Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fluorescerende in situ hybridisering og 5-ethynyl-2'-deoxyuridin mærkning for stamlignende celler i hydrozoan vandmænd Cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Her beskriver vi en protokol til visualisering af stammelignende prolifererende celler i vandmændene Cladonema. Helmonteret fluorescerende in situ-hybridisering med en stamcellemarkør muliggør påvisning af stamlignende celler, og 5-ethynyl-2'-deoxyuridinmærkning muliggør identifikation af prolifererende celler. Sammen kan aktivt prolifererende stamlignende celler detekteres.

Abstract

Cnidarians, herunder havanemoner, koraller og vandmænd, udviser forskellig morfologi og livsstil, der manifesteres i sessile polypper og frisvømmende medusae. Som eksemplificeret i etablerede modeller som Hydra og Nematostella bidrager stamceller og / eller proliferative celler til udvikling og regenerering af cnidarian polypper. Imidlertid er de underliggende cellulære mekanismer i de fleste vandmænd, især på medusa-stadiet, stort set uklare, og det er derfor kritisk at udvikle en robust metode til identifikation af specifikke celletyper. Dette papir beskriver en protokol til visualisering af stammelignende prolifererende celler i hydrozoan vandmænd Cladonema pacificum. Cladonema medusae besidder forgrenede tentakler, der kontinuerligt vokser og opretholder regenerativ kapacitet i hele deres voksne fase, hvilket giver en unik platform til at studere de cellulære mekanismer, der er orkestreret af prolifererende og / eller stamlignende celler. Helmonteret fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) ved hjælp af en stamcellemarkør muliggør påvisning af stamlignende celler, mens pulsmærkning med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU), en S-fasemarkør, muliggør identifikation af prolifererende celler. Ved at kombinere både FISH- og EdU-mærkning kan vi detektere aktivt prolifererende stamceller på faste dyr, og denne teknik kan anvendes bredt på andre dyr, herunder ikke-model vandmændarter.

Introduction

Cnidaria betragtes som en basalt forgrenet metazoan phylum indeholdende dyr med nerver og muskler, hvilket placerer dem i en unik position til at forstå udviklingen af dyreudvikling og fysiologi 1,2. Cnidarians er kategoriseret i to hovedgrupper: Anthozoa (fx havanemoner og koraller) har kun planula larver og sessile polyp stadier, mens Medusozoa (medlemmer af Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa og Cubozoa) typisk har form af fritsvømmende medusae eller vandmænd samt planula larver og polypper. Cnidarians udviser almindeligvis høj regenerativ kapacitet, og deres underliggende cellulære mekanismer, især deres besiddelse af voksne stamceller og proliferative celler, har tiltrukket sig stor opmærksomhed 3,4. Oprindeligt identificeret i Hydra er hydrozoanstamceller placeret i de interstitielle rum mellem ektodermale epitelceller og kaldes almindeligvis interstitielle celler eller i-celler3.

Hydrozoan i-celler deler fælles egenskaber, der inkluderer multipotens, ekspression af bredt bevarede stamcellemarkører (f.eks. Nanos, Piwi, Vasa) og migrationspotentiale 3,5,6,7,8. Som funktionelle stamceller er i-celler i vid udstrækning involveret i hydrozodyrs udvikling, fysiologi og miljørespons, hvilket vidner om deres høje regenerative kapacitet og plasticitet3. Mens stamceller, der ligner i-celler, ikke er blevet identificeret uden for hydrozoer, selv i den etablerede modelart Nematostella, er proliferative celler stadig involveret i vedligeholdelse og regenerering af somatisk væv samt kimlinjen9. Da undersøgelser i cnidarian udvikling og regenerering overvejende er blevet udført på polyp-type dyr som Hydra, Hydractinia og Nematostella, forbliver den cellulære dynamik og funktioner af stamceller i vandmænd stort set uadresseret.

Hydrozoan vandmænd Clytia hemisphaerica , en kosmopolitisk vandmandsart med forskellige levesteder rundt om i verden, herunder Middelhavet og Nordamerika, er blevet brugt som et eksperimentelt modeldyr i flere udviklings- og evolutionære undersøgelser10. Med sin lille størrelse, lette håndtering og store æg er Clytia velegnet til laboratorievedligeholdelse samt til introduktion af genetiske værktøjer som de nyligt etablerede transgenese- og knockout-metoder11, hvilket åbner mulighed for detaljeret analyse af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for vandmandsbiologi. I Clytia medusa tentakel er i-celler lokaliseret i den proksimale region, kaldet pæren, og forfædre som nematoblaster migrerer til den distale spids, mens de differentierer sig i forskellige celletyper, herunder nematocytter12.

Under regenerering af Clytia manubrium migrerer det orale organ af vandmænd, Nanos1+ i-celler, der er til stede i gonaderne, til det område, hvor manubrium går tabt som reaktion på skader og deltager i regenerering af manubrium7. Disse fund understøtter ideen om, at i-celler i Clytia også opfører sig som funktionelle stamceller, der er involveret i morfogenese og regenerering. I betragtning af at i-cellernes egenskaber adskiller sig blandt repræsentative polyp-type dyr som Hydra og Hydractinia3, er det imidlertid muligt, at stamcellernes egenskaber og funktioner er diversificeret blandt vandmændarter. Med undtagelse af Clytia er eksperimentelle teknikker desuden blevet begrænset for andre vandmænd, og den detaljerede dynamik i proliferative celler og stamceller er ukendt13.

Hydrozoan vandmænd Cladonema pacificum er en ny modelorganisme, der kan opbevares i et laboratoriemiljø uden vandpumpe eller filtreringssystem. Cladonema medusa har forgrenede tentakler, et fælles kendetegn i Cladonematidae-familien, og et fotoreceptororgan kaldet ocellus på det ektodermale lag nær pæren14. Tentakelforgreningsprocessen sker på et nyt forgreningssted, der vises langs den adaksiale side af tentaklen. Over tid fortsætter tentaklerne med at forlænge og forgrene sig, hvor de ældre grene skubbes ud mod spidsen15. Derudover kan Cladonema tentakler regenerere inden for få dage efter amputation. Nylige undersøgelser har antydet rollen som prolifererende celler og stamlignende celler i tentakelforgrening og regenerering i Cladonema16,17. Men mens konventionel in situ hybridisering (ISH) er blevet brugt til at visualisere genekspression i Cladonema, på grund af dens lave opløsning, er det i øjeblikket vanskeligt at observere stamcelledynamik på celleniveau i detaljer.

Dette papir beskriver en metode til visualisering af stamlignende celler i Cladonema af FISH og co-farvning med EdU, en markør for celleproliferation18. Vi visualiserer ekspressionsmønsteret for Nanos1, en stamcellemarkør 5,17, af FISH, som gør det muligt at identificere stamlignende cellefordeling på enkeltcelleniveau. Derudover gør co-farvning af Nanos1-ekspression med EdU-mærkning det muligt at skelne aktivt prolifererende stamlignende celler. Denne metode til overvågning af både stamceller og proliferative celler kan anvendes på en lang række undersøgelsesområder, herunder tenakelforgrening, vævshomeostase og organregenerering i Cladonema, og en lignende tilgang kan anvendes på andre vandmændarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer relateret til alle materialer, reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol.

1. Sonde syntese

  1. RNA-ekstraktion
    1. Placer tre levende Cladonema medusae, der dyrkes i kunstigt havvand (ASW) i et 1,5 ml rør ved hjælp af en 3,1 ml overførselspipette med spidsen afskåret, og fjern så meget ASW som muligt.
      BEMÆRK: ASW fremstilles ved at opløse en blanding af mineralsalte i ledningsvand med klorneutralisator; den endelige specifikke tyngdekraft (S.G.) er 1.018 eller dele pr. Tusind (ppt) er ~ 27.
    2. Frys 1,5 ml rør i flydende nitrogen for at hæmme RNase-aktiviteten. Der tilsættes 30 μL lysisbuffer fra det totale RNA-isolationssæt, hvori der er tilsat 2-mercaptoethanol (1 μL/100 μL lysisbuffer), og prøverne homogeniseres i lysisbufferen ved hjælp af en homogenisator.
      BEMÆRK: For at undgå overløb af bufferen og prøven fra rørene anbefales homogenisering med en lille mængde lysisbuffer.
    3. Der tilsættes 570 μL lysisbuffer, og det totale RNA ekstraheres efter protokollen for det totale RNA-isolationssæt (figur 1).
    4. Koncentrationen af det ekstraherede RNA måles ved hjælp af et spektrofotometer, og det opbevares ved -80 °C indtil brug.
  2. cDNA-syntese
    1. Brug et sæt til at syntetisere cDNA ved hjælp af det samlede RNA ekstraheret fra medusae som en skabelon (figur 1 og tabel 1).
    2. Inkuberes ved 65 °C i 5 min.
    3. Afkøles hurtigt på is.
    4. Der udføres cDNA-syntese med blandingen fra trin 1.2.1 (tabel 1). Bland grundigt ved pipettering og inkuberes ved 42 °C i 60 min.
    5. Inkuberes ved 95 °C i 5 min.
    6. Afkøles hurtigt på is.
    7. Koncentrationen af det syntetiserede cDNA måles ved hjælp af et spektrofotometer, og der opbevares ved eller under -20 °C indtil brug.
  3. PCR-produktsyntese
    1. For at oprette en PCR-skabelon skal du designe den specifikke primer ved hjælp af Primer-BLAST. Kilde referencesekvensen fra NCBI-data eller RNA-seq-data.
      BEMÆRK: Se materialetabellen for de primere, der anvendes i denne protokol.
    2. For at forstærke målsekvensen skal du udføre TA-kloning, som ikke kræver brug af restriktionsenzymer. For at opnå et PCR-produkt, hvori der tilsættes en adenin i 3'-enden, skal du bruge følgende indstillinger: 98 °C i 2 minutter; 35 cyklusser på 98 °C i 10 s, 55-60 °C i 30 s, 72 °C i 1 min. Brug Taq DNA-polymerase til reaktionerne (tabel 1).
      BEMÆRK: For at bestemme PCR-betingelserne skal du følge protokollen, der ledsager DNA-polymerasen, der skal anvendes, hvilket generelt giver en anbefalet udglødningstemperatur og forlængelsestid.
    3. Kør PCR-produktet gennem en 1% agarosegel og skær interessebåndet ud. Ekstraher PCR-produkterne fra de skårne geler ved hjælp af et gelekstraktionssæt.
  4. Ligatur
    1. PCR-produktet omsluttes vektoren med 3' thyminudhæng ved at blande reagenserne (tabel 1) og inkubere ved 37 °C i 30 minutter (figur 1).
      BEMÆRK: Molekylforholdet mellem vektor: PCR skal være 1: >3. pTA2-vektorstørrelsen er ca. 3 kb. Hvis PCR-produktet (insert) er A (kb) og B (ng/μL), kan volumenet af insertet (X i tabel 1), der skal tages, beregnes med ([50 ng vektor × A kb insert])/(3 kb vektor × [1/3]) = 50· En ng af indsats. Hvis koncentrationen af insert er B ng/μL, er volumen 50· A/B μL af indsatsen.
  5. Transformation og plettering
    1. Til transformation optøes de kompetente celler på is og dispenseres i 20 μL aliquoter hver. Tilsæt 1 μL af plasmiderne indeholdende PCR-produktet (mindre end 5% af det kompetente cellevolumen) og hvirvel i 1 s. Inkuberes på is i 5 minutter, og inkuberes derefter ved 42 ° C i 45 s og hvirvel i 1 s.
    2. Tilsæt 180 μL Super Optimal bouillon med Catabolite repression (SOC) medium (et ernæringsmæssigt rigt bakteriekulturmedium) til de kompetente celler og inkuber ved 37 °C i 30 min. Efter 30 minutter spredes de kompetente celler på en agarplade indeholdende ampicillin, 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranosid (X-gal) og isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) og inkuberes ved 37 °C i 12-16 timer (figur 1).
      BEMÆRK: X-gal og IPTG bruges til at vælge blå og hvide kolonier.
  6. Flydende kultur
    1. Vælg en hvid koloni ud af de hvide og blå kolonier på pladen. Der tilsættes 3-5 ml LB-medium med ampicillin og inkuberes på en ryster i 12-16 timer ved 37 °C (figur 1).
  7. Miniprep
    1. Plasmidet ekstraheres fra LB-mediet ved hjælp af en plasmid miniprep (figur 1).
    2. Kvantificer plasmidkoncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
  8. Læs sekvensen.
    1. For at læse plasmidets DNA-sekvens skal du sende plasmidet til Sanger-sekventering og derefter bruge software til at justere det med genomet / transkriptomsekvensen for at bekræfte, om målsekvensen er korrekt syntetiseret og vurdere, i hvilken retning målsekvensen indsættes i plasmidet (5 'til 3' eller 3' til 5').
      BEMÆRK: Hvis målsekvensen indsættes i plasmidet i 5'til 3'-retningen fra RNA-polymerasebindingsstedet nær 3'-enden, kan en antisense-sonde genereres ved in vitro-transkription . Hvis målsekvensen indsættes i omvendt 3 'til 5' retning, kan der genereres en sansesonde (negativ kontrol). Hvis du bruger vektorer som pTA2, kan to transkriptionsbindingssteder bruges afhængigt af formålet.
  9. In vitro transskription
    1. Forbered DNA-skabelonen fra det oprettede plasmid ved at udføre PCR ved hjælp af primere uden for RNA-polymerasebindingsstedet (f.eks. T7 / T3-bindingssteder) i plasmidet (figur 1).
      BEMÆRK: Universelle primere såsom M13-20 fremadgående primer og M13 omvendt primer kan bruges til at forberede en DNA-skabelon, der inkluderer RNA-polymerasebindingssteder.
    2. Rens skabelonen efter PCR-forstærkning ved hjælp af et gel / PCR-ekstraktionssæt.
    3. Reagenserne vist nedenfor blandes, og transkriptionsreaktionen udføres ved 37 °C i 3 timer (figur 1 og tabel 1).
    4. Der tilsættes 1,5 μL DNase, og der inkuberes ved 37 °C i 30 min.
    5. Tilsæt 10 μL RNase-frit vand og rens sonden fra transkriptionsreaktionsopløsningen ved hjælp af en oprydningskolonne.
    6. Kontroller størrelsen af det syntetiserede RNA ved at indlæse 1 μL på en 1% agarosegel og bestem koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
      BEMÆRK: Syntetiserede RNA-sonder skal have en koncentration på mindst 100 ng / μL.
    7. Der tilsættes 30 μL formamid til opbevaring ved eller under -20 °C.

2. EdU-inkorporering og fiksering

  1. Cladonema medusae (5-10 dyr pr. rør) anbringes i 1,5 ml rør ved hjælp af en overførselspipette på 3,5 ml, og der tilsættes ASW op til et samlet volumen på 500 μL. Der tilsættes 7,5 μL 10 mM EdU-stamopløsning, og prøverne inkuberes i 1 time ved 22 °C (figur 2). Den endelige EdU-koncentration er 150 μM.
    BEMÆRK: Brug 5-7 dage gammel medusae til at overvåge tredje grendannelse (figur 3A). Den dag, hvor medusaen løsner sig fra polyppen, tælles som dag 1, og på dag 5 begynder medusae typisk at udstille en tredje gren på deres vigtigste tentakler.
  2. Efter 1 time skal du fjerne så meget ASW indeholdende EdU som muligt.
  3. For at bedøve medusaen tilsættes 7% MgCl2 i H2O og inkuberesi 5 min.
  4. De 7 % MgCl 2 i H 2 O fjernes og medusaen fikseres natten over (O.N.) ved 4 °C med 4 % paraformaldehyd (PFA) i ASW (figur 2).
    BEMÆRK: Ved udførelse af FISH uden EdU-inkorporering kan prøver rettes på samme måde som dem, der behandles med EdU efter anæstesibehandling (trin 2.3-2.4).

3. Fluorescerende in situ hybridisering

  1. Proteinasebehandling og postfiksering
    1. PFA fjernes og prøverne vaskes med PBS indeholdende 0,1% Tween-20 (PBST) i 3 x 10 min. Brug 300-500 μL PBST pr. vask.
      BEMÆRK: Fra dette trin til slutningen af hybridisering skal eksperimentet udføres i et RNase-frit miljø iført handsker og en maske. 1x PBS i dette trin skal laves med DEPC-behandlet vand. Efter hybridisering kan 1x PBS fremstillet med vand uden DEPC-behandling anvendes. Nogle ISH- og FISH-protokoller dehydrerer prøver ved hjælp af methanoltrin, hvilket gør det muligt at gemme de faste prøver ved -20 ° C indtil brug. For at undgå overflødigt arbejde udelades dehydreringsprocessen fra denne protokol, især da prøverne kan opbevares i PBST i op til et par dage.
    2. Efter fiksering anbringes prøven i 1,5 ml rør på en ryster, bortset fra anti-DIG-POD-antistoffet O.N. inkubationstrin (trin 3.4.2). Efter vask tilsættes 10 mg/ml proteinase K-stamopløsning i PBST og medusaen inkuberes med proteinase K (slutkoncentration: 10 μg/ml) ved 37 °C i 10 min.
    3. Proteinase K-opløsningen udgår, og prøverne vaskes i 2 x 1 minut med PBST.
    4. For at postfiksere medusaen tilsættes 4% PFA i 1x PBS og inkuberes ved 37 °C i 15 min.
    5. PFA-opløsningen fjernes, og prøverne vaskes i 2 x 10 minutter med PBST.
      BEMÆRK: Hvis målgenet udtrykkes stærkt med lavt baggrundssignal, kan trin 3.1.2-3.1.5 springes over.
  2. Hybridisering
    1. Fjern PBST, og tilføj hybridiseringsbuffer (HB-buffer, tabel 1). Prøverne inkuberes i HB Buffer i 15 minutter ved stuetemperatur (RT). Brug 300-400 μL HB Buffer, som giver tilstrækkelig volumen til vellykket hybridisering.
      BEMÆRK: HB Buffer, Wash Buffer 1 og Wash Buffer 2 er forberedt med 20x SSC-lager. HB Buffer opbevares ved eller under -20 °C og skal bringes til RT før brug.
    2. Fjern HB-bufferen, og tilføj en ny HB-buffer. Forhybridiser ved 55 °C i mindst 2 timer i en hybridiseringsinkubator.
    3. HB-bufferen fjernes, og der inkuberes med HB-bufferen indeholdende de sonder, der blev opbevaret i trin 1.9.7 (endelig sondekoncentration: 0,5-1 ng/μL i HB-buffer). Hybridiser ved 55 ° C i 18-24 timer (figur 2) i en hybridiseringsinkubator.
      BEMÆRK: FISH-signalintensitet og specificitet kan variere på grund af målgenekspression samt sondelængde og specificitet. For at øge intensiteten kan parametre som hybridiseringsvarighed (18-72 timer) og temperatur (50-65 °C) justeres, og forskellige sonder kan testes. For at undgå uspecifikke signaler kan proteinase K-behandling (koncentration og varighed) ændres19.
  3. Fjernelse af sonde
    1. Fjern HB-bufferen, der indeholder sonder, og tilføj derefter vaskebuffer 1 (tabel 1). Prøverne vaskes med vaskebuffer 1 i 2 x 15 minutter ved 55 °C. Brug 300-400 μL vaskebuffer.
      BEMÆRK: HB Buffer indeholdende sonder kan bruges gentagne gange, op til ca. ti gange. I stedet for at kassere opbevares den anvendte HB-buffer, der indeholder sonder, ved eller under -20 °C. Forvarm vaskebuffer 1, vaskebuffer 2, 2x SSC og PBST ved 55 °C før brug.
    2. Fjern vaskebuffer 1, og tilføj derefter vaskebuffer 2 (tabel 1). Prøverne vaskes med vaskebuffer 2 i 2 x 15 minutter ved 55 °C.
    3. Fjern Wash Buffer 2, og tilføj derefter 2x SSC. Prøverne vaskes med 2x SSC i 2 x 15 minutter ved 55 °C.
    4. Fjern 2x SSC, og tilføj derefter forvarmet PBST. Prøverne vaskes i 1 x 15 min med PBST ved RT.
  4. Inkubation af anti-DIG-antistoffer
    1. Fjern PBST, og tilføj derefter 1% blokerende buffer. Inkuber prøverne i mindst 1 time ved RT, mens de rystes langsomt på en vippe.
      BEMÆRK: Forbered 1% blokerende buffer frisk ved at fortynde 5% blokerende bufferlager (tabel 1). Kontroller prøverne før den næste antistofreaktion, fordi prøven har tendens til at klæbe til bagsiden af låget eller væggen som følge af rystelser.
    2. Efter blokering fjernes 1% blokeringsbufferen, der tilsættes anti-DIG-POD-opløsning (1:500, i 1% blokerende buffer) og inkuberes prøverne O.N. ved 4 °C (figur 2).
      BEMÆRK: Pas på at holde inkubationstiden inden for 12-16 timer for at forhindre detektion af ikke-specifikke signaler.
  5. Påvisning af DIG-mærket sonde
    1. Fjern anti-DIG-POD-opløsningen, og tilføj derefter Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, tabel 1). Prøverne vaskes med TNT i 3 x 10 min ved RT.
      BEMÆRK: Brugen af tyramidsignalforstærkningsteknikken (TSA) giver et bedre opløsningsbillede mod peberrodsperoxidasemærkede reagenser (f.eks. Anti-DIG-POD).
    2. Stamopløsning af fluorescerende farvekonjugeret tyramid (Cy5-tyramid) (1:50) fortyndes i amplifikationsfortyndingsbufferen for at fremstille den aktive Cy5-tyramidopløsning (figur 2).
    3. Fjern så meget TNT som muligt, og tilsæt derefter den aktive Cy5-tyramidopløsning. Inkuber prøverne i 10 minutter i mørke.
    4. Prøverne vaskes med PBST i 3 x 10 minutter i mørke.
  6. Påvisning af EdU
    BEMÆRK: EdU-sættet registrerer inkorporeret EdU som fluorescerende signaler (figur 2).
    1. For at forberede EdU-detektionscocktailen blandes komponenterne som vist i tabel 1. Brug 100 μL EdU-detektionscocktail til hver prøve.
      BEMÆRK: Forbered 1x reaktionsbufferadditiv ved fortynding af 10x reaktionsbufferadditiv med ultrarent vand.
    2. Fjern PBST, og tilføj derefter EdU-detektionscocktailen. Inkuber i mørket i 30 min.
    3. Vask med PBST i 3 x 10 min i mørke.
  7. DNA-farvning
    1. Der fortyndes Hoechst 33342 (1:500) i PBST for at fremstille Hoechst-opløsningen. Fjern PBST, og tilføj derefter Hoechst-opløsningen. Prøverne udruges i 30 minutter i mørke (figur 2).
    2. Prøverne vaskes med PBST i 3-4 x 10 min i mørke.
  8. Montering
    1. Lav en bank på glasrutsjebanen for at forhindre, at prøven knuses. Påfør vinylbånd på glasrutsjebanen og udhul midten.
    2. Overfør medusaen til banken på glideglasset ved hjælp af en 3,1 ml overførselspipette med spidsen afskåret.
      BEMÆRK: Pas på ikke at lade tentaklerne overlappe hinanden.
    3. Fjern PBST med en P200-pipette, og tilsæt derefter langsomt 70% glycerol som monteringsmedium (figur 2).
      BEMÆRK: I stedet for 70% glycerol kan anti-fading monteringsmedium bruges til at forhindre fluorescensen i at falme.
    4. Placer forsigtigt en dækslip på medusae med tang, og forsegl siden af dækslippen med klar neglelak.
    5. Hold diasene ved 4 °C i mørke, hvis du ikke straks udfører mikroskopiobservation.
  9. Imaging
    1. Brug et laserscanningskonfokalmikroskop til at erhverve billeder. For enkeltcelleopløsning skal du bruge en 40x olielinse eller en linse til højere forstørrelse.
    2. Efter billedoptagelse skal du åbne billederne ved hjælp af ImageJ/FIJI-software og tælle celler, der er positive for EdU+ og/eller Nanos1+, med multipunktværktøjet20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cladonema tentakler er blevet brugt som model til at studere de cellulære processer af morfogenese og regenerering15,16,17. Tentakelstrukturen består af et epitelrør, hvor stamlignende celler eller i-celler er placeret i det proksimale område, kaldet tentakelpæren, og nye grene tilføjes sekventielt på bagsiden af pærens distale område langs adaxialsiden (figur 3A)15. Tidligere rapporter har vist, at celleproliferation er aktiv både i tentakelpæren og på de nye forgreningssteder ved hjælp af enten EdU eller BrdU mærkning16,17. På grund af opløsningen af in situ-hybridisering er det imidlertid uklart, om stamlignende celler virkelig er proliferative eller ej. For at visualisere både stamlignende og proliferative celler samtidigt på celleniveau udførte vi FISH for stamcellemarkører (Nanos1 eller Piwi) og EdU-mærkning for S-faseceller i de samme prøver.

Ved cellulær opløsning af FISH blev udtrykket af Nanos1 lokaliseret ved tentakelpæren og det nye forgreningssted (figur 3B). Piwi blev også udtrykt i tentakelpæren og på det nye forgreningssted i et mønster svarende til Nanos1 (figur 3C). Disse resultater var i overensstemmelse med observationerne fra helmonteret in situ-hybridisering i en tidligere rapport17, hvor den spirende gren af en 7 dage gammel medusa næsten ensartet blev mærket af Nanos1 og Piwi. For at visualisere begyndelsen på akkumuleringen af stamlignende celler overvågede vi det nye forgreningssted for en 5 dage gammel medusa. Co-mærkning af Nanos1-ekspression og EdU-positive celler afslørede det rumlige mønster af stamlignende celler og proliferative celler i tentakel (figur 4A). Selvom bruttofordelingen af EdU + og Nanos1+ celler var i overensstemmelse med tidligere rapporter16,17, var EdU+ celler mere udbredt i hele tentakelpæren, i det mindste i begyndelsen af forgreningen, mens Nanos1+ celler akkumulerede mere lokalt ved tentakelpæren og det nye forgreningssted (figur 4A og figur 4E ). Disse observationer tyder på, at forskellige fordelinger af stamlignende celler og prolifererende celler detekteres afhængigt af udviklingstidspunktet og forskellige stadier.

En mere detaljeret visning af pæren og det nye forgreningssted afslørede, at EdU-signaler smelter sammen med nuklear farvning, mens Nanos1-ekspression er begrænset til cytoplasmaet omkring kernen, i overensstemmelse med en tidligere rapport5 (figur 4B, C). En brøkdel (19,79%) af cellerne udviste co-mærkning af EdU og Nanos1 (EdU + Nanos1+; Figur 4B, C, gule pilespidser og figur 4D), hvilket tyder på, at disse celler er en aktivt voksende stamcellepopulation. Spændende nok viste det sig, at 14,46% af cellerne var EdU + Nanos1- midt i pæren og på det nye forgreningssted, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ikke-stamlignende proliferative celler (figur 4B, C, hvide pile og figur 4D). I modsætning hertil blev 26,32% af cellerne observeret at være EdU-Nanos1+ i bunden af pæren og på det nye forgreningssted, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en stamcellepopulation, der enten er langsomt cyklende eller hvilende, hvoraf ingen af dem detekteres ved EdU-pulsmærkning (figur 4B, C, gule pile og figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Skema for sondesyntesen til in situ hybridisering. Ekstraktion af total RNA fra medusae og cDNA-syntese fra total RNA. Nanos1-specifikke PCR-produkter blev syntetiseret fra cDNA. PCR-produkterne blev ligeret ind i vektorerne, og forstærkede vektorer blev indsamlet gennem kompetent cellekultur. PCR-produkterne med RNA-polymerasebindingssteder blev syntetiseret ved anvendelse af plasmiderne som skabeloner. DIG-mærkede RNA-sonder blev syntetiseret ved in vitro-transkription. Forkortelser: DIG = digoxigenin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Ordning af EdU og fluorescerende in situ hybridisering co-farvning. Medusae blev inkuberet med 150 μM EdU i 1 time. Derefter blev medusaen bedøvet (for at slappe af vævet) med 7%MgCl2 i H2O og fikseret med 4% PFA O.N. ved 4 °C. Efter fiksering blev prøverne hybridiseret med HB-buffer med en sonde i 20-24 timer ved 55 °C. Efter hybridiseringsreaktionen blev prøverne vasket og inkuberet med anti-DIG-POD-opløsning O.N. ved 4 °C. Medusae blev farvet med Cy5-tyramidopløsning i 10 min, efterfulgt af påvisning af EdU i 30 minutter og farvning med Hoechst 33342 i 30 min. Efter at have afsluttet alle farvningsprocesserne blev medusae monteret på glasrutschebanen, og billeder blev opnået med et konfokalt mikroskop. Forkortelser: EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; FISK = fluorescerende in situ hybridisering; PFA = paraformaldehyd; O.N. = natten over; HB = hybridisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Nanos1 og Piwi udtryksmønstre på den proksimale adaxiale side af Cladonema medusa tentakel. (A) Skematisk af en Cladonema medusa og tentakel. Den adaksiale side af tentakel: tentakelpæren (den mest proksimale region) med nye grene sekventielt dannet på det nye forgreningssted. Indsatsen (stiplet firkant) angiver det område, der er fanget af det konfokale billede. (B) FISH-billeder af Nanos1-genekspression fra den proksimale, adaksiale side af tentakel af en 7 dage gammel Cladonema medusa. (C) FISH-billeder af Piwi-genekspression fra den proksimale, adaksiale side af tentakel af en 7 dage gammel Cladonema medusa. DNA: grøn, Nanos1: magenta. B'-C' kun til Nanos1 FISH-billeder. Skalabjælker = 100 μm (B, C). Forkortelse: FISH = fluorescerende in situ hybridisering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: EdU- og Nanos1-ekspressionsmønstre på den proksimale, adaksiale side af Cladonema medusa tentakel. (A-C) Billeder af den proksimale adaxiale side af Cladonema medusa tentakel co-mærket med Nanos1-ekspression og EdU; 5 dage gammel medusae blev brugt. (A) En oversigt over tentakel. Gule stiplede firkanter angiver områderne B og C. (B) Forstørrelse af tentakelpæren. (C) Forstørrelse af et nyt forgreningssted. Gule pilespidser angiver de celler, der er positive for både EdU og Nanos1. Gule pile angiver de celler, der kun er positive for Nanos1. Hvide pile angiver celler, der kun er positive for EdU. A-C-paneler er flettede billeder til DNA (blå), EdU (grøn) og Nanos1 (magenta). A'-C' er paneler til kun EdU-billeder; A''-C'' er kun til Nanos1 FISH-billeder. Skalabjælker = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) Kvantificering af EdU- og/eller Nanos1-positive celler i den basale side af tentakel (kvantificeringsområde = 30,10 μm2 kvadrat, n = 6, i alt 249 celler). EdU + Nanos1− celler, 14,46%; EdU + Nanos1+ celler, 19,79%; EdU− Nanos1+ celler, 26,32%; EdU− Nanos1− celler, 39,44%. (E) Skematisk af en Cladonema medusa tentakel fra adaxial side. Den samlede fordeling af EdU+ celler og Nanos1+ celler er vist i henholdsvis E og E'. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætning af forskellige PCR-reaktioner og buffere i denne protokol. For at beregne volumenet af PCR-produktet (X μL) i ligeringsreaktionen henvises til noten efter protokoltrin 1.4. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formerende celler og stamceller er vigtige cellulære kilder i forskellige processer såsom morfogenese, vækst og regenerering21,22. Dette papir beskriver en metode til co-farvning af stamcellemarkøren Nanos1 ved FISH og EdU-mærkning i Cladonema medusae. Tidligere arbejde ved hjælp af EdU- eller BrdU-mærkning har antydet, at proliferative celler lokaliserer til tentakelpærerne16,17, men deres molekylære egenskaber var uklare. Denne undersøgelse viser samtidig bestemmelse af fordelingen af proliferative celler og lokalisering af Nanos1+ stamlignende celler (figur 4). Resultaterne viste, at nogle proliferative celler udtrykte Nanos1, men andre celler blev kun markeret med EdU og udtrykte ikke Nanos1, hvilket tyder på eksistensen af stamcelle heterogenitet eller potentielt af andre proliferative celler. Det vil være interessant at dissekere den detaljerede stamcellefordeling under forskellige processer i Cladonema, herunder tentakelforgrening, vævshomeostase, organregenerering og vedligeholdelse af kimceller.

Den største flaskehals for visualisering af stamceller hos dyr er den indledende identifikation af stamcellemarkører. I cnidarians er stamcellemarkører ikke blevet identificeret i ikke-hydrozoaner3, og på nuværende tidspunkt er den direkte anvendelse af FISH til stamcellemarkører derfor begrænset til hydrozoer. Ikke desto mindre giver FISH mulighed for påvisning af specifik genekspression på celleniveau, og ved at ændre sonder kan denne metode udvides til at observere de rumlige ekspressionsmønstre for alle gener af interesse i detaljer. For eksempel kan vi ved hjælp af markører for stamceller og differentierede celler verificere fordelingen af specifikke celletyper i Cladonema tentakler. Som en advarsel skal den nuværende protokol muligvis ændres afhængigt af generne af interesse på grund af forskelle i ekspressionsniveauer og mRNA-stabilitet. Især ikke-specifikke signaler og svage signaler er almindelige problemer forbundet med FISH. Ændring af hybridiseringstid og temperatur ved hjælp af blegereagenser (formamid eller methanol) og justering af andre parametre (TSA-reaktionstid, proteinase K-behandling, vask efter hybridisering) kan give klarere signaler og færre uspecifikke signaler23,24. Det er også vigtigt at vælge en FISH-protokol, der passer til den dyremodel, der anvendes, da en FISH-protokol muligvis ikke gælder for andre arter, selv inden for den samme taxon 7,25,26.

EdU-mærkning bruges generelt til at detektere proliferative celler, men kan bruges til forskellige eksperimentelle formål ved at variere koncentrationen og inkubationstiden27. For at detektere prolifererende celler er det afgørende at bestemme en vellykket varighed og koncentration for EdU-inkorporering. I pulsmærkningen, der blev brugt i dette arbejde, blev kun proliferative celler, der passerede gennem S-fase i en kort periode, markeret, og lignende korte inkubationsmetoder er blevet brugt til at detektere prolifererende celler i andre cnidarians 6,28,29. I modsætning hertil kan kombinationen af langvarig EdU-inkorporering og Nanos1 FISH afsløre tilstedeværelsen af langsomt cyklende eller hvilende stamceller27. Det er også muligt at markere ikke kun proliferative celler, men også endocycling celler, der har gennemgået DNA-syntese uden opdeling. Desuden kan vi ved at spore EdU-mærkede celler i længere tid bestemme den cellulære kapacitet til migration og differentiering forbundet med proliferative celler og deres celleafstamning 6,30.

Mens kombinationen af FISH og EdU- eller BrdU-farvning er blevet brugt 7,31, kan den metode, der er etableret her, let anvendes på andre marine hvirvelløse dyr og ikke-modeldyr, herunder forskellige vandmændarter. EdU-farvning er enklere og mere følsom end BrdU-farvning18, og med sin korte inkubation muliggør den detektion af prolifererende celler, i modsætning til den tidligere undersøgelse, der brugte EdU til langvarig cellemærkning7. I de senere år, med udviklingen af næste generations sekventeringsteknologier, er genom- og genekspressionsinformation blevet tilgængelig for mange arter. Identifikation af stamceller og proliferative celler vil fortsat være en effektiv tilgang til at forstå stamcellers heterogenitet og mangfoldighed og give indsigt i den cellulære dynamik, der ligger til grund for forskellige biologiske fænomener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af AMED under tilskudsnummer JP22gm6110025 (til Y.N.) og af JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (til Y.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 186 FISK EdU vandmænd medusa Cladonema pacificum stamceller celleproliferation
Fluorescerende <em>in situ</em> hybridisering og 5-ethynyl-2'-deoxyuridin mærkning for stamlignende celler i hydrozoan vandmænd <em>Cladonema pacificum</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., … More

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter