक्शन। कान को दो तरफा त्वचा टेप (फैशन टेप) के साथ लपेटे गए शंक्वाकार ट्यूब की नोक का उपयोग करके रखा जाता है। (एफ) इंट्राडर्मल इंजेक्शन को बंद करें। त्वचा में एक पीला बुलबुला बनता है, जो एक सफल इंट्राडर्मल प्लेसमेंट का संकेत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2: इमेजिंग के लिए तैयारी। (ए) इमेजिंग के लिए तैयार माइक्रोस्कोप चरण। एनेस्थीसिया नाक शंकु जगह में सुरक्षित है। लेंस खोलने को कवर करने वाले मंच पर एक कवरलिप टैप किया जाता है। टेप के अतिरिक्त टुकड़े उपलब्ध हैं। गर्म अवस्था को 37 डिग्री सेल्सियस (नहीं दिखाया गया) तक पूर्व-गर्म किया जाता है। (बी) एनेस्थेटाइज्ड माउस को एनेस्थीसिया नाक शंकु में रखना। (सी) माउस को थोड़ा घुमाया जाता है ताकि कान का किनारा जिसे टीका लगाया गया था, वह नीचे कवरस्लिप / उद्देश्य लेंस की ओर है। फिर कान को नीचे के कवरस्लिप के खिलाफ चपटा किया जाता है और कान के शीर्ष पर एक दूसरा कवरस्लिप रखकर सुरक्षित किया जाता है। (डी) माइक्रोस्कोप चरण के सापेक्ष कान को सुरक्षित करने के लिए शीर्ष कवरस्लिप को मंच पर टैप किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: इन विट्रो और विवो आकृति विज्ञान में efg13 उत्परिवर्ती तनाव। (ए) आरपीएमआई + 10% सीरम में 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ती कोशिकाओं द्वारा फिलामेंटेशन के इन विट्रो प्रेरण के बाद डब्ल्यूटी और ईएफजी1 एओ म्यूटेंट उपभेदों की वाइडफील्ड छवि। स्केल बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। देखने की सुविधा के लिए फोटो एडिटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इमेज कंट्रास्ट को समायोजित किया गया था। (बी) विट्रो में फिलामेंटेशन का प्रतिशत डब्ल्यूटी और ईएफजी 1एओ म्यूटेंट उपभेदों में देखा गया। Und = अनिर्धारित (कोई फिलामेंट्स का पता नहीं चला)। बार ऊंचाई तीन स्वतंत्र प्रयोगों से फिलामेंटस कोशिकाओं के औसत प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है जिसमें कम से कम 100 कोशिकाओं को परिमाणित किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं (परिणाम छात्र के टी-टेस्ट, पी < 0.001 द्वारा तुलना की जाती है)। (ग) टीकाकरण के बाद विवो 24 घंटे में डब्ल्यूटी (हरा) और ईएफजी1एक्यूम्यूटेंट (लाल) का कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ बढ़ रहा है। तीर efg13 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के उदाहरणों को इंगित करते हैं जो "फिलामेंटस" की हमारी परिभाषा को पूरा करते हैं। स्केल बार 50 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (D) WT और efg133 उत्परिवर्ती उपभेदों में देखे गए विवो में फिलामेंटेशन का प्रतिशत। बार ऊंचाई दो स्वतंत्र प्रयोगों से फिलामेंटस कोशिकाओं के औसत प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का संकेत देती हैं (परिणाम छात्र के टी-टेस्ट, पी < 0.001 द्वारा तुलना की जाती है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 4: इन विट्रो और विवो आकृति विज्ञान में साइर1एओउत्परिवर्ती स्ट्रेन की आकृति विज्ञान में, आरपीएमआई + 10% सीरम में 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं द्वारा फिलामेंटेशन के इन विट्रो प्रेरण के बाद साइर1 ए म्यूटेंट स्ट्रेन की वाइडफील्ड छवि। स्केल बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करता है। देखने की सुविधा के लिए फोटो एडिटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इमेज कंट्रास्ट को समायोजित किया गया था। (बी) विट्रो में फिलामेंटेशन का प्रतिशत डब्ल्यूटी और साइर 1एओ म्यूटेंट उपभेदों में देखा गया। Und = अनिर्धारित (कोई फिलामेंट्स का पता नहीं चला)। बार ऊंचाई तीन स्वतंत्र प्रयोगों से फिलामेंटस कोशिकाओं के औसत प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है जिसमें कम से कम 100 कोशिकाओं को परिमाणित किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का संकेत देती हैं (परिणाम छात्र के टी-टेस्ट, पी < 0.001 द्वारा तुलना की जाती है)। (ग) टीकाकरण के बाद विवो 24 घंटे में डब्ल्यूटी (हरा) और साइर1एक्यूम्यूटेंट (लाल) का कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ बढ़ रहा है। स्केल बार 50 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) विवो में फिलामेंटेशन का प्रतिशत डब्ल्यूटी और साइर 1एओ म्यूटेंट उपभेदों में देखा गया। बार ऊंचाई दो स्वतंत्र प्रयोगों से फिलामेंटस कोशिकाओं के औसत प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का संकेत देती हैं (परिणाम छात्र के टी-टेस्ट, पी < 0.001 द्वारा तुलना की जाती है)। (ई) विवो में फिलामेंट लंबाई का वितरण, जैसा कि जेड-स्टैक के दो-आयामी प्रक्षेपण में वक्र पथ लंबाई द्वारा मापा जाता है। प्रत्येक बिंदु एक फिलामेंट की लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है। खमीर के रूप में बढ़ने वाली कोशिकाओं को इस विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया था। बार औसत फिलामेंट लंबाई को इंगित करता है। मान-व्हिटनी यू परीक्षण (पी < 0.001) का उपयोग करके विश्लेषण किए जाने पर लंबाई का वितरण काफी भिन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

अल्बिकन्स जीवों की छवियों को प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है क्योंकि वे स्तनधारी मेजबान के ऊतक के भीतर बढ़ते हैं, इस प्रकार हमें सक्रिय संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस फेनोटाइप का मूल्यांकन करने की अनुमति मिलती है। अल्बिकन्स रोगजनन के लिए मॉर्फोजेनेसिस की प्रक्रिया केंद्रीय है और विभिन्न प्रकार के इन विट्रो परख ^2,3,4 का उपयोग करके व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। हालांकि, कोई भी इन विट्रो परख मेजबान के जटिल जैव रासायनिक और संरचनात्मक वातावरण को पूरी तरह से मॉडल नहीं कर सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस में शामिल जीन की पहचान करने के लिए सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती की एक श्रृंखला / पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए विवो इमेजिंग सिस्टम में इसके उपयोग पर केंद्रित है। विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले सी अल्बिकन्स उपभेदों का उपयोग हमें संदर्भ तनाव की तुलना में सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों के विवो मोर्फोजेनेसिस में मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। संक्रमण के एक ही क्षेत्र के भीतर संदर्भ तनाव के लिए उत्परिवर्ती में मोर्फोजेनेसिस की तुलना यह सुनिश्चित करती है कि जीव समान वातावरण के संपर्क में हैं। यह फिलामेंटेशन से गुजरने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत के मात्रात्मक माप के साथ-साथ फिलामेंटेशन की सीमा के लिए अनुमति देता है। संदर्भ तनाव के लिए उत्परिवर्ती तनाव (ओं) के माप का सामान्यीकरण हमें एक उत्परिवर्ती के प्रदर्शन की दूसरे में बेहतर तुलना करने की अनुमति देता है।

यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम इन विट्रो और विवो फेनोटाइप्स के बीच एक महत्वपूर्ण विसंगति की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। अल्बिकन्स ईएफजी 1एओ म्यूटेंट स्ट्रेन का उपयोग अक्सर मॉर्फोजेनेसिस परख के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है क्योंकि यह लगभग सभी इन विट्रो ^{स्थितियों} में फिलामेंट करने में विफल रहता है। यद्यपि विवो के परिणाम इन विट्रो परिणामों के समान थे, यहां तक कि इस गंभीर रूप से बाधित तनाव ने कभी-कभी मेजबान ऊतक वातावरण में फिलामेंट्स का निर्माण किया (चित्रा 3)। यह मॉर्फोजेनेसिस को ट्रिगर करने में मेजबान वातावरण की ताकत पर जोर देता है।

इसके विपरीत, साइर 1एओ म्यूटेंट स्ट्रेन इन विट्रो और विवो विकास के बीच पर्याप्त मतभेद को दर्शाता है; यद्यपि उत्परिवर्ती कोशिकाओं में से कोई भी विट्रो में फिलामेंटेशन से नहीं गुजरता है, लगभग आधी कोशिकाएं विवो (चित्रा 4)^10,21 में फिलामेंट्स के रूप में ^{बढ़ती} हैं। दिलचस्प बात यह है कि ये फिलामेंट्स संदर्भ तनाव द्वारा गठित लोगों की तुलना में काफी कम थे, यह सुझाव देते हुए कि CYR1 या तो फिलामेंट विकास की दर या फिलामेंटस फेनोटाइप को बनाए रखने की क्षमता में योगदान देता है। फिलामेंट लंबाई के विश्लेषण की सुविधा के लिए, फिलामेंट्स की वक्र पथ लंबाई को छवियों के दो-आयामी प्रक्षेपण का उपयोग करके मापा गया था। तीन आयामों में बढ़ने वाले फिलामेंट्स के दो-आयामी अनुमानों में, एक अक्ष पर बढ़ने वाला कोई भी फिलामेंट जो xy विमान के समानांतर नहीं है, इसकी वास्तविक लंबाई से कम के रूप में प्रोजेक्ट करेगा। जैसा कि संदर्भ तनाव के लिए यह फोरशॉर्टिंग भी होती है, दो-आयामी प्रक्षेपण में फिलामेंट लंबाई के वितरण का मूल्यांकन अभी भी संदर्भ और उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच मात्रात्मक तुलना की अनुमति देता है। तीन आयामों के बजाय दो में फिलामेंट लंबाई के विश्लेषण के लिए कम गहन छवि विश्लेषण की आवश्यकता होती है; इस प्रकार, यह एक विशिष्ट डेस्कटॉप कंप्यूटर पर अपेक्षाकृत जल्दी से किया जा सकता है। इस सरल विश्लेषण का उपयोग करने से एक स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में फिलामेंट लंबाई वितरण को शामिल करने की अनुमति मिलती है, जिससे थ्रूपुट में पर्याप्त देरी के बिना मोर्फोजेनेसिस से गुजरने के लिए प्रत्येक उत्परिवर्ती की क्षमता की अधिक बारीक समझ मिलती है।

यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि अध्ययन डीबीए 2 / एन चूहों का उपयोग करके किए गए थे, जिनके पूरक प्रणाली में दोष है जिससे सी अल्बिकन्स संक्रमण²² की साइट पर न्यूट्रोफिल की भर्ती करने में विफलता होती है। इन अध्ययनों का लक्ष्य मेजबान ऊतक के भीतर सी अल्बिकन्स फिलामेंटेशन के विनियमन के तंत्र की जांच करना था। इसलिए डीबीए 2 / एन चूहों का उपयोग एक व्यक्तिगत तनाव की संवेदनशीलता या न्यूट्रोफिल के प्रतिरोध के कारण परिणामों को भ्रमित करने से बचने के लिए किया गया था। चूंकि न्यूट्रोफिल एंटी-सी अल्बिकन्स प्रतिक्रिया फिलामेंटेशन²³ को प्रभावित कर सकती है, संक्रमण की साइट पर न्यूट्रोफिल भर्ती एक मॉर्फोजेनेसिस परख के परिणामों को प्रभावित कर सकती है। यदि एक तनाव विवो में फिलामेंटिंग करने में सक्षम है, लेकिन न्यूट्रोफिल मौजूद होने पर फिलामेंटेशन से दृढ़ता से बाधित होता है, तो डीबीए 2 / एन चूहों में फिलामेंटेशन का पता लगाया जाएगा, लेकिन बरकरार न्यूट्रोफिल केमोटैक्सिस वाले चूहों का उपयोग करते समय देखा जाने की संभावना नहीं होगी। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय मेजबान के रूप में उपयोग किए जाने वाले माउस का तनाव एक महत्वपूर्ण कारक है।

यह अवलोकन कि efg1ΔE उत्परिवर्ती तनाव विवो में फिलामेंट करने में विफल रहता है, मेजबान न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं से संबंधित होने की संभावना नहीं है, क्योंकि यह तनाव विट्रो में फिलामेंट करने में भी विफल रहता है। विवो में साइर1एओस्ट्रेन के साथ देखा गया फिलामेंटेशन विट्रो में फिलामेंटेशन में विफलता के साथ अलग है। अल्बिकन्स संक्रमण के ज़ेब्राफिश मॉडल के डेटा से संकेत मिलता है कि मॉर्फोजेनेसिस²⁴ की रोकथाम में न्यूट्रोफिल का जवाब देना महत्वपूर्ण है। इसलिए, डीबीए 2 / एन चूहों का उपयोग, जिनमें न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं की कमी होती है, इन विट्रो की तुलना में विवो में साइर 1ए के फिलामेंटेशन में वृद्धि के लिए जिम्मेदार होने की संभावना नहीं है। फिर भी, विवो वातावरण स्पष्ट रूप से Cyr1E3तनाव के मोर्फोजेनेसिस को प्रभावित कर रहा है; इस प्रकार, इस तनाव की आगे की जांच सक्रिय संक्रमण के दौरान सी अल्बिकन्स मॉर्फोजेनेसिस के विनियमन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को भविष्य के अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले Cyr1E34स्ट्रेन जैसे उपभेदों की पहचान करने के लिए एक स्क्रीनिंग परख के रूप में डिज़ाइन किया गया है।

कम प्रवाह गैस संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए, बी) के लिए बहुत उपयोगी है। इस प्रोटोकॉल के प्रारंभिक विकास के दौरान, चूहों को जाइलाज़िन के साथ मिश्रित केटामाइन के इंजेक्शन एनेस्थेटिक कॉकटेल का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड किया गया था। हालांकि उस एनेस्थेटिक विधि के साथ सीमित इमेजिंग करना संभव था, संज्ञाहरण की अवधि अप्रत्याशित थी, इमेजिंग के दौरान एनेस्थीसिया से ठीक होने वाले माउस से बचने के लिए इमेजिंग सत्रों को जल्दी से समाप्त करने की आवश्यकता थी। पारंपरिक साँस लेने वाले एनेस्थेटिक सिस्टम भारी होते हैं और एनेस्थेटिक गैसों के प्रवाह की उच्च दर की आवश्यकता होती है, अक्सर उन्हें फ्यूम हुड के भीतर उपयोग करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, पारंपरिक इनहेल्ड एनेस्थेटिक सिस्टम को अनजाने में जांचकर्ताओं को एनेस्थेटिक एजेंटों के संपर्क में लाए बिना कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की अंतरिक्ष बाधाओं के साथ उपयोग करना बहुत मुश्किल होगा। कम प्रवाह वाले एनेस्थेटिक सिस्टम का उपयोग अन्वेषक के लिए एक सुरक्षित वातावरण बनाए रखते हुए जानवर के लगातार संज्ञाहरण की अनुमति देता है। कम प्रवाह वाला नोजकोन टीकाकरण और माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए जानवर की आसान स्थिति की अनुमति देता है। छोटे-कैलिबर, कम मात्रा वाले वितरण ट्यूबिंग अपेक्षाकृत लंबी ट्यूबों के उपयोग की अनुमति देता है, जो संज्ञाहरण मशीन को पर्याप्त दूरी पर रखने में सक्षम बनाता है ताकि माइक्रोस्कोपी में हस्तक्षेप न हो।

विशिष्ट माउस चाउ में मौजूद क्लोरोफिल महत्वपूर्ण ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस²⁵ की ओर जाता है। यह छवियों में पर्याप्त शोर पैदा करता है, जिससे उच्च गुणवत्ता वाले, उच्च-स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। जब जानवरों को इमेजिंग से पहले 7 दिनों के लिए क्लोरोफिल-मुक्त चाउ खिलाया गया था, तो ऑटोफ्लोरेसेंस से पृष्ठभूमि ऊतक में काफी कम हो गई थी, लेकिन बालों में जमा क्लोरोफिल समस्याग्रस्त बना रहा। ओवर-द-काउंटर रासायनिक डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करके पिने पर बालों को हटाना बालों में ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने में प्रभावी है (चित्रा 1 सी, डी)। इस प्रकार, क्लोरोफिल-मुक्त चाउ और पर्याप्त बाल हटाने के संयोजन ने ऑटोफ्लोरेसेंस को काफी हद तक कम कर दिया और नाटकीय रूप से छवि की गुणवत्ता में सुधार किया। क्योंकि इमेजिंग से पहले बालों को कान से हटा दिया जाता है, जानवर के बालों का रंग इस प्रणाली को प्रभावित नहीं करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग बीएएलबी /सी (सफेद), सी 57बीएल / 6 (काला), और डीबीए 2 / एन (भूरे) चूहों में सी अल्बिकन्स संक्रमण का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। प्रोटोकॉल का उपयोग सी 57बीएल / 6 नॉकआउट चूहों के साथ भी किया जा सकता है जो विभिन्न मेजबान जीनों में कमी रखते हैं; यह भविष्य की जांच की अनुमति देगा कि स्तनधारी मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली फिलामेंटेशन को कैसे प्रभावित करती है। इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं की गई इस मॉडल की एक विशेषता यह है कि, क्योंकि यह इमेजिंग सिस्टम गैर-इनवेसिव है, एक ही जानवर को कई दिनों में बार-बार चित्रित किया जा सकता है, जिससे समय के साथ व्यक्तिगत संक्रमण की प्रगति का पालन करने की अनुमति मिलती है। यह सुविधा मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत पर भविष्य के अध्ययनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएगी।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक जीवित स्तनधारी मेजबान के ऊतक में बढ़ने वाले सी अल्बिकन्स की उच्च-स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियां होती हैं, जिससे उत्परिवर्ती उपभेदों ^8,9,10 में मॉर्फोजेनेसिस के सटीक मूल्यांकन की अनुमति मिलती है। यहां प्रस्तुत परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती की लाइब्रेरी को स्क्रीन करने के लिए कैसे किया जा सकता है। अल्बिकन्स उत्परिवर्ती का आज तक परीक्षण किया गया है, विट्रो में मॉर्फोजेनेसिस में ज्ञात दोषों वाले उत्परिवर्ती का एक बड़ा हिस्सा आसानी से विवो ^9,10 में फिलामेंटेशन से गुजरता है। यह सी अल्बिकन्स रोगजनन के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों में इस तरह के विवो सिस्टम को शामिल करने के महत्व पर प्रकाश डालता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान 1आर01एआई 33409 और बाल रोग विभाग, कार्वर कॉलेज ऑफ मेडिसिन, आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 coverslips	Thermo-Fisher	20811	large enough to cover the universal stage opening
0.1 mL Insulin syringes	EXELint	26018	Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G
3.7% formaldehyde in dPBS	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% Ethanol/30% water	Decon Laboratories	A05061001A
Alcohol prep pads	Covidien	5110	Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol
C.albicans reference strain and experimental strains	SN250	FGSC Online Catalog	The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.
Chlorophyl free mouse chow	Envigo	2920x
Computer	Dell	Optiplex 7050	Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.
Cotton tip applicator	Pro Advantage	76200
DBA2/N (6-12 week old mice)			BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)	local pharmacy or grocery store		Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	Must be sterile; open a new container for every experiment
Fetal bovine serum	Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
Gauze pad	Pro Advantage	P157112
Gel eye lurbicant	local pharmacy or grocery store
ImageJ or FIJI analysis software	NIH	ImageJ (FIJI)
Isoflurane	Akorn	J119005
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens	Leica	DMi8 (SP8)	The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair hair remover lotion	local pharmacy or grocery store		Over the counter depilatory cream
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids			Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)
Pressure sensitive laboratory tape	Tape & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640 cell culture medium	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes	Falcon	352196	To safely hold the animals ear during injectinos

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References

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Immunology and Infection

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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