Denne protokol tillader isolering af Epstein-Barr-viruspartikler fra den humane P3HR1-cellelinje ved inducering af den virale lytiske cyklus med phorbol 12-myristat 13-acetat. DNA ekstraheres efterfølgende fra det virale præparat og udsættes for PCR i realtid for at kvantificere den virale partikelkoncentration.
Epstein-Barr-viruset (EBV), formelt betegnet som Human herpesvirus 4 (HHV-4), er den første isolerede humane tumorvirus. Næsten 90-95% af verdens voksne befolkning er inficeret af EBV. Med de seneste fremskridt inden for molekylærbiologi og immunologi har anvendelsen af både in vitro- og in vivo-eksperimentelle modeller givet dyb og meningsfuld indsigt i patogenesen af EBV i mange sygdomme såvel som i EBV-associeret tumorigenese. Formålet med dette visualiserede eksperimentpapir er at give et overblik over isoleringen af EBV-virale partikler fra celler i P3HR1-cellelinjen efterfulgt af kvantificering af det virale præparat. P3HR1-celler, oprindeligt isoleret fra et humant Burkitt-lymfom, kan producere en P3HR1-virus, som er en type 2 EBV-stamme. EBV-lytisk cyklus kan induceres i disse P3HR1-celler ved behandling med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA), hvilket giver EBV-virale partikler.
Ved anvendelse af denne protokol til isolering af EBV-partikler dyrkes P3HR1-celler i 5 dage ved 37 °C og 5% CO2 i komplet RPMI-1640-medium indeholdende 35 ng/ml PMA. Derefter centrifugeres kulturmediet med en hastighed på 120 x g i 8 minutter for at pelletere cellerne. Den virusholdige supernatant opsamles derefter og spindes ned med en hastighed på 16.000 x g i 90 minutter for at pelletere EBV-partiklerne. Den virale pellet resuspenderes derefter i et komplet RPMI-1640-medium. Dette efterfølges af DNA-ekstraktion og kvantitativ realtids-PCR for at vurdere koncentrationen af EBV-partikler i præparatet.
Epstein-Barr-virussen (EBV) er den første humane tumorvirus, der er blevet isoleret1. EBV, formelt benævnt Human herpesvirus 4 (HHV-4)2, er en del af gamma herpesvirus underfamilien af herpesvirusfamilien og er prototypen af Lymphocryptovirus-slægten. Næsten 90-95% af verdens voksne befolkning er inficeret af virussen3. I de fleste tilfælde forekommer indledende infektion inden for de første 3 år af livet og er asymptomatisk, men hvis infektion opstår senere i ungdomsårene, kan det give anledning til en sygdom kaldet infektiøs mononukleose4. EBV er i stand til at inficere hvilende B-celler, der får dem til at blive proliferative B-lymfoblaster, hvor virussen etablerer og opretholder en latent inficeret tilstand5. EBV kan genaktiveres når som helst og dermed føre til tilbagevendende infektioner6.
I løbet af de sidste 50 år er sammenhængen mellem nogle vira og udviklingen af menneskelige maligniteter blevet mere og mere tydelig, og i dag anslås det, at 15% til 20% af alle humane kræftformer er relateret til virusinfektioner7. Herpesvirus, herunder EBV, er nogle af de bedst undersøgte eksempler på disse typer tumorvirus8. Faktisk kan EBV forårsage mange typer humane maligniteter, såsom Burkitt lymfom (BL), Hodgkin lymfom (HL), diffust stort B-celle lymfom og lymfoproliferative sygdomme hos immunkompromitterede værter 9,10. EBV har også vist sig at være forbundet med udviklingen af systemiske autoimmune sygdomme. Nogle eksempler på disse autoimmune lidelser er reumatoid arthritis (RA), polymyositis-dermatomyositis (PM-DM), systemisk lupus erythematosus (SLE), blandet bindevævssygdom (MCTD) og Sjögrens syndrom (SS)11. EBV er også forbundet med udviklingen af inflammatorisk tarmsygdom (IBD)12.
Mange af disse sygdomme kan studeres eller modelleres ved hjælp af cellekultur, mus eller andre organismer, der er inficeret med EBV. Derfor er EBV-partikler nødvendige for at inficere celler eller organismer, hvad enten det er in vitro eller in vivo-modeller 13,14,15,16, og derfor er det nødvendigt at udvikle en teknik, der tillader isolering af virale partikler til en lav pris. Den protokol, der er beskrevet her, giver retningslinjer for en nem måde at pålideligt isolere EBV-partikler fra en relativt tilgængelig cellelinje og kvantificere partiklerne ved hjælp af realtids-PCR, som er omkostningseffektiv og let tilgængelig for de fleste laboratorier. Dette er i sammenligning med flere andre metoder, der er beskrevet for at isolere EBV fra forskellige cellelinjer17,18,19,20.
P3HR-1 er en BL-cellelinje, der vokser i suspension og er latent inficeret med en EBV type 2-stamme. Denne cellelinje er en EBV-producent og kan induceres til at producere virale partikler. Målet med dette manuskript er at fremvise en metode, der tillader isolering af EBV-partikler fra P3HR-1-cellelinjen, efterfulgt af kvantificering af den virale bestand, der senere kan bruges til både in vitro – og in vivo EBV-eksperimentelle modeller.
Produktionen af EBV-partikler er nødvendig for at forstå biologien af denne virus såvel som dens tilknyttede sygdomme. Her beskrev vi produktionen af disse partikler fra P3HR-1 cellelinjen. Denne cellelinje er ikke den eneste EBV-producentlinje; faktisk er EBV-partikler også blevet isoleret fra B95-8 celler21,22 samt Raji-cellelinjen18,19. EBV-lytisk cyklus er blevet induceret i disse celler med n-bu…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette arbejde blev støttet af tilskud til ER fra Asmar Research Fund, det libanesiske nationale råd for videnskabelig forskning (L-CNRS) og Medical Practice Plan (MPP) ved American University of Beirut.
0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
DMSO | Amresco | 0231 | |
DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
Phenol | VWR | 20599.297 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |