Isolering og kvantifisering av Epstein-Barr-virus fra P3HR1-cellelinjen

Summary

Denne protokollen tillater isolering av Epstein-Barr-viruspartikler fra den humane P3HR1-cellelinjen ved indusering av den virale lytiske syklusen med phorbol 12-myristat 13-acetat. DNA blir deretter ekstrahert fra viruspreparatet og utsatt for sanntids PCR for å kvantifisere viruspartikkelkonsentrasjonen.

Abstract

Epstein-Barr-viruset (EBV), formelt betegnet som Human herpesvirus 4 (HHV-4), er det første isolerte humane tumorviruset. Nesten 90-95% av verdens voksne befolkning er smittet av EBV. Med de siste fremskrittene innen molekylærbiologi og immunologi har anvendelsen av både in vitro og in vivo eksperimentelle modeller gitt dyp og meningsfull innsikt i patogenesen av EBV i mange sykdommer, samt i EBV-assosiert tumorigenese. Målet med dette visualiserte eksperimentpapiret er å gi en oversikt over isoleringen av EBV-viruspartikler fra celler i P3HR1-cellelinjen, etterfulgt av kvantifisering av viruspreparatet. P3HR1-celler, opprinnelig isolert fra et humant Burkitt-lymfom, kan produsere et P3HR1-virus, som er en type 2 EBV-stamme. EBV-lytisk syklus kan induseres i disse P3HR1-cellene ved behandling med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA), som gir EBV-viruspartikler.

Ved hjelp av denne protokollen for isolering av EBV-partikler, dyrkes P3HR1-celler i 5 dager ved 37 ° C og 5% CO₂ i komplett RPMI-1640 medium inneholdende 35 ng / ml PMA. Deretter sentrifugeres kulturmediet med en hastighet på 120 x g i 8 minutter for å pelletere cellene. Den virusholdige supernatanten samles deretter opp og spinnes ned med en hastighet på 16 000 x g i 90 minutter for å pelletere EBV-partiklene. Den virale pelleten blir deretter resuspendert i et komplett RPMI-1640 medium. Dette etterfølges av DNA-ekstraksjon og kvantitativ sanntids-PCR for å vurdere konsentrasjonen av EBV-partikler i preparatet.

Introduction

Epstein-Barr-viruset (EBV) er det første humane tumorviruset som har blitt isolert¹. EBV, formelt referert til som Human herpesvirus 4 (HHV-4) ², er en del av gamma herpes virus underfamilien av herpes virus familien og er prototypen av lymfocryptovirus slekten. Nesten 90-95% av verdens voksne befolkning er smittet av viruset³. I de fleste tilfeller oppstår første infeksjon i løpet av de første 3 årene av livet og er asymptomatisk, men hvis infeksjon oppstår senere i ungdomsårene, kan det gi opphav til en sykdom referert til som smittsom mononukleose⁴. EBV er i stand til å infisere hvilende B-celler som induserer dem til å bli proliferative B-lymfoblaster der viruset etablerer og opprettholder en latent infisert tilstand⁵. EBV kan reaktiveres når som helst og dermed føre til tilbakevendende infeksjoner⁶.

I løpet av de siste 50 årene har sammenhengen mellom noen virus og utviklingen av humane maligniteter blitt stadig tydeligere, og i dag anslås det at 15% til 20% av alle humane kreftformer er relatert til virusinfeksjoner⁷. Herpesvirusene, inkludert EBV, er noen av de best studerte eksemplene på disse typer tumorvirus⁸. Faktisk kan EBV forårsake mange typer humane maligniteter, som Burkitt lymfom (BL), Hodgkin lymfom (HL), diffust storcellet B-celle lymfom og lymfoproliferative sykdommer i immunkompromitterte verter ^9,10. EBV har også vist seg å være assosiert med utvikling av systemiske autoimmune sykdommer. Noen eksempler på disse autoimmune sykdommene er revmatoid artritt (RA), polymyositt-dermatomyositt (PM-DM), systemisk lupus erythematosus (SLE), blandet bindevevssykdom (MCTD) og Sjøgrens syndrom (SS)¹¹. EBV er også forbundet med utvikling av inflammatorisk tarmsykdom (IBD)¹².

Mange av disse sykdommene kan studeres eller modelleres ved hjelp av cellekultur, mus eller andre organismer som er infisert med EBV. Det er derfor EBV-partikler er nødvendig for å infisere celler eller organismer, enten in vitro eller in vivo modeller^13,14,15,16, derav behovet for å utvikle en teknikk som tillater isolering av virale partikler til en lav pris. Protokollen beskrevet her gir retningslinjer for en enkel måte å pålitelig isolere EBV-partikler fra en relativt tilgjengelig cellelinje og kvantifisere partiklene ved hjelp av sanntids PCR, som er kostnadseffektivt og lett tilgjengelig for de fleste laboratorier. Dette er i forhold til flere andre metoder som er beskrevet for å isolere EBV fra forskjellige cellelinjer^17,18,19,20.

P3HR-1 er en BL-cellelinje som vokser i suspensjon og er latent infisert med en EBV type 2-stamme. Denne cellelinjen er en EBV-produsent og kan induseres til å produsere virale partikler. Målet med dette manuskriptet er å vise frem en metode som tillater isolering av EBV-partikler fra P3HR-1-cellelinjen, etterfulgt av kvantifisering av virusstammen som senere kan brukes til både in vitro og in vivo EBV eksperimentelle modeller.

Protocol

MERK: EBV bør betraktes som et potensielt biofarlig materiale, og bør derfor håndteres under Biosafety Level 2 inneslutning eller høyere. En laboratoriefrakk samt hansker bør brukes. Hvis det er potensial for eksponering for sprut, bør øyevern også vurderes. Følgende prosedyre bør utføres i et biologisk sikkerhetsskap. 1. Telle P3HR1-cellene Sentrifugering og resuspenderende cellerOverfør cellesuspensjonen fra en 100 mm kulturplate (eller T-25 kol…

Representative Results

Målet med denne prosedyren er å isolere EBV-partikler i en suspensjon med kjent viral titer, som senere kan brukes til å modellere EBV-infeksjon. Det er derfor av største betydning å bruke optimale konsentrasjoner av de forskjellige reagensene for å oppnå høyest EBV-utbytte ut av prosedyren. En optimaliseringsstudie ble utført for å bestemme konsentrasjonene av PMA og DMSO som ville gi det høyeste antallet EBV-partikler (figur 2). En DMSO-konsentrasjon …

Discussion

Produksjonen av EBV-partikler er nødvendig for å forstå biologien til dette viruset, så vel som dets tilknyttede sykdommer. Her beskrev vi produksjonen av disse partiklene fra P3HR-1-cellelinjen. Denne cellelinjen er ikke den eneste EBV-produsentlinjen; Faktisk har EBV-partikler også blitt isolert fra B95-8-celler^21,22 samt Raji-cellelinjen^18,19. EBV-lytisk syklus har blitt indusert i disse cellene …

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100×20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121