本文详细介绍了鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备与评价方法 体外 和 体内
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
表位肽因其安全性高、特异性强和制备方便，在肿瘤疫苗领域受到广泛关注；特别是某些MHC I类限制性表位能够诱导有效的细胞毒性T淋巴细胞活性，从而清除肿瘤细胞。此外，鼻腔给药由于使用便捷且可提高患者依从性，已成为一种有效且安全的肿瘤疫苗递送方式。然而，表位肽因免疫原性较弱且递送效率不足，难以适用于鼻腔递送。纳米乳剂（NEs）是一种热力学稳定的体系，可负载抗原并直接递送至鼻黏膜表面。Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）是层粘连蛋白的核心五肽，为人类呼吸道上皮细胞表达的整合素结合肽。本研究开发了一种含有合成肽IKVAV-OVA的鼻内自组装表位肽纳米乳剂肿瘤疫苗。257-264 (I-OVA) 通过低能乳化法制备。IKVAV 与 OVA 的组合257-264 可增强鼻黏膜上皮细胞对抗原的摄取。本文建立了一种研究其理化特性的方案，包括透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）检测；通过黏蛋白存在条件下的稳定性评估；利用BEAS-2B细胞活力及C57BL/6小鼠鼻腔和肺组织毒性检测评价其细胞毒性；通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析细胞摄取情况；以及通过小动物成像研究释放特性 体内；并利用E.G7荷瘤模型评估该疫苗的保护性和治疗性效果。我们预期该方案将为新型T细胞表位肽黏膜疫苗的未来研发提供技术和理论依据。
引言
作为最重要的公共卫生创新之一，疫苗在应对全球人类疾病负担方面发挥着关键作用1。例如，目前已有超过120种针对新冠肺炎的候选疫苗正在接受测试，其中一些已在多个国家获批使用2。近期研究表明，癌症疫苗通过引导癌症患者的免疫系统将肿瘤抗原识别为外来物质，显著推动了临床癌症治疗的进展3。此外，位于肿瘤细胞内或细胞外的多种T细胞表位可用于设计多肽疫苗，由于其避免了放疗和化疗所伴随的显著毒性，因此在转移性癌症治疗中展现出优势4,5。自20世纪90年代中期以来，肿瘤治疗的临床前和临床试验主要采用抗原多肽疫苗，但极少有疫苗在癌症患者中表现出足够的治疗效果6。此外，含多肽表位的癌症疫苗免疫原性较弱且递送效率不足，这可能是由于细胞外多肽在注射部位迅速扩散并快速降解，导致免疫细胞对抗原的摄取不足所致7。因此，有必要通过疫苗递送技术来克服这些障碍。
OVA257-264 是一种以融合蛋白形式表达的 MHC I 类分子结合表位（257-264），是常用的模型表位8。此外，OVA
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
动物实验按照《实验动物 动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。 小鼠通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）实施安乐死。
1. I-OVA 纳米乳剂的制备
- 将1 mg单磷酰脂质A（MPLA）与100 µL DMSO混合，涡旋5分钟，并在室温（RT）下静置4小时，使其完全溶解。
- 定量加入Tween 80和I-OVA并混合。
注意：Tween 80与I-OVA按25:1的质量比混合19。 - 将角鲨烯加入第1.2步制备的混合物中（Smix:角鲨烯 = 7:3）。
- 将100 µL MPLA溶液（10 mg/mL）加入第1.3步制备的混合物中。
- 采用低能乳化法配制纳米乳剂疫苗19：将混合溶液逐滴加入约等于总体积70%的水中，轻轻搅拌，得到透明且易于流动的混合物。
注意：空白乳剂（BNE）对照组采用相同方法制备，仅以水替代I-OVA。
2. 理化性质表征与稳定性
注意：在完成步骤 2.1-2.....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
根据该方案，我们完成了制备和 体外 和 体内 鼻部肿瘤纳米疫苗递送的实验评估。透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）是评估纳米疫苗表面zeta电位和粒径等基本特性的重要手段。图1）。BEAS-2B 上皮细胞是用于筛选的有用模型 体外 鼻用疫苗的毒性测试图 2A）。经H染色的显微照片&我们证明I-OVA NE无明显黏膜毒性，包括组织损伤、出血或炎性细胞浸润（图2B）。鼻腔中 BEAS-2B 细胞对抗原的有效摄取是启动抗原提呈并引发后续免疫反应的前提条件（图3IVIS 系统有助于阐明 I-OVA 纳米乳剂的缓释效应 体外 并表明该纳米疫苗可延缓快速释放，延长在鼻腔区域的停留时间，并提高细胞对肽段的摄取效率（图4）。预防性保护模型和治疗性.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
用免疫细胞膜功能化的纳米疫苗在疾病靶向治疗中具有显著优势，其独特的肿瘤趋向性、特异性靶点识别、长循环时间、增强的细胞间相互作用以及低系统毒性等特性可将副作用降至最低。这些纳米疫苗还可轻松整合其他治疗模块，实现对癌症的协同治疗16,20。通过调控纳米疫苗的尺寸、形状和电荷等理化性质，可获得理想的生物学特性。因此，纳米疫苗已在多种应用中发挥重要作用21。这些理化特性是决定纳米疫苗摄取效率与毒性的关键因素，只有通过合理设计和调控才能使其呈现无毒特性22。因此，对包括形状、尺寸和电荷在内的理化特性的研究方案至关重要。透射电子显微镜（TEM）是一种高精度仪器，已在科学界广泛应用多年23，已成为理解纳米结构材料特性并调控其行为的重要工具。此外，原子力显微镜（AFM）已成为生物样品纳米力学表征的一种强大技术24，可在原子水平上分析表面细节，同时提.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到中国国家自然科学基金项目（编号：31670938、32070924、32000651）、重庆市自然科学基金项目（编号：2014jcyjA0107、2019jcyjA-msxmx0159）、陆军军医大学专项项目（编号：2020XBK24、2020XBK26）以及国家级大学生创新创业训练计划项目（编号：202090031021、202090031035）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔板 | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 微孔板读数仪 | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 试剂盒 | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R 离心机 | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC标记的I-OVA | 上海博泰 生物科技有限公司 | NA | |
| HF 90/240 培养箱 | Heal Force, 瑞士 | NA | |
| HPLC | 上海博泰生物科技有限公司 | E2695 | |
| 倒置显微镜 | Nikon, 日本 | DSZ5000X | |
| IPC-208 | 重庆大学，中国 | NA | |
| IVIS 成像系统 | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 透射电子显微镜 | 日本电子株式会社 | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS 粒径分析仪 | Malvern Instruments Ltd., 英国 | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. | tlrl-mpla | |
| 硫酸新霉素软膏 | 上海医药集团信谊药业有限公司 | H31022262 | |
| OVA257–264 | 上海博泰 生物科技有限公司 | NA | |
| RPMI 1640 培养基 | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| IKVAV-PA 与合成肽（I-OVA）的偶联物 | 上海博泰 生物科技有限公司 | NA | |
| 蔡司 LSM800 激光扫描共聚焦荧光显微镜 | Zeiss, 德国 | Zeiss LSM800 |
参考文献
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
