Summary
Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.
Abstract
Epitoppeptide haben auf dem Gebiet der Tumorimpfstoffe aufgrund ihrer Sicherheit, hohen Spezifität und bequemen Herstellung große Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere einige MHC-I-restriktive Epitope können eine effektive zytotoxische T-Lymphozytenaktivität induzieren, um Tumorzellen zu beseitigen. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung aufgrund ihrer Bequemlichkeit und verbesserten Patientencompliance eine effektive und sichere Verabreichungstechnik für Tumorimpfstoffe. Epitoppeptide sind jedoch aufgrund ihrer schlechten Immunogenität und mangelnden Abgabeeffizienz für die nasale Verabreichung ungeeignet. Nanoemulsionen (NEs) sind thermodynamisch stabile Systeme, die mit Antigenen beladen und direkt an die Nasenschleimhautoberfläche abgegeben werden können. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ist das Kernpentapeptid von Laminin, einem Integrin-bindenden Peptid, das von menschlichen Epithelzellen der Atemwege exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde ein intranasaler selbstassemblierter Epitoppeptid-NE-Tumorimpfstoff, der das synthetische Peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) enthielt, durch eine niederenergetische Emulgiermethode hergestellt. Die Kombination von IKVAV und OVA257-264 kann die Antigenaufnahme durch die Epithelzellen der Nasenschleimhaut verbessern. Hier erstellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS); Stabilität in Gegenwart von Muzinprotein; Toxizität durch Untersuchung der Zellviabilität von BEAS-2B-Zellen und des Nasen- und Lungengewebes von C57BL/6-Mäusen; zelluläre Aufnahme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM); Freisetzungsprofile durch Bildgebung von Kleintieren in vivo; und die schützende und therapeutische Wirkung des Impfstoffs unter Verwendung eines E.G7-Tumor-tragenden Modells. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Epitop-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.
Introduction
Als eine der wichtigsten Innovationen im Bereich der öffentlichen Gesundheit spielen Impfstoffe eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung der globalen Krankheitslast beim Menschen1. So werden derzeit mehr als 120 Impfstoffkandidaten gegen COVID-19-Erkrankungen getestet, von denen einige in vielen Ländern zugelassen sind2. Jüngste Berichte besagen, dass Krebsimpfstoffe den Fortschritt klinischer Krebsbehandlungen effektiv verbessert haben, da sie das Immunsystem von Krebspatienten dazu bringen, Antigene als körperfremd zu erkennen3. Darüber hinaus können mehrere T-Zell-Epitope, die sich innerhalb oder außerhalb von Tumorzellen befinden, zur Entwicklung von Peptidimpfstoffen verwendet werden, die sich bei der Behandlung von metastasierendem Krebs als vorteilhaft erwiesen haben, da sie nicht die signifikante Toxizität aufweisen, die mit Strahlen- und Chemotherapie verbunden ist 4,5. Seit Mitte der 1990er Jahre werden präklinische und klinische Studien zur Tumorbehandlung hauptsächlich mit Antigenpeptid-Impfstoffen durchgeführt, aber nur wenige Impfstoffe zeigen eine ausreichende therapeutische Wirkung bei Krebspatienten6. Darüber hinaus weisen Krebsimpfstoffe mit Peptidepitopen eine schlechte Immunogenität und eine unzureichende Verabreichungseffizienz auf, was auf den schnellen Abbau extrazellulärer Peptide zurückzuführen sein kann, die schnell von der Verabreichungsstelle diffundieren, was zu einer unzureichenden Antigenaufnahme durch Immunzellen führt7. Daher ist es notwendig, diese Hindernisse mit Technologie zur Verabreichung von Impfstoffen zu überwinden.
OVA 257-264, das MHC-Klasse-I-bindende257-264-Epitop, das als Fusionsprotein exprimiert wird, ist ein häufig verwendetes Modellepitop8. Darüber hinaus ist OVA257-264 entscheidend für die adaptive Immunantwort gegen Tumore, die von der zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort (CTL) abhängt. Sie wird durch antigenspezifische CD8+ T-Zellen im Tumor vermittelt, die durch das OVA257-264 Peptid induziert werden. Es ist gekennzeichnet durch unzureichendes Granzym B, das von zytotoxischen T-Zellen freigesetzt wird, was zur Apoptose der Zielzellen führt8. Die Verabreichung von freiem OVA257-264-Peptid kann jedoch eine geringe CTL-Aktivität induzieren, da die Aufnahme dieser Antigene in unspezifischen Zellen und nicht in antigenpräsentierenden Zellen (APCs) erfolgt. Das Fehlen einer geeigneten Immunstimulation führt zu einer CTL-Aktivität5. Daher erfordert die Induktion einer wirksamen CTL-Aktivität erhebliche Fortschritte.
Aufgrund der Barriere durch Epithelzellen und der kontinuierlichen Schleimsekretion werden Impfantigene schnell aus dem Nasenschleim entfernt 9,10. Die Entwicklung eines effizienten Impfstoffvektors, der das Schleimhautgewebe passieren kann, ist von entscheidender Bedeutung, da sich die antigenpräsentierenden Zellen unter dem Schleimhautepithel befinden9. Die intranasale Injektion von Impfstoffen induziert theoretisch eine Immunität der Schleimhäute zur Bekämpfung von Schleimhautinfektionen11. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung eine effektive und sichere Verabreichungsmethode für Impfstoffe, da sie bequem ist, die Verabreichung des Darms vermeidet und dieCompliance der Patienten verbessert 7. Daher ist die nasale Verabreichung ein gutes Mittel zur Verabreichung des neuartigen Peptid-Epitop-Nanoimpfstoffs.
Es wurden mehrere synthetische Biomaterialien entwickelt, um Epitope von Zellgewebe und Zell-Zell-Interaktionen zu kombinieren. Bestimmte bioaktive Proteine, wie z. B. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), wurden als Teil der Struktur des Hydrogels eingeführt, um Bioaktivität zu verleihen12. Dieses Peptid trägt wahrscheinlich zur Zellanhaftung, -migration und -ausbildungbei 13 und bindet Integrine α 3β1 und α6β1, um mit verschiedenen Krebszelltypen zu interagieren. IKVAV ist ein Zelladhäsionspeptid, das sich von der Laminin-Basalmembranprotein-α-1-Kette ableitet, die ursprünglich zur Modellierung der neuronalen Mikroumgebung und zur neuronalen Differenzierung verwendet wurde14. Daher ist es wichtig, ein effizientes Verabreichungsvehikel für diesen neuartigen Impfstoff zu finden, um Krankheiten zu kontrollieren.
Kürzlich beschriebene Emulsionssysteme wie W805EC und MF59 wurden ebenfalls für die Verabreichung von inaktiviertem Influenza-Impfstoff oder rekombinantem Hepatitis-B-Oberflächenantigen in die Nasenhöhle hergestellt und es wurde gezeigt, dass sie sowohl eine mukosale als auch eine systemische Immunität auslösen15. Nanoemulsionen (NEs) haben im Vergleich zu partikulären Schleimhautverabreichungssystemen die Vorteile einer einfachen Verabreichung und einer bequemen Co-Bildung mit wirksamen Adjuvantien16. Es wurde berichtet, dass Nanoemulsionsimpfstoffe den allergischen Phänotyp nachhaltig verändern, anders als bei der herkömmlichen Desensibilisierung, was zu langfristigen unterdrückenden Wirkungen führt17. Andere berichteten, dass Nanoemulsionen in Kombination mit Mtb-spezifischen immundominanten Antigenen starke Schleimhautzellantworten induzieren und einen signifikanten Schutz verleihen könnten18. Daher wurde ein neuartiger intranasaler selbstassemblierter Nanoimpfstoff mit dem synthetischen Peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, das Peptid bestehend aus IKVAV gebunden an OVA257-264) entwickelt. Es ist wichtig, diesen neuartigen Nanoimpfstoff systematisch zu bewerten.
Ziel dieses Protokolls ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Toxizität und die Stabilität des Nanoimpfstoffs systematisch zu bewerten, festzustellen, ob die Antigenaufnahme und die schützende und therapeutische Wirkung mit technischen Mitteln verbessert werden, und die wichtigsten experimentellen Inhalte zu erläutern. In dieser Studie haben wir eine Reihe von Protokollen erstellt, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Stabilität zu untersuchen, das Ausmaß der Toxizität der I-OVA NE zu BEAS-2B-Zellen durch CCK-8 zu bestimmen und die Antigen-präsentierende Fähigkeit von BEAS-2B-Zellen zum Impfstoff mittels konfokaler Mikroskopie zu beobachten, die Freisetzungsprofile dieses neuartigen Nanoimpfstoffs in vivo und in vitro zu bewertenund die schützende und therapeutische Wirkung dieses Impfstoffs anhand eines E.G7-OVA-Tumor-tragenden Mausmodells nachzuweisen.
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Protocol
Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) durchgeführt und von der Laboratory Animal Welfare and Ethics Commission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital euthanasiert.
1. Vorbereitung der I-OVA NE
- Mischen Sie 1 mg Monophosphoryllipid A (MPLA) mit 100 μl DMSO, wirbeln Sie 5 Minuten lang und lassen Sie es 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) stehen, um sich vollständig aufzulösen.
- Fügen Sie Tween 80 und I-OVA quantitativ hinzu und mischen Sie.
HINWEIS: Tween 80 und I-OVA wurden in einem Massenverhältnis von 25:119 gemischt. - Fügen Sie Squalen zu der in Schritt 1.2 zubereiteten Mischung hinzu (7:3, Smix: Squalen).
- Fügen Sie 100 μl MPLA-Lösung (10 mg/ml) zu der in Schritt 1.3 hergestellten Mischung hinzu.
- Bereiten Sie den Nanoemulsionsimpfstoff mit energiesparenden Emulgiermethoden19 vor: Geben Sie die gemischte Lösung bei ca. 70 % des Gesamtvolumens zu Wassertröpfchen und rühren Sie vorsichtig um, um eine transparente und leicht fließende Mischung zu erhalten.
HINWEIS: Die BNE-Kontrolle (Blindemulsion) wurde nach der gleichen Methode hergestellt, wobei Wasser durch I-OVA ersetzt wurde.
2. Physikalisch-chemische Charakterisierung und Stabilität
HINWEIS: Beurteilen Sie die Tröpfchengrößenverteilung, das Zetapotenzial und andere physikalisch-chemische Daten des I-OVA NE-Impfstoffs gemäß den Schritten 2.1-2.3; Durchführung der morphologischen Charakterisierung des I-OVA NE-Impfstoffs gemäß den Schritten 2.4-2.7; und untersuchen Sie die 3D-Struktur des I-OVA NE-Impfstoffs nach den Schritten 2.8-2.9.
- Mischen Sie 50 mg Muzinprotein mit 100 ml Wasser für Injektionszwecke, um eine 0,05%ige Muzinlösung herzustellen.
- 4 mg/ml I-OVA NE 200-fach mit 0,05 mg/ml Muzinprotein oder deionisiertem Wasser verdünnen.
- Beobachten Sie die Partikelgrößen, das Zetapotential, den Polydispersitätsindex (PDI) und die elektrophoretische Mobilität bei 25 °C mit einem Nanoanalysator19.
- 10 μl I-OVA NE 200-fach mit 2 ml deionisiertem Wasser verdünnen.
- Geben Sie 5 μl vorverdünnten I-OVA NE-Impfstoff (Schritt 2.4) auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter und bedecken Sie es 3 Minuten lang mit 10 μl 1%iger Phosphowolframsäure.
- Entfernen Sie die überschüssige Phosphowolframsäure mit Filterpapier.
- Abrufen von Bildern mit TEM. Legen Sie eine 50-fach verdünnte 10-μl-Probe auf ein 100-mesh-Kohlenstoffkupfergitter und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) stehen, bevor Sie 10 μl Phosphowolframsäure (1%, pH 7,4) hinzufügen. Untersuchen Sie alle Proben mit TEM bei einer Spannung von 120 kV.
- Charakterisieren Sie die molekulare Morphologie der I-OVA NE mit einem hochauflösenden Rasterkraftmikroskop. Die Farbbilder von I-OVA NE sind unter folgenden Bedingungen zu erhalten: für Wolframsonden (Kraftkonstante: 0,06 N·m-1); Scanbereich: 450 nm x 450 nm; Tapping-Modus: Imaging-Modus; und Scanmethode: Punkt-für-Punkt-Scannen bei RT.
3. In-vitro- und In-vivo-Toxizitätstests
ANMERKUNG: Die In-vitro-Toxizität des I-OVA NE-Impfstoffs wurde nach den Schritten 3.1 bis 3.9 und die In-vivo-Toxizität des I-OVA NE-Impfstoffs nach den Schritten 3.10 bis 3.13 bewertet.
- Humane BEAS-2B-Epithelzellen werden nach den Schritten 3.1.1-3.1.4 wiederbelebt und in einem vollständigen Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator kultiviert.
Anmerkungen: Um das vollständige Nährmedium herzustellen, fügen Sie dem RPMI-1640-Medium fötales Kälberserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin in Endkonzentrationen von 10 % bzw. 1 % hinzu.- Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Entfernen Sie die in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Zellfläschchen und tauen Sie sie schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
- Nach dem Auftauen werden die Zellen schnell in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert, 2 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzugefügt und 5 Minuten lang bei 129 x g zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 129 x g.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 6 ml des vollständigen Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und überführen Sie die Zellen in einen T25-Kulturkolben, um die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator zu kultivieren.
- Wenn die Zelldichte 80%-90% erreicht, verwerfen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25%iges Trypsin hinzu, um die Zellen 1-2 Minuten lang zu verdauen. Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie sofort 4 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
- Mischen und saugen Sie die Proben in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 129 x g .
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI-1640 Komplettmedium. Verwenden Sie 20 μl für die Zellzählung und verdünnen Sie die Zellen auf 1 x 105 Zellen/ml.
- Die BEAS-2B-Zellen werden mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen/Well in 96-Well-Platten in 100 μl RPMI-1640 Komplettmedium geplättet und die Platten für 24 h bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator vorinkubiert.
- Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 100 μl I-OVA NE, 100 μl I-OVA+BNE (physikalisch gemischt) und 100 μl I-OVA vorverdünnt mit einem vollständigen Wachstumsmedium in verschiedenen Endkonzentrationen (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml) mit BNE als Kontrolle hinzu. 24 h bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Fügen Sie den Negativkontrollgruppen 100 μl vollständiges Wachstumsmedium und den Positivkontrollgruppen 100 μl Zellsuspension (1 x 105/ml) hinzu. - Entfernen Sie das Medium und geben Sie 90 μl vollständiges Wachstumsmedium und 10 μl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung der Platte.
- Inkubieren Sie die Platte für 2 h bei 37 °C in einem 5% CO2 - Inkubator.
- Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm mit einem enzymmarkierten Plattenleser.
- Berechnen Sie das Überlebensverhältnis von BEAS-2B-Zellen wie in der folgenden Gleichung angegeben:
(OD450-Probe − OD450 Negativkontrolle/OD450 Positivkontrolle − OD450 Negativkontrolle) × 100 % - 6 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen (n = 5 in jeder Gruppe) aufgeteilt und zur Induktion mit 4 % Isofluran betäubt. Pflegen Sie die Anästhesie mit 2% Isofluran. Verwenden Sie Neomycinsulfat-Salbe auf den Augen der Mäuse, um Trockenheit vorzubeugen.
- Verwenden Sie 10-μl-Pipettenspitzen, um die nasale Immunisierung der Mäuse mit 10 μl/Nasenloch I-OVA, I-OVA+BNE und IOVA NE in einer Dosierung von 4 mg/ml für alle 3 Tage durchzuführen. Verwenden Sie BNE und PBS als experimentelle Kontrolle.
Anmerkungen: Bieten Sie thermische Unterstützung, bis sich das Tier von der Narkose erholt hat. - Euthanasieren Sie alle Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital an Tag 4.
- Schneiden Sie mit einer Schere ca. 3 mm dicke Proben des Nasengewebes ab und entfernen Sie das Lungengewebe.
- Fixieren Sie das Nasengewebe und das gesamte Lungengewebe 24 h lang in 4%igem Paraformaldehyd. Dehydrieren Sie das Gewebe durch einen seriellen Alkohol- und Xylolgradienten und betten Sie es dann in Paraffin ein. Die fertigen Wachsblöcke auf einem Paraffinschneider mit einer Dicke von 4 μm in Scheiben schneiden.
- Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Beobachten Sie dann die Schleimhauttoxizität, einschließlich Hyperämie, Ödemen, Infiltration neutrophiler Granulozyten und struktureller Schäden in der Nasenschleimhaut und im Lungengewebe, unter dem Mikroskop (100x und 200x)7.
4. In-vitro-Zellaufnahme
- BEAS-2B-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen/Well in 12-Well-Platten mit Deckgläsern in 2 mL des kompletten Nährmediums einfüllen und die Platten über Nacht bei 37 °C in einem5 % CO2 -Inkubator vorinkubieren.
- 100 μl FITC-markierte I-OVA NE (Reinheit: 98,3 %, vom Unternehmen hergestellt, 4 mg/ml) oder I-OVA (4 mg/ml) zu 900 μl Zellsuspension geben und 90 min bei 37 °C platzieren.
HINWEIS: Bereiten Sie die FITC-gekennzeichnete I-OVA NE wie in Schritt 4.1 beschrieben vor. Fügen Sie den Kontrollgruppen 1 ml des vollständigen Wachstumsmediums hinzu. - Nach der Behandlung dreimal mit 0,1 M PBS (1 ml/Well) für 30 min bei 37 °C waschen.
- Fixieren Sie diese Proben mit 4%igem Paraformaldehyd für 20 Minuten im Dunkeln. Nach der Fixierung wird das Paraformaldehyd entfernt und 3 mal mit 0,1 M PBS (1 ml/Well) für 30 min bei 37 °C gewaschen.
- Die Proben werden mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) in einer Endkonzentration von 10 μg/ml für 10 min im Dunkeln vorinkubiert und dann nach der Behandlung 5 mal mit 0,1 M PBS (1 mL/Well) für 30 min bei 37 °C gewaschen.
- Ermitteln Sie die zelluläre Aufnahme durch CLSM mit den folgenden Parametereinstellungen: Bildgröße: 512 px x 512 px, Scangeschwindigkeit: 8; Zeilenschritt: 1; Mittelwert: 2.
5. In-vivo-Freisetzung
- Betäuben Sie nackte Mäuse mit 4 % Isoflurangas und halten Sie die Anästhesie bei 2 % Isofluran aufrecht. Immunisieren Sie Nacktmäuse intranasal mit 10 μl PE-markierten I-OVA in 4 mg/ml oder PE-markierten I-OVA NE in 4 mg/ml in jedem Nasenloch.
- Bei 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h und 24 h werden alle Mäuse unter Narkose vom IVIS-System erfasst.
- Führen Sie unmittelbar vor der intranasalen Verabreichung einen Hintergrundscan durch, um einen Schwellenwert (Min = 1,06 x 106) zu ermitteln, um die zu allen Zeitpunkten aufgenommenen Bilder anzupassen.
- Klicken Sie auf die Living Image-Software, um die Sequenz zu starten, und klicken Sie auf Initialisieren, um das IVIS-System zu initialisieren
- Bei der Initialisierung leuchtet die Temperaturstatusanzeige in der IVIS-Erfassungszentrale rot. Wenn die Temperaturstatusanzeige auf grün wechselt, kann eine Bildgebung durchgeführt werden.
- Klicken Sie auf Imaging-Assistent , und wählen Sie dann im angezeigten Dialogfeld Fluoreszenz aus.
- Passen Sie die folgenden Parameter an: Belichtungszeit: Automatik, Binning: 8, Blende: 2, Sichtfeld: D.
- Wählen Sie den 620-nm-Anregungsfilter und den 670-nm-Emissionsfilter. Klicken Sie auf Sequenz erfassen, um das Bild zu erfassen .
- Verarbeiten Sie die Live-Bilder aller Mäuse und die Strahldichtedaten mit der Living Image-Software.
- Nachdem Sie das Bild aufgenommen haben, klicken Sie in der Werkzeugpalette auf ROI-Werkzeuge, wählen Sie Kreis und erstellen Sie einen ROI-Kreis .
- Klicken Sie auf ROIs messen , um einen quantitativen Wert für den ROI-Bereich zu erhalten.
6. In-vivo-Antitumor-Wirksamkeit
- Die E.G7-OVA-Zellen des Maus-Lymphoms aus EL4 werden mit einem vollständigen Nährmedium nach den Schritten 2.1.1-2.1.4 aufgefrischt und kultiviert.
Anmerkungen: Zur Herstellung eines vollständigen Wachstumsmediums für E.G7-OVA-Zellen wird das Medium RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin gemischt, das so eingestellt ist, dass es 1,5 g/l Natriumbicarbonat, 4,5 g/l Glukose, 10 mM HEPES und 1,0 mM Natriumpyruvat enthält und mit 0,05 mM 2-Mercaptoethanol und 0,4 mg/ml G418, 90%, und fötalem Kälberserum, 10%, ergänzt wird. - Subkultivieren Sie die Zellen im Verhältnis 1:2, wenn die Zellen eine Dichte zwischen 1 x 106 Zellen/ml und 1 x 107 Zellen/ml erreichen.
- Bewerten Sie die vorbeugende Schutzwirkung bei Mäusen wie in den Schritten 6.3.1-6.3.4 beschrieben.
- Teilen Sie 6 Wochen alte C57BL/6-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen ein (n = 8 in jeder Gruppe). Betäuben Sie nackte Mäuse mit 4 % Isoflurangas und halten Sie die Anästhesie mit 2 % Isofluran aufrecht. Rasieren Sie die hinteren Haare und die Neomycinsulfat-Salbe auf den Augen der Mäuse teilweise, um Trockenheit zu vermeiden.
- Intranasal immunisieren Sie die Mäuse mit 10 μl 1 mg/ml i-ova, BNE+I-OVA oder I-OVA NE in jedem Nasenloch, BNE (viermal mit PBS verdünnt) oder einer PBS-Kontrolle 3-mal mit einem 7-tägigen Abstand zwischen den einzelnen Immunisierungen.
- Impfen Sie alle Mäuse am 7. Tag nach der Endimmunisierung hypodermisch in den rechten Rücken mit 5 x 105 E. G7-OVA-Zellen.
- Überwachen Sie 0, 6, 9, 12, 15 und 18 Tage nach der endgültigen Immunisierung das Tumorvolumen, indem Sie zwei Achsen des Tumors mit digitalen Messschiebern messen, und zeichnen Sie das 30-Tage-Überleben (nach der endgültigen Immunisierung) der Mäuse auf.
- Die therapeutische Schutzwirkung auf Mäuse nach der Inokulation von E.G7-OVA-Zellen ist wie in den Schritten 6.4.1-6.4.3 beschrieben zu bewerten. Für die Gruppierung und den Umgang mit Mäusen siehe Schritt 6.3.1.
- An Tag 0 injizieren Sie die C57BL/6-Mäuse subkutan in den rechten Rücken mit E.G7-OVA-Zellen (5 x 105 Zellen/Maus).
- Immunisieren Sie 0, 7 und 14 Tage nach der Injektion alle Mäuse, die intranasal immunisiert wurden, dreimal mit 10 μl I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE (alle in Konzentrationen von 1 mg/ml), BNE oder PBS in jedes Nasenloch.
- Überwachen Sie 0, 6, 9, 12, 15 und 18 Tage nach der Injektion das Tumorvolumen und zeichnen Sie das 30-Tage-Überleben der Mäuse auf.
HINWEIS: Wenn das Tumorvolumen 3.000mm3 überschreitet, sollten die Mäuse aus humanen Gründen eingeschläfert werden, und diese Mäuse gelten in der Überlebenskurve als tot. Das Tumorvolumen wird durch eine modifizierte ellipsoidische Formel berechnet, wie in der folgenden Gleichung angegeben:
Volumen = π/6 x L x B2
wobei L für die Tumorlänge und W für die Tumorbreite steht (Längeneinheit: mm, Volumeneinheit:mm 3).
7. Statistische Analyse
- Analysieren Sie die Unterschiede in den Daten zwischen den verschiedenen Gruppen mit geeigneter statistischer Software mit einfaktorieller ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleichen oder einem Student-t-Test. Verwenden Sie die Kaplan-Meier-Methode, um die Überlebensergebnisse zu schätzen und die Gruppen mit Log-Rank-Statistiken zu vergleichen. Drücken Sie alle Ergebnisse als Mittelwert ± SD aus. Die Signifikanz der P-Werte P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001 wird in den Diagrammen mit *, ** bzw. *** dargestellt.
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Representative Results
Gemäß dem Protokoll haben wir die Vorbereitung und die experimentelle In-vitro- und In-vivo-Bewertung der Verabreichung des Nanoimpfstoffs für Nasentumore abgeschlossen. TEM, AFM und DLS sind effektive Mittel zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotenzials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs (Abbildung 1). BEAS-2B-Epithelzellen sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von nasalen Impfstoffen (Abbildung 2A). Die mit H&E gefärbten Mikrofotografien zeigen, dass I-OVA NE keine offensichtliche Schleimhauttoxizität aufwies, einschließlich Gewebeschäden, Blutungen oder entzündlicher Zellinfiltration (Abbildung 2B). Die effiziente Aufnahme des Antigens durch BEAS-2B-Zellen in der Nasenhöhle ist eine Voraussetzung für die Antigenpräsentation, um nachfolgende Immunantworten hervorzurufen (Abbildung 3). Das IVIS-System trägt dazu bei, den Retardeffekt von I-OVA NE in vitro aufzuklären und deutet darauf hin, dass dieser Nanoimpfstoff die schnelle Freisetzung verzögern, die Zeit im Nasenbereich verlängern und die Aufnahme von Peptiden in Zellen verbessern kann (Abbildung 4). Die präventiven Schutzmodelle und die therapeutischen Schutzmodelle spiegeln direkt die Schutzwirkung des I-OVA NE-Impfstoffs und die Fähigkeit des I-OVA NE-Impfstoffs wider, das Tumorwachstum zu hemmen und die mediane Überlebenszeit von Mäusen zu verlängern (Abbildung 5). Die oben genannten experimentellen Ergebnisse wurden von Yang et al.7 veröffentlicht.
Abbildung 1: Physikalische Eigenschaften und Stabilität von I-OVA NE . (A) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme (TEM), Maßstabsbalken = 100 nm. (B) Rasterkraftmikroskopie (AFM) Schliffbild. Die X- und Y-Achse haben jeweils eine Gesamtlänge von 450 nm. (C) Größe, Durchmesser und Verteilung. (D) Zetapotenzial und Verteilung von I-OVA NE-Analysen, die mit Nano ZS durchgeführt wurden. (E) Partikelgrößen, (F) Polydispersitätsindizes, (G) Zetapotentiale und (H) Elektrophoresemobilität von I-OVA NE in Muzinstabilitätsanalysen, die mit Nano ZS durchgeführt wurden. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Yang et al.7 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: In-vitro- und In-vivo-Toxizität von I-OVA NE. (A) Relative Lebensfähigkeit von BEAS-2B-Zellen in Kulturen, die 24 h lang unterschiedlichen Peptidkonzentrationen von I-OVA, BNE+I-OVA und I-OVA NE ausgesetzt waren. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt. (B) Mikroskopische Untersuchung pathologischer Schnitte der Nasenschleimhaut und des Lungengewebes, die 5 h nach der Provokation fixiert wurden. Die Bilder wurden mit 100- und 200-facher Vergrößerung aufgenommen. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Yang et al.7 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Zelluläre Aufnahme der I-OVA NE. In vitro konfokale Fluoreszenzbildgebung von BEAS-2B-Zellen, die 1 h lang mit I-OVA oder I-OVA NE behandelt wurden. Als Kontrolle wurde PBS verwendet, I-OVA wurde mit FITC (grüne Fluoreszenz) markiert und die Zellkerne wurden mit DAPI (blaue Fluoreszenz) gefärbt (Maßstabsbalken = 50 μm). Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Yang et al.7 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: In-vitro-Freisetzung von I-OVA NE. (A) In-vivo-Fluoreszenzbildgebung von PE-markierten I-OVA in der Nasenhöhle der Maus. Relative Fluoreszenzintensität gemessen bei 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h und 24 h nach nasaler Verabreichung von I-OVA oder I-OVA NE. (b) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 5) ausgedrückt. *: P < 0,05; **: P <0,01; und ***: P < 0,001. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Yang et al.7 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: In-vivo-Antitumor-Wirksamkeit von I-OVA NE . (A) Durchschnittliche Tumorwachstumskurven der geimpften Mäuse in den präventiven Schutzmodellen. (B) Prozentuale Überlebensrate der geimpften Mäuse in den präventiven Schutzmodellen. (C) Durchschnittliche Tumorwachstumskurven der geimpften Mäuse in den therapeutischen Schutzmodellen. (D) Prozentuale Überlebensrate der geimpften Mäuse in den therapeutischen Schutzmodellen. *: P < 0,05; **: P < 0,01; und ***: P < 0,001. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Yang et al.7 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Nanoimpfstoffe, die mit Immunozytenmembranen funktionalisiert sind, haben große Vorteile in der krankheitsspezifischen Therapie, und die Nebenwirkungen werden durch Eigenschaften wie einzigartigen Tumortropismus, die Identifizierung spezifischer Ziele, eine verlängerte Durchblutung, verstärkte interzelluläre Interaktionen und eine geringe systemische Toxizität minimiert. Sie lassen sich auch leicht in andere Behandlungsmodule integrieren, um Krebserkrankungen kooperativ zu behandeln16,20. Wünschenswerte Eigenschaften können durch die Kontrolle physikalischer und chemischer Eigenschaften wie Messung, Form und elektrische Ladung erreicht werden. Daher sind Nanoimpfstoffe in einer Vielzahl von Anwendungen wichtig geworden21. Diese Eigenschaften sind wichtige entscheidende Faktoren für die Aufnahme und Toxizität, und Nanoimpfstoffe können nur durch Manipulation ungiftig gemacht werden22. Daher ist dieses Protokoll für die Untersuchung physikalisch-chemischer Eigenschaften, einschließlich Form, Größe und Ladung, von entscheidender Bedeutung. TEM ist ein hochpräzises Instrument, das in der wissenschaftlichen Gemeinschaft seit vielen Jahren weit verbreitet ist23. Es ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug geworden, um die Eigenschaften von nanostrukturierten Materialien zu verstehen und ihr Verhalten zu manipulieren. Darüber hinaus hat sich die Rasterkraftmikroskopie (AFM) als leistungsfähige Technik zur nanomechanischen Charakterisierung biologischer Proben erwiesen24. Es kann hochauflösende 3D- und nanoskalige Informationen liefern und gleichzeitig Oberflächendetails auf atomarer Ebene analysieren. Neben der Bestimmung von Änderungen in der Partikelgrößenverteilung kann DLS sowohl Größe als auch Ladung messen, um Informationen über den Aggregatzustand von Nanopartikeln in Lösung25 zu liefern.
Es wurde berichtet, dass hohe Zetapotentialwerte für die gute Stabilität kolloidaler Suspensionen unerlässlich sind26. In dieser Studie haben wir diese Protokolle verwendet, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Nanoimpfstoffen mit TEM, AFM und DLS zu bewerten. Darüber hinaus enthält die Oberfläche der Nasenschleimhaut eine große Menge an Schleim, der für Schmierung, Feuchtigkeit und eine chemische Schutzbarriere sorgt. Dies kann auf die Wechselwirkung zwischen dem Schleim und einigen Antigenen oder Verabreichungssystemen zurückzuführen sein, was zur Akkumulation und "Einfängung" von Antigenen oder Verabreichungssystemen und deren anschließender Entfernung führt, was die Verabreichungseffizienz enorm verringert7. Es ist bekannt, dass die Stabilität von Nanoimpfstoffen für die nasale Verabreichung von entscheidender Bedeutung ist. Daher haben wir Nano ZS verwendet, um eine Reihe von Stabilitätsparametern zu bestimmen, darunter die Partikelgröße, die Polydispersitätsindizes, die Zetapotentiale und die Elektrophoresemobilität nach der Behandlung mit 0,5 % Muzinprotein.
Die In-vivo-Histokompatibilitäts- und In-vitro-Zellviabilitätstests zeigten, dass dieser neuartige Nanoimpfstoff im Bereich der getesteten Konzentrationen ungiftig war27. Humane normale Bronchialepithelzellen (BEAS-2B) sind Standardzelllinien, die zur Untersuchung der menschlichen Atemwege verwendet werden28. Aufgrund der geringeren Kosten, der Schnelligkeit und der minimalen ethischen Bedenken ist die In-vitro-Toxizitätsbewertung eine wichtige Methode. In dieser Studie wurde der in vitro Zellviabilitätstest mit einem CCK8-Assay bestimmt. Darüber hinaus wird die In-vivo-Toxizitätsbewertung in der Regel in Tiermodellen wie Mäusen und Ratten durchgeführt. Die histopathologische Untersuchung wird häufig an Geweben durchgeführt, die Nanopartikeln ausgesetzt sind, wie z. B. Herz, Auge, Gehirn, Leber, Niere, Lunge und Milz29. Daher haben wir diese Methoden verwendet, um die Toxizität dieses neuartigen Nanoimpfstoffs in vitro und in vivo zu bewerten.
Die Aufnahme und Verlängerung des Antigens ist Voraussetzung dafür, dass die Antigeneinreichung eine nachfolgende Immunantwort auslöst30. Es ist notwendig, dass die zelluläre Aufnahme von BEAS-2B und die Freisetzungsprofile des neuartigen Nanoimpfstoffs in vivo und in vitro bestimmt werden. CLSM ist die gebräuchlichste kommerzielle Implementierung der entsprechenden Technologie, die in der überwiegenden Mehrheit der bildgebenden Labore zu finden ist und ein breites Anwendungsspektrum hat. Diese Instrumente sind weit verbreitet und relativ einfach zu bedienen. Für die quantitative Datenerhebung sind sie jedoch in der Regel nicht optimal.
In unserem Protokoll wurde die zelluläre Aufnahme durch CLSM aufgrund der klaren Auflösung, der optischen Schnittfähigkeit und der Vielseitigkeit bei der 3D-Bildgebung nachgewiesen31. Darüber hinaus wurde IVIS verwendet, um die In-vivo-Freisetzungsprofile des neuartigen Nanomaterials zu erhalten, da es eine Bildgebungskammer mit Außenlicht bereitstellen kann, das für die quantitative Biolumineszenz- und Fluoreszenzbildgebung in vivo und in vitro ausgeschlossen ist. Daher haben wir in diesem Protokoll diese Methoden verwendet, um die zellulären Aufnahme- und Freisetzungsprofile neuartiger Nanoimpfstoffe in vivo und in vitro zu bestimmen.
Es ist auch wichtig, die Tumorwirksamkeit des neuartigen Nanoimpfstoffs zu bewerten. In unserer Studie wurde das Tumor-tragende Modell E.G7 verwendet, um die therapeutische und protektive Wirkung des Impfstoffs zu bestimmen. EL4-Zellen stammen aus den T-Lymphozyten von C57BL/6-Mäusen mit hochgradiger Malignität. E.G7-Zellen stammen von EL4-Lymphomzellen ab, die durch Elektroporation transfiziert wurden32. In unserer Studie induzierte dieser Nanoimpfstoff eine schützende Immunität in E.G7-OVA-tumortragenden Mäusen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es notwendig ist, eine Reihe von Protokollen zu erstellen, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Stabilität, die Toxizität, die Freisetzungsprofile, die zelluläre Aufnahme und die Antitumorwirkung von Nanoimpfstoffen in vitro und in vivo zu untersuchen. Diese Protokolle werden nützliche Ergebnisse für den neuartigen nasalen Nanoimpfstoff liefern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit hätten beeinflussen können.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt von Nr. 31670938, 32070924, 32000651 des National Natural Science Foundation Program of China, Nr. 2014jcyjA0107 und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, Nr. 2020XBK24 und Nr. 2020XBK26 der Sonderprojekte der Army Medical University sowie Nr. 202090031021 und Nr. 202090031035 des National Innovation and Entrepreneurship Program für College-Studenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
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