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Developmental Biology

Fluoreszierende In situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung stammartig wuchernder Zellen in der Qualle Cladonema. Die Whole-mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung mit einem Stammzellmarker ermöglicht den Nachweis stammähnlicher Zellen, und die 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung ermöglicht die Identifizierung proliferierender Zellen. Zusammen können aktiv wuchernde stammartige Zellen nachgewiesen werden.

Abstract

Nesseltiere, einschließlich Seeanemonen, Korallen und Quallen, zeigen vielfältige Morphologie und Lebensstile, die sich in sitzenden Polypen und frei schwimmenden Medusen manifestieren. Wie etablierte Modelle wie Hydra und Nematostella zeigen, tragen Stammzellen und/oder proliferative Zellen zur Entwicklung und Regeneration von Nesseltierpolypen bei. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen in den meisten Quallen, insbesondere im Medusa-Stadium, sind jedoch weitgehend unklar, und daher ist die Entwicklung einer robusten Methode zur Identifizierung spezifischer Zelltypen von entscheidender Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung stammartig proliferierender Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum. Cladonema medusae besitzen verzweigte Tentakel, die während ihres gesamten Erwachsenenstadiums kontinuierlich wachsen und die Regenerationsfähigkeit aufrechterhalten und eine einzigartige Plattform bieten, um die zellulären Mechanismen zu untersuchen, die von proliferierenden und / oder stammartigen Zellen orchestriert werden. Die Whole-mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung eines Stammzellmarkers ermöglicht den Nachweis stammähnlicher Zellen, während die Pulsmarkierung mit 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU), einem S-Phasenmarker, die Identifizierung proliferierender Zellen ermöglicht. Durch die Kombination von FISH- und EdU-Markierung können wir aktiv proliferierende stammartige Zellen an festen Tieren nachweisen, und diese Technik kann breit auf andere Tiere angewendet werden, einschließlich Nicht-Modell-Quallenarten.

Introduction

Cnidaria gilt als basal verzweigter Metazoenstamm, der Tiere mit Nerven und Muskeln enthält, was sie in eine einzigartige Position für das Verständnis der Evolution der Tierentwicklung und -physiologie versetzt 1,2. Nesseltiere werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Anthozoen (z. B. Seeanemonen und Korallen) besitzen nur Planulalarven und sessilile Polypenstadien, während Medusozoa (Mitglieder von Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa und Cubozoa) typischerweise die Form von frei schwimmenden Medusen oder Quallen sowie Planulalarven und Polypen annehmen. Nesseltiere weisen häufig eine hohe Regenerationsfähigkeit auf, und ihre zugrunde liegenden zellulären Mechanismen, insbesondere ihr Besitz von adulten Stammzellen und proliferativen Zellen, haben viel Aufmerksamkeit erregt 3,4. Ursprünglich in Hydra identifiziert, befinden sich hydrozoische Stammzellen in den interstitiellen Räumen zwischen ektodermalen Epithelzellen und werden allgemein als interstitielle Zellen oder i-Zellen bezeichnet3.

Hydrozoen-i-Zellen haben gemeinsame Merkmale, darunter Multipotenz, die Expression weit konservierter Stammzellmarker (z. B. Nanos, Piwi, Vasa) und Migrationspotenzial 3,5,6,7,8. Als funktionelle Stammzellen sind i-Zellen umfassend an der Entwicklung, Physiologie und Umweltreaktion von Hydrozoentieren beteiligt, was von ihrer hohen Regenerationsfähigkeit und Plastizität zeugt3. Während Stammzellen, ähnlich wie i-Zellen, außerhalb von Hydrozoen selbst bei der etablierten Modellart Nematostella nicht identifiziert wurden, sind proliferative Zellen immer noch an der Erhaltung und Regeneration von somatischem Gewebe sowie der Keimbahnbeteiligt 9. Da Studien zur Entwicklung und Regeneration von Nesseltieren überwiegend an polypartigen Tieren wie Hydra, Hydractinia und Nematostella durchgeführt wurden, bleiben die zelluläre Dynamik und Funktionen von Stammzellen in Quallenarten weitgehend unberücksichtigt.

Die Hydrozoenqualle Clytia hemisphaerica , eine kosmopolitische Quallenart mit verschiedenen Lebensräumen auf der ganzen Welt, einschließlich des Mittelmeers und Nordamerikas, wurde als experimentelles Modelltier in mehreren Entwicklungs- und Evolutionsstudien verwendet10. Mit seiner geringen Größe, einfachen Handhabung und großen Eiern eignet sich Clytia sowohl für die Laborpflege als auch für die Einführung genetischer Werkzeuge wie der kürzlich etablierten Transgenese- und Knockout-Methoden11, was die Möglichkeit einer detaillierten Analyse der zellulären und molekularen Mechanismen eröffnet, die der Quallenbiologie zugrunde liegen. Im Clytia medusa-Tentakel sind i-Zellen in der proximalen Region, der sogenannten Zwiebel, lokalisiert, und Vorläuferzellen wie Nematoblasten wandern zur distalen Spitze, während sie sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich Nematozyten12.

Während der Regeneration des Clytia manubrium, dem oralen Organ der Quallen, wandern Nanos1+ i-Zellen, die in den Gonaden vorhanden sind, in die Region, in der das Manubrium als Reaktion auf Schäden verloren geht, und nehmen an der Regeneration des Manubriums teil7. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass sich i-Zellen in Clytia auch als funktionelle Stammzellen verhalten, die an der Morphogenese und Regeneration beteiligt sind. Da sich die Eigenschaften von i-Zellen jedoch bei repräsentativen Tieren vom Polyp-Typ wie Hydra und Hydractinia3 unterscheiden, ist es möglich, dass die Eigenschaften und Funktionen von Stammzellen zwischen Quallenarten diversifiziert sind. Darüber hinaus waren mit Ausnahme von Clytia experimentelle Techniken für andere Quallen begrenzt, und die detaillierte Dynamik proliferativer Zellen und Stammzellen ist unbekannt13.

Die Hydrozoenqualle Cladonema pacificum ist ein aufstrebender Modellorganismus, der in einer Laborumgebung ohne Wasserpumpe oder Filtersystem gehalten werden kann. Die Cladonema medusa hat verzweigte Tentakel, ein häufiges Merkmal in der Cladonematidae-Familie, und ein Photorezeptororgan namens Ocellus auf der ektodermalen Schicht in der Nähe der Zwiebel14. Der Tentakelverzweigungsprozess findet an einer neuen Verzweigungsstelle statt, die entlang der adaxialen Seite des Tentakels erscheint. Im Laufe der Zeit verlängern sich die Tentakel weiter und verzweigen sich, wobei die älteren Zweige in Richtung der Spitze15 herausgeschoben werden. Darüber hinaus können sich Cladonema-Tentakel innerhalb weniger Tage nach Amputation regenerieren. Neuere Studien haben die Rolle von proliferierenden Zellen und stammähnlichen Zellen bei der Tentakelverzweigung und Regeneration bei Cladonema16,17 vorgeschlagen. Während jedoch die konventionelle In-situ-Hybridisierung (ISH) verwendet wurde, um die Genexpression in Cladonema sichtbar zu machen, ist es aufgrund ihrer geringen Auflösung derzeit schwierig, die Stammzelldynamik auf zellulärer Ebene im Detail zu beobachten.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Visualisierung stammartiger Zellen in Cladonema durch FISH und Co-Färbung mit EdU, einem Marker der Zellproliferation18. Wir visualisieren das Expressionsmuster von Nanos1, einem Stammzellmarker 5,17, mittels FISH, das die Identifizierung einer stammartigen Zellverteilung auf Einzelzellebene ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Co-Färbung der Nanos1-Expression mit EdU-Markierung, aktiv proliferierende stammartige Zellen zu unterscheiden. Diese Methode zur Überwachung sowohl stammähnlicher Zellen als auch proliferativer Zellen kann auf eine Vielzahl von Untersuchungsbereichen angewendet werden, einschließlich Tentakelverzweigung, Gewebehomöostase und Organregeneration bei Cladonema, und ein ähnlicher Ansatz kann auf andere Quallenarten angewendet werden.

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Protocol

HINWEIS: Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .

1. Sondensynthese

  1. RNA-Extraktion
    1. Legen Sie drei lebende Cladonema-Medusen , die in künstlichem Meerwasser (ASW) kultiviert werden, in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer 3,1-ml-Transferpipette mit abgeschnittener Spitze und entfernen Sie so viel ASW wie möglich.
      HINWEIS: ASW wird hergestellt, indem eine Mischung von Mineralsalzen in Leitungswasser mit Chlorneutralisator aufgelöst wird; das endgültige spezifische Gewicht (S.G.) beträgt 1,018 oder die Teile pro Tausend (ppt) sind ~27.
    2. Frieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen in flüssigem Stickstoff ein, um die RNase-Aktivität zu hemmen. Fügen Sie 30 μL Lysepuffer aus dem gesamten RNA-Isolierkit hinzu, in das 2-Mercaptoethanol (1 μL/100 μL Lysepuffer) gegeben wurde, und homogenisieren Sie die Proben im Lysepuffer mit einem Homogenisator.
      HINWEIS: Um ein Überlaufen des Puffers und der Probe aus den Röhrchen zu vermeiden, wird eine Homogenisierung mit einer kleinen Menge Lysepuffer empfohlen.
    3. Fügen Sie 570 μL Lysepuffer hinzu und extrahieren Sie die gesamte RNA gemäß dem Protokoll des gesamten RNA-Isolierkits (Abbildung 1).
    4. Die Konzentration der extrahierten RNA wird mit einem Spektralphotometer gemessen und bis zur Verwendung bei −80 °C gelagert.
  2. cDNA-Synthese
    1. Synthetisieren Sie mit einem Kit cDNA unter Verwendung der gesamten aus den Medusen extrahierten RNA als Vorlage (Abbildung 1 und Tabelle 1).
    2. Bei 65 °C 5 min inkubieren.
    3. Auf Eis schnell abkühlen.
    4. Führen Sie die cDNA-Synthese mit der Mischung aus Schritt 1.2.1 durch (Tabelle 1). Gründlich pipettieren und 60 min bei 42 °C inkubieren.
    5. Bei 95 °C 5 min inkubieren.
    6. Auf Eis schnell abkühlen.
    7. Die Konzentration der synthetisierten cDNA wird mit einem Spektralphotometer gemessen und bis zur Verwendung bei oder unter −20 °C gelagert.
  3. PCR-Produktsynthese
    1. Um eine PCR-Vorlage zu erstellen, entwerfen Sie den spezifischen Primer mit Primer-BLAST. Quelle der Referenzsequenz aus NCBI-Daten oder RNA-Seq-Daten.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Grundierungen finden Sie in der Materialtabelle .
    2. Um die Zielsequenz zu amplifizieren, führen Sie eine TA-Klonierung durch, die keine Verwendung von Restriktionsenzymen erfordert. Um ein PCR-Produkt zu erhalten, bei dem am 3'-Ende ein Adenin hinzugefügt wird, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 98 °C für 2 min; 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 55-60 °C für 30 s, 72 °C für 1 min. Verwenden Sie Taq DNA-Polymerase für die Reaktionen (Tabelle 1).
      HINWEIS: Um die PCR-Bedingungen zu bestimmen, befolgen Sie das Protokoll, das der zu verwendenden DNA-Polymerase beiliegt, das im Allgemeinen eine empfohlene Glühtemperatur und Verlängerungszeit angibt.
    3. Lassen Sie das PCR-Produkt durch ein 1% iges Agarosegel laufen und schneiden Sie die interessierende Bande aus. Extrahieren Sie die PCR-Produkte aus den geschnittenen Gelen mit einem Gelextraktionskit.
  4. Gebundenheit
    1. Ligate das PCR-Produkt an den Vektor mit 3'-Thyminüberhängen durch Mischen der Reagenzien (Tabelle 1) und Inkubieren bei 37 °C für 30 min (Abbildung 1).
      HINWEIS: Das molekulare Verhältnis von Vektor:PCR sollte 1:>3 betragen. Die pTA2-Vektorgröße beträgt ca. 3 kb. Wenn das PCR-Produkt (Insert) A (kb) und B (ng/μL) ist, kann das Volumen des zu entnehmenden Inserts (X in Tabelle 1) berechnet werden durch ([50 ng des Vektors × A kb des Inserts])/(3 kb Vektor × [ 1/3]) = 50· Ein ng der Einfügung. Wenn die Konzentration des Einsatzes B ng/μL beträgt, beträgt das entnommene Volumen 50· A/B μL des Einsatzes.
  5. Transformation und Galvanisierung
    1. Zur Umwandlung tauen Sie die zuständigen Zellen auf Eis auf und geben sie in jeweils 20 μL Aliquots ab. 1 μL der Plasmide, die das PCR-Produkt enthalten (weniger als 5% des kompetenten Zellvolumens) und Wirbel für 1 s zugeben. 5 min auf Eis inkubieren, dann 45 s bei 42 °C und 1 s Wirbel inkubieren.
    2. 180 μL Super Optimal Brühe mit Katabolit-Repressionsmedium (SOC) (ein ernährungsphysiologisch reichhaltiges Bakterienkulturmedium) in die zuständigen Zellen geben und bei 37 °C für 30 min inkubieren. Nach 30 Minuten verteilen Sie die zuständigen Zellen auf eine Agarplatte, die Ampicillin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranosid (X-gal) und Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) enthält, und inkubieren bei 37 °C für 12-16 h (Abbildung 1).
      HINWEIS: X-gal und IPTG werden zur Auswahl blauer und weißer Kolonien verwendet.
  6. Flüssigkultur
    1. Wählen Sie eine weiße Kolonie aus den weißen und blauen Kolonien auf dem Teller. Geben Sie es zu 3-5 ml LB-Medium mit Ampicillin und inkubieren Sie es auf einem Shaker für 12-16 h bei 37 °C (Abbildung 1).
  7. Miniprep
    1. Extrahieren Sie das Plasmid aus dem LB-Medium mit einem Plasmid-Miniprep (Abbildung 1).
    2. Quantifizieren Sie die Plasmidkonzentration mit einem Spektralphotometer.
  8. Lesen Sie die Sequenz.
    1. Um die DNA-Sequenz des Plasmids zu lesen, senden Sie das Plasmid zur Sanger-Sequenzierung und verwenden Sie dann eine Software, um es mit der Genom- / Transkriptomsequenz abzugleichen, um zu bestätigen, ob die Zielsequenz ordnungsgemäß synthetisiert ist, und zu beurteilen, in welche Richtung die Zielsequenz in das Plasmid eingefügt wird (5' bis 3' oder 3' bis 5').
      HINWEIS: Wenn die Zielsequenz in 5' bis 3' Richtung von der RNA-Polymerase-Bindungsstelle nahe dem 3'-Ende in das Plasmid eingefügt wird, kann eine Antisense-Sonde durch In-vitro-Transkription erzeugt werden. Wird die Zielsequenz in umgekehrter 3' bis 5' Richtung eingefügt, kann eine Messsonde (Negativkontrolle) erzeugt werden. Bei Verwendung von Vektoren wie pTA2 können je nach Zweck zwei Transkriptionsbindungsstellen verwendet werden.
  9. In-vitro-Transkription
    1. Präparation der DNA-Vorlage aus dem erstellten Plasmid durch PCR unter Verwendung von Primern außerhalb der RNA-Polymerase-Bindungsstelle (z. B. T7/T3-Bindungsstellen) im Plasmid (Abbildung 1).
      HINWEIS: Universelle Primer wie der M13-20 Forward Primer und der M13 Reverse Primer können verwendet werden, um eine DNA-Vorlage herzustellen, die RNA-Polymerase-Bindungsstellen enthält.
    2. Reinigen Sie die Vorlage nach der PCR-Amplifikation mit einem Gel/PCR-Extraktionskit.
    3. Mischen Sie die unten gezeigten Reagenzien und führen Sie die Transkriptionsreaktion bei 37 °C für 3 h durch (Abbildung 1 und Tabelle 1).
    4. 1,5 μL DNase zugeben und bei 37 °C 30 min inkubieren.
    5. Fügen Sie 10 μL RNase-freies Wasser hinzu und reinigen Sie die Sonde mit einer Reinigungssäule von der Transkriptionsreaktionslösung.
    6. Überprüfen Sie die Größe der synthetisierten RNA, indem Sie 1 μL auf ein 1% iges Agarosegel laden und die Konzentration mit einem Spektralphotometer bestimmen.
      HINWEIS: Synthetisierte RNA-Sonden sollten eine Konzentration von mindestens 100 ng/μL aufweisen.
    7. 30 μL Formamid zur Lagerung bei oder unter −20 °C zugeben.

2. Gründung und Fixierung von EdU

  1. Cladonema medusae (5-10 Tiere pro Röhrchen) mit einer 3,5-ml-Transferpipette in 1,5-ml-Röhrchen geben und ASW zu einem Gesamtvolumen von 500 μL hinzufügen. Fügen Sie 7,5 μL 10 mM EdU-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie die Proben für 1 h bei 22 °C (Abbildung 2). Die EdU-Endkonzentration beträgt 150 μM.
    HINWEIS: Verwenden Sie 5-7 Tage alte Medusen, um die Bildung des dritten Zweiges zu überwachen (Abbildung 3A). Der Tag, an dem sich die Medusen vom Polypen lösen, wird als Tag 1 gezählt, und am Tag 5 beginnen Medusen typischerweise einen dritten Zweig auf ihren Haupttentakeln zu zeigen.
  2. Entfernen Sie nach 1 h so viel ASW, das EdU enthält, wie möglich.
  3. Um die Medusen zu betäuben, fügen Sie 7% MgCl 2 in H2O hinzu und inkubieren Sie für 5 min.
  4. Entfernen Sie die 7% MgCl2 inH2O und fixieren Sie die Medusen über Nacht (O.N.) bei 4 °C mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in ASW (Abbildung 2).
    HINWEIS: Bei der Durchführung von FISH ohne EdU-Inkorporation können Proben ähnlich fixiert werden wie diejenigen, die nach der Anästhesie mit EdU behandelt wurden (Schritte 2.3-2.4).

3. Fluoreszierende in situ Hybridisierung

  1. Proteinase-Behandlung und Postfixierung
    1. Entfernen Sie das PFA und waschen Sie die Proben mit PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST) für 3 x 10 min. Verwenden Sie 300-500 μL PBST pro Waschgang.
      HINWEIS: Von diesem Schritt bis zum Ende der Hybridisierung sollte das Experiment in einer RNase-freien Umgebung mit Handschuhen und einer Maske durchgeführt werden. Das 1x PBS in diesem Schritt muss mit DEPC-behandeltem Wasser hergestellt werden. Nach der Hybridisierung kann 1x PBS mit Wasser ohne DEPC-Behandlung verwendet werden. Einige ISH- und FISH-Protokolle dehydrieren Proben mit Methanolschritten, wodurch es möglich ist, die fixierten Proben bis zur Verwendung bei −20 °C zu speichern. Um überflüssige Arbeiten zu vermeiden, entfällt der Dehydratisierungsprozess in diesem Protokoll, zumal die Proben bis zu einigen Tagen in PBST aufbewahrt werden können.
    2. Nach der Fixierung legen Sie die Probe in 1,5-ml-Röhrchen auf einen Shaker, mit Ausnahme des Anti-DIG-POD-Antikörpers O.N.-Inkubationsschritt (Schritt 3.4.2). Nach dem Waschen 10 mg/ml Proteinase K Stammlösung in PBST zugeben und die Medusen mit Proteinase K (Endkonzentration: 10 μg/ml) bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    3. Entfernen Sie die Proteinase K-Lösung und waschen Sie die Proben für 2 x 1 min mit PBST.
    4. Zur Nachfixierung der Medusen 4% PFA in 1x PBS zugeben und bei 37 °C 15 min inkubieren.
    5. Entfernen Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Proben 2 x 10 min mit PBST.
      HINWEIS: Wenn das Zielgen stark exprimiert ist und ein niedriges Hintergrundsignal aufweist, können die Schritte 3.1.2-3.1.5 übersprungen werden.
  2. Hybridisierung
    1. Entfernen Sie den PBST, und fügen Sie den Hybridisierungspuffer hinzu (HB-Puffer, Tabelle 1). Inkubieren Sie die Proben in HB Buffer für 15 min bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie 300-400 μL HB-Puffer, der genügend Volumen für eine erfolgreiche Hybridisierung bietet.
      HINWEIS: HB Buffer, Wash Buffer 1 und Wash Buffer 2 werden mit 20x SSC Material vorbereitet. HB Buffer wird bei oder unter −20 °C gelagert und muss vor Gebrauch auf RT gebracht werden.
    2. Entfernen Sie den HB-Puffer und fügen Sie einen neuen HB-Puffer hinzu. Vorhybridisieren bei 55 °C für mindestens 2 h in einem Hybridisierungsinkubator.
    3. Entfernen Sie den HB-Puffer und inkubieren Sie mit HB-Puffer, der die Sonden enthält, die in Schritt 1.9.7 gelagert wurden (endgültige Sondenkonzentration: 0,5-1 ng/μL im HB-Puffer). Hybridisieren Sie bei 55 °C für 18-24 h (Abbildung 2) in einem Hybridisierungsinkubator.
      HINWEIS: Die Signalintensität und -spezifität von FISH kann aufgrund der Zielgenexpression sowie der Sondenlänge und -spezifität variieren. Um die Intensität zu erhöhen, können Parameter wie Hybridisierungsdauer (18-72 h) und Temperatur (50-65 °C) eingestellt und verschiedene Sonden getestet werden. Um unspezifische Signale zu vermeiden, kann die Proteinase-K-Behandlung (Konzentration und Dauer) modifiziert werden19.
  3. Entfernen der Sonde
    1. Entfernen Sie den HB-Puffer, der die Sonden enthält, und fügen Sie dann Waschpuffer 1 hinzu (Tabelle 1). Waschen Sie die Proben mit Wash Buffer 1 für 2 x 15 min bei 55 °C. Verwenden Sie 300-400 μL Waschpuffer.
      HINWEIS: HB Buffer enthaltende Sonden können wiederholt verwendet werden, bis zu etwa zehn Mal. Anstatt ihn zu entsorgen, lagern Sie den gebrauchten HB-Puffer mit Sonden bei oder unter −20 °C. Waschpuffer 1, Waschpuffer 2, 2x SSC und PBST vor Gebrauch bei 55 °C vorheizen.
    2. Entfernen Sie Waschpuffer 1, und fügen Sie dann Waschpuffer 2 hinzu (Tabelle 1). Waschen Sie die Proben mit Wash Buffer 2 für 2 x 15 min bei 55 °C.
    3. Entfernen Sie Wash Buffer 2, und fügen Sie dann 2x SSC hinzu. Waschen Sie die Proben mit 2x SSC für 2 x 15 min bei 55 °C.
    4. Entfernen Sie 2x SSC und fügen Sie dann vorgewärmtes PBST hinzu. Waschen Sie die Proben für 1 x 15 min mit PBST bei RT.
  4. Inkubation von Anti-DIG-Antikörpern
    1. Entfernen Sie PBST, und fügen Sie dann 1 % Blockierungspuffer hinzu. Die Proben für mindestens 1 h bei RT inkubieren, während Sie langsam auf einer Wippe schütteln.
      HINWEIS: Bereiten Sie 1% Blockierpuffer frisch vor, indem Sie 5% blockierenden Pufferbestand verdünnen (Tabelle 1). Überprüfen Sie die Proben vor der nächsten Antikörperreaktion, da die Probe durch Schütteln dazu neigt, an der Rückseite des Deckels oder der Wand zu haften.
    2. Entfernen Sie nach dem Blockieren den 1 % Blockierpuffer, fügen Sie eine Anti-DIG-POD-Lösung hinzu (1:500, in 1 % Blockierpuffer) und inkubieren Sie die Proben O.N. bei 4 °C (Abbildung 2).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Inkubationszeit innerhalb von 12-16 h zu halten, um die Erkennung unspezifischer Signale zu verhindern.
  5. Erkennung von DIG-markierten Sonden
    1. Entfernen Sie die Anti-DIG-POD-Lösung, und fügen Sie dann Tris-NaCl-Tween-Puffer hinzu (TNT, Tabelle 1). Waschen Sie die Proben mit TNT für 3 x 10 min bei RT.
      HINWEIS: Die Verwendung der Tyramid-Signalverstärkungstechnik (TSA) liefert ein Bild mit besserer Auflösung gegen Meerrettichperoxidase-markierte Reagenzien (z. B. Anti-DIG-POD).
    2. Verdünnte fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Tyramid (Cy5-Tyramid)-Stammlösung (1:50) im Amplifikationsverdünnungspuffer, um die aktive Cy5-Tyramidlösung herzustellen (Abbildung 2).
    3. Entfernen Sie so viel TNT wie möglich und fügen Sie dann die aktive Cy5-Tyramidlösung hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 10 min im Dunkeln.
    4. Waschen Sie die Proben mit PBST für 3 x 10 min im Dunkeln.
  6. Nachweis von EdU
    HINWEIS: Das EdU-Kit erkennt integrierte EdU als Fluoreszenzsignale (Abbildung 2).
    1. Um den EdU-Detektionscocktail vorzubereiten, mischen Sie die Komponenten wie in Tabelle 1 gezeigt. Verwenden Sie 100 μL EdU-Detektionscocktail für jede Probe.
      HINWEIS: Bereiten Sie 1x Reaktionspufferadditiv vor, indem Sie 10x Reaktionspufferadditiv mit Reinstwasser verdünnen.
    2. Entfernen Sie PBST, und fügen Sie dann den EdU-Erkennungscocktail hinzu. 30 min im Dunkeln brüten.
    3. Mit PBST 3 x 10 min im Dunkeln waschen.
  7. DNA-Färbung
    1. Hoechst 33342 (1:500) wird in PBST verdünnt, um die Hoechst-Lösung herzustellen. Entfernen Sie die PBST-Lösung, und fügen Sie dann die Hoechst-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln (Abbildung 2).
    2. Waschen Sie die Proben mit PBST für 3-4 x 10 min im Dunkeln.
  8. Montage
    1. Machen Sie eine Bank auf dem Glasobjektträger, um zu verhindern, dass die Probe zerquetscht wird. Tragen Sie Vinylband auf den Glasobjektträger auf und höhlen Sie die Mitte aus.
    2. Bringen Sie die Medusen mit einer 3,1-ml-Transferpipette mit abgeschnittener Spitze zur Bank auf dem Objektträgerglas.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass sich die Tentakel nicht überlappen.
    3. Entfernen Sie PBST mit einer P200-Pipette, und fügen Sie dann langsam 70 % Glycerin als Montagemedium hinzu (Abbildung 2).
      HINWEIS: Anstelle von 70% Glycerin kann ein Anti-Fading-Montagemedium verwendet werden, um das Ausbleichen der Fluoreszenz zu verhindern.
    4. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas mit einer Pinzette auf die Medusen und versiegeln Sie die Seite des Deckglases mit klarem Nagellack.
    5. Halten Sie die Objektträger bei 4 °C im Dunkeln, wenn Sie nicht sofort eine mikroskopische Beobachtung durchführen.
  9. Bildgebung
    1. Verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, um Bilder aufzunehmen. Verwenden Sie für eine Einzelzellenauflösung ein 40-faches Ölobjektiv oder ein Objektiv für eine höhere Vergrößerung.
    2. Öffnen Sie nach der Bildaufnahme die Bilder mit der ImageJ/FIJI-Software und zählen Sie Zellen, die positiv für EdU+ und/oder Nanos1+ sind, mit dem Multipoint-Tool20.

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Representative Results

Cladonema-Tentakel wurden als Modell verwendet, um die zellulären Prozesse der Morphogenese und Regeneration zu untersuchen15,16,17. Die Tentakelstruktur besteht aus einer Epithelröhre, in der sich stammartige Zellen oder i-Zellen im proximalen Bereich befinden, der als Tentakelkolben bezeichnet wird, und neue Zweige werden sequentiell an der Rückseite der distalen Region der Birne entlang der adaxialen Seite hinzugefügt (Abbildung 3A)15. Frühere Berichte haben gezeigt, dass die Zellproliferation sowohl im Tentakelkolben als auch an den neuen Verzweigungsstellen aktiv ist, wobei entweder die EdU- oder BrdU-Markierung16,17 verwendet wird. Aufgrund der Auflösung der In-situ-Hybridisierung ist jedoch unklar, ob stammähnliche Zellen wirklich proliferativ sind oder nicht. Um sowohl stammartige als auch proliferative Zellen gleichzeitig auf zellulärer Ebene sichtbar zu machen, führten wir FISH für Stammzellmarker (Nanos1 oder Piwi) und EdU-Markierungen für S-Phasenzellen in denselben Proben durch.

Bei zellulärer Auflösung mittels FISH wurde die Expression von Nanos1 am Tentakelkolben und an der neuen Verzweigungsstelle lokalisiert (Abbildung 3B). Piwi wurde auch in der Tentakellampe und an der neuen Verzweigungsstelle in einem ähnlichen Muster wie Nanos1 exprimiert (Abbildung 3C). Diese Ergebnisse stimmten mit den Beobachtungen der In-situ-Hybridisierung in einem früheren Berichtüberein 17, wo der knospende Zweig einer 7 Tage alten Medusa fast einheitlich von Nanos1 und Piwi markiert wurde. Um den Beginn der Ansammlung stammartiger Zellen zu visualisieren, überwachten wir die neue Verzweigungsstelle einer 5 Tage alten Medusa. Die Co-Markierung von Nanos1-Expression und EdU-positiven Zellen zeigte das räumliche Muster von stammartigen Zellen und proliferativen Zellen im Tentakel (Abbildung 4A). Obwohl die Bruttoverteilungen von EdU+- und Nanos1+-Zellen mit früheren Berichten16,17 übereinstimmten, waren EdU+-Zellen zumindest zu Beginn der Verzweigung weiter über den Tentakelkolben verteilt, während sich Nanos1+-Zellen lokal am Tentakelkolben und an der neuen Verzweigungsstelle ansammelten (Abbildung 4A und Abbildung 4E ). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass unterschiedliche Verteilungen von stammartigen Zellen und proliferierenden Zellen in Abhängigkeit vom Entwicklungszeitpunkt und verschiedenen Stadien nachgewiesen werden.

Eine detailliertere Ansicht der Birne und der neuen Verzweigungsstelle zeigte, dass EdU-Signale mit der Kernfärbung verschmelzen, während die Nanos1-Expression auf das Zytoplasma beschränkt ist, das den Kern umgibt, was mit einem früheren Berichtübereinstimmt 5 (Abbildung 4B, C). Ein Teil (19,79%) der Zellen zeigte eine Co-Markierung von EdU und Nanos1 (EdU+ Nanos1+; Abbildung 4B, C, gelbe Pfeilspitzen und Abbildung 4D), was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine aktiv proliferierende Stammzellpopulation sind. Interessanterweise wurden 14,46% der Zellen in der Mitte der Birne und an der neuen Verzweigungsstelle als EdU+ Nanos1− gefunden, was auf das Vorhandensein von nicht-stammartigen proliferativen Zellen hindeutet (Abbildung 4B, C, weiße Pfeile und Abbildung 4D). Im Gegensatz dazu wurden 26,32% der Zellen als EdU-Nanos1+ an der Basis der Birne und an der neuen Verzweigungsstelle beobachtet, was auf das Vorhandensein einer Stammzellpopulation hinweist, die entweder langsam zyklisch oder ruhend ist, von denen keine durch EdU-Pulsmarkierung erkannt wird (Abbildung 4B, C, gelbe Pfeile und Abbildung 4D).

Figure 1
Abbildung 1: Schema der Sondensynthese für die in situ Hybridisierung. Extraktion der Gesamt-RNA aus Medusen und cDNA-Synthese aus der Gesamt-RNA. Nanos1-spezifische PCR-Produkte wurden aus der cDNA synthetisiert. Die PCR-Produkte wurden in die Vektoren ligiert, und amplifizierte Vektoren wurden durch kompetente Zellkultur gesammelt. Die PCR-Produkte mit RNA-Polymerase-Bindungsstellen wurden unter Verwendung der Plasmide als Vorlagen synthetisiert. DIG-markierte RNA-Sonden wurden durch In-vitro-Transkription synthetisiert. Abkürzungen: DIG = Digoxigenin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Schema der EdU- und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Co-Färbung. Medusen wurden mit 150 μM EdU für 1 h inkubiert. Anschließend wurden die Medusen (zur Entspannung des Gewebes) mit 7% MgCl2 inH2O betäubt und mit 4% PFAO.N. bei 4 °C fixiert. Nach der Fixierung wurden die Proben mit HB Buffer mit einer Sonde für 20-24 h bei 55 °C hybridisiert. Nach der Hybridisierungsreaktion wurden die Proben gewaschen und mit Anti-DIG-POD-Lösung O.N. bei 4 °C inkubiert. Die Medusen wurden 10 min lang mit Cy5-Tyramidlösung angefärbt, gefolgt von der Detektion von EdU für 30 min und einer Färbung mit Hoechst 33342 für 30 min. Nach Abschluss aller Färbevorgänge wurden die Medusen auf den Objektträger montiert und Bilder mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Abkürzungen: EdU = 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin; FISH = fluoreszierende in situ Hybridisierung; PFA = Paraformaldehyd; O.N. = über Nacht; HB = Hybridisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Nanos1- und Piwi-Expressionsmuster auf der proximalen adaxialen Seite des Cladonema medusa-Tentakels. (A) Schematische Darstellung einer Cladonema medusa und eines Tentakels. Die adaxiale Seite des Tentakels: der Tentakelkolben (die proximalste Region) mit neuen Zweigen, die nacheinander an der neuen Verzweigungsstelle gebildet werden. Der Einschub (gestricheltes Quadrat) zeigt den Bereich an, der vom konfokalen Bild erfasst wird. (B) FISH-Bilder der Nanos1-Genexpression von der proximalen, adaxialen Seite des Tentakels einer 7 Tage alten Cladonema medusa. (C) FISH-Bilder der Piwi-Genexpression von der proximalen, adaxialen Seite des Tentakels einer 7 Tage alten Cladonema medusa. DNA: grün, Nanos1: Magenta. B'-C' nur für Nanos1 FISH-Bilder. Maßstabsbalken = 100 μm (B,C). Abkürzung: FISH = fluoreszierende in situ Hybridisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: EdU- und Nanos1-Expressionsmuster auf der proximalen, adaxialen Seite des Cladonema medusa-Tentakels. (A-C) Bilder der proximalen adaxialen Seite des Cladonema medusa-Tentakels mit Nanos1-Expression und EdU; 5 Tage alte Medusen wurden verwendet. (A) Ein Überblick über das Tentakel. Gelbe gestrichelte Quadrate zeigen die Bereiche B und C an. (B) Vergrößerung des Tentakelkolbens. (C) Vergrößerung eines neuen Zweigstandorts. Gelbe Pfeilspitzen zeigen die Zellen an, die sowohl für EdU als auch für Nanos1 positiv sind. Gelbe Pfeile zeigen die Zellen an, die nur positiv für Nanos1 sind. Weiße Pfeile zeigen Zellen an, die nur positiv für EdU sind. A-C-Panels sind zusammengeführte Bilder für DNA (blau), EdU (grün) und Nanos1 (Magenta). A'-C' sind Panels nur für EdU-Bilder; A''-C'' sind nur für Nanos1 FISH-Bilder. Maßstabsbalken = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) Die Quantifizierung von EdU- und/oder Nanos1-positiven Zellen auf der basalen Seite des Tentakels (Quantifizierungsfläche = 30,10 μm2 Quadrat, n = 6, insgesamt 249 Zellen). EdU+ Nanos1− Zellen, 14,46%; EdU+ Nanos1+ Zellen, 19,79%; EdU− Nanos1+ Zellen, 26,32%; EdU− Nanos1− Zellen, 39,44%. (E) Schematische Darstellung eines Cladonema medusa-Tentakels von der adaxialen Seite. Die Gesamtverteilung von EdU+-Zellen und Nanos1+-Zellen ist in E bzw. E' dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Zusammensetzung verschiedener PCR-Reaktionen und Puffer in diesem Protokoll. Um das Volumen des PCR-Produkts (X μL) in der Ligationsreaktion zu berechnen, beachten Sie den Hinweis nach Protokollschritt 1.4. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Proliferierende Zellen und Stammzellen sind wichtige zelluläre Quellen in verschiedenen Prozessen wie Morphogenese, Wachstum und Regeneration21,22. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Co-Färbung des Stammzellmarkers Nanos1 durch FISH- und EdU-Markierung in Cladonema medusae. Frühere Arbeiten mit EdU- oder BrdU-Markierung haben vorgeschlagen, dass proliferative Zellen in den Tentakelkolben16,17 lokalisieren, aber ihre molekularen Eigenschaften waren unklar. Die vorliegende Studie zeigt die gleichzeitige Bestimmung der Verteilung proliferativer Zellen und die Lokalisation von nanos1+ stammartigen Zellen (Abbildung 4). Die Ergebnisse zeigten, dass einige proliferative Zellen Nanos1 exprimierten, andere Zellen jedoch nur mit EdU markiert waren und Nanos1 nicht exprimierten, was auf die Existenz von Stammzellheterogenität oder möglicherweise anderer proliferativer Zellen hindeutet. Es wird interessant sein, die detaillierte Stammzellverteilung während verschiedener Prozesse in Cladonema zu analysieren, einschließlich Tentakelverzweigung, Gewebehomöostase, Organregeneration und Keimzellerhaltung.

Der größte Engpass für die Visualisierung von Stammzellen in Tieren ist die erstmalige Identifizierung von Stammzellmarkern. Bei Nesseltieren wurden Stammzellmarker in Nicht-Hydrozoennicht identifiziert 3, und daher bleibt die direkte Anwendung von FISH für Stammzellmarker in diesem Stadium auf Hydrozoen beschränkt. Dennoch ermöglicht FISH den Nachweis spezifischer Genexpression auf zellulärer Ebene, und so kann diese Methode durch den Wechsel der Sonden erweitert werden, um die räumlichen Expressionsmuster beliebiger Gene von Interesse im Detail zu beobachten. Zum Beispiel können wir mit Markern von Vorläuferzellen und differenzierten Zellen die Verteilung bestimmter Zelltypen in den Cladonema-Tentakeln nachweisen. Als Vorbehalt muss das vorliegende Protokoll möglicherweise in Abhängigkeit von den interessierenden Genen aufgrund von Unterschieden in den Expressionsniveaus und der mRNA-Stabilität modifiziert werden. Insbesondere unspezifische Signale und schwache Signale sind häufige Probleme im Zusammenhang mit FISH. Die Änderung der Hybridisierungszeit und -temperatur unter Verwendung von Bleichreagenzien (Formamid oder Methanol) und die Anpassung anderer Parameter (TSA-Reaktionszeit, Proteinase-K-Behandlung, Waschen nach der Hybridisierung) kann zu klareren Signalen und weniger unspezifischen Signalen führen23,24. Es ist auch wichtig, ein FISH-Protokoll auszuwählen, das für das verwendete Tiermodell geeignet ist, da ein FISH-Protokoll möglicherweise nicht auf andere Arten anwendbar ist, selbst nicht innerhalb desselben Taxons 7,25,26.

Die EdU-Markierung wird im Allgemeinen zum Nachweis proliferativer Zellen verwendet, könnte jedoch für verschiedene experimentelle Zwecke verwendet werden, indem die Konzentration und Inkubationszeit variiertwerden 27. Um proliferierende Zellen zu erkennen, ist es wichtig, eine erfolgreiche Dauer und Konzentration für den Einbau von EdU zu bestimmen. In der in dieser Arbeit verwendeten Pulsmarkierung wurden nur proliferative Zellen markiert, die die S-Phase für kurze Zeit durchlaufen hatten, und ähnliche kurze Inkubationsmethoden wurden zum Nachweis proliferierender Zellen in anderen Nesseltierenverwendet 6,28,29. Im Gegensatz dazu kann die Kombination von längerem EdU-Einbau und Nanos1-FISH das Vorhandensein von langsam zyklischen oder ruhenden Stammzellen aufzeigen27. Es ist auch möglich, nicht nur proliferative Zellen zu markieren, sondern auch endzyklische Zellen, die eine DNA-Synthese ohne Teilung durchlaufen haben. Darüber hinaus können wir durch die Verfolgung von EdU-markierten Zellen über einen längeren Zeitraum die zelluläre Kapazität für Migration und Differenzierung bestimmen, die mit proliferativen Zellen und ihrer Zelllinie verbundenist 6,30.

Während die Kombination von FISH und EdU- oder BrdU-Färbung verwendet wurde 7,31, kann die hier etablierte Methode leicht auf andere marine Wirbellose und Nicht-Modelltiere, einschließlich verschiedener Quallenarten, angewendet werden. Die EdU-Färbung ist einfacher und empfindlicher als die BrdU-Färbung18 und ermöglicht mit ihrer kurzen Inkubationszeit den Nachweis proliferierender Zellen, im Gegensatz zur vorherigen Studie, in der EdU für die langfristige Zellmarkierung verwendetwurde 7. In den letzten Jahren sind mit der Weiterentwicklung von Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation Genom- und Genexpressionsinformationen für viele Arten verfügbar geworden. Die Identifizierung von Stammzellen und proliferativen Zellen wird weiterhin ein effektiver Ansatz sein, um die Heterogenität und Vielfalt von Stammzellen zu verstehen und Einblicke in die zelluläre Dynamik zu geben, die verschiedenen biologischen Phänomenen zugrunde liegt.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von AMED unter der Fördernummer JP22gm6110025 (an Y.N.) und von der JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (an Y.N.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

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References

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Developmental Biology Ausgabe 186 FISH EdU Quallen Medusa Cladonema pacificum Stammzellen Zellproliferation
Fluoreszierende <em>In situ</em> Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle <em>Cladonema pacificum</em>
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Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

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