Summary
Qui, presentiamo metodi dettagliati per la preparazione e la valutazione del vaccino tumorale nanoemulsione autoassemblato nasale in vitro e in vivo.
Abstract
I peptidi epitopici hanno attirato l'attenzione diffusa nel campo dei vaccini tumorali a causa della loro sicurezza, alta specificità e produzione conveniente; in particolare, alcuni epitopi MHC I-limitati possono indurre un'efficace attività citotossica dei linfociti T per eliminare le cellule tumorali. Inoltre, la somministrazione nasale è una tecnica di consegna efficace e sicura per i vaccini tumorali grazie alla sua praticità e alla migliore compliance del paziente. Tuttavia, i peptidi epitopici non sono adatti per la consegna nasale a causa della loro scarsa immunogenicità e mancanza di efficienza di consegna. Le nanoemulsioni (NE) sono sistemi termodinamicamente stabili che possono essere caricati con antigeni e consegnati direttamente alla superficie della mucosa nasale. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) è il pentapeptide principale della laminina, un peptide legante l'integrina espresso dalle cellule epiteliali respiratorie umane. In questo studio, un vaccino antitumorale epitopo autoassemblato intranasale contenente il peptide sintetico IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) è stato preparato con un metodo di emulsificazione a bassa energia. La combinazione di IKVAV e OVA257-264 può migliorare l'assorbimento dell'antigene da parte delle cellule epiteliali della mucosa nasale. Qui, stabiliamo un protocollo per studiare le caratteristiche fisico-chimiche mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), microscopia a forza atomica (AFM) e diffusione dinamica della luce (DLS); stabilità in presenza di proteine mucina; tossicità esaminando la vitalità cellulare delle cellule BEAS-2B e dei tessuti nasali e polmonari dei topi C57BL/6; assorbimento cellulare mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM); rilasciare profili mediante imaging di piccoli animali in vivo; e l'effetto protettivo e terapeutico del vaccino utilizzando un modello portatore di tumore E.G7. Prevediamo che il protocollo fornirà indizi tecnici e teorici per lo sviluppo futuro di nuovi vaccini per mucosa peptidica epitopo delle cellule T.
Introduction
Come una delle innovazioni più importanti per la salute pubblica, i vaccini svolgono un ruolo chiave nella lotta contro l'onere globale delle malattie umane1. Ad esempio, attualmente sono in fase di sperimentazione oltre 120 vaccini candidati per le malattie COVID-19, alcuni dei quali sono stati approvati in molti paesi2. Rapporti recenti affermano che i vaccini contro il cancro hanno effettivamente migliorato i progressi dei trattamenti clinici contro il cancro perché dirigono il sistema immunitario dei malati di cancro a riconoscere gli antigeni come estranei al corpo3. Inoltre, epitopi multipli di cellule T situati all'interno o all'esterno delle cellule tumorali possono essere utilizzati per progettare vaccini peptidici, che hanno mostrato vantaggi nel trattamento dei tumori metastatici a causa della mancanza della significativa tossicità associata alla radioterapia e alla chemioterapia 4,5. Dalla metà degli anni 1990, studi preclinici e clinici per il trattamento del tumore sono stati condotti principalmente utilizzando vaccini peptidici antigene, ma pochi vaccini mostrano un adeguato effetto terapeutico sui malati di cancro6. Inoltre, i vaccini antitumorali con epitopi peptidici hanno scarsa immunogenicità e insufficiente efficienza di consegna, che può essere dovuta alla rapida degradazione dei peptidi extracellulari che diffondono rapidamente dal sito di somministrazione, il che porta a un insufficiente assorbimento dell'antigene da parte delle cellule immunitarie7. Pertanto, è necessario superare questi ostacoli con la tecnologia di consegna del vaccino.
OAV257-264, l'epitopo MHC di classe I legante 257-264 espresso come proteina di fusione, è un epitopo modello 8frequentemente usato. Inoltre, l'OAV257-264 è cruciale per la risposta immunitaria adattativa contro i tumori, che dipende dalla risposta citotossica dei linfociti T (CTL). È mediato dalle cellule T CD8+ antigene-specifiche nel tumore, che sono indotte dal peptide OAV257-264 . È caratterizzato da un insufficiente granzima B, che viene rilasciato dalle cellule T citotossiche, portando all'apoptosi delle cellule bersaglio8. Tuttavia, la somministrazione di peptidi OAV257-264 liberi può indurre poca attività CTL perché l'assorbimento di questi antigeni avviene in cellule non specifiche piuttosto che in cellule presentanti l'antigene (APC). La carenza di un'appropriata stimolazione immunitaria provoca l'attività CTL5. Pertanto, l'induzione di un'efficace attività CTL richiede notevoli progressi.
A causa della barriera fornita dalle cellule epiteliali e della continua secrezione di muco, gli antigeni del vaccino vengono rapidamente rimossi dalla mucosa nasale 9,10. Lo sviluppo di un vettore vaccinale efficiente che possa passare attraverso il tessuto mucoso è fondamentale perché le cellule presentanti l'antigene sono situate sotto l'epitelio mucoso9. L'iniezione intranasale di vaccini induce teoricamente l'immunità mucosale per combattere l'infezione della mucosa11. Inoltre, la somministrazione nasale è un metodo di somministrazione efficace e sicuro per i vaccini grazie alla sua praticità, all'evitamento della somministrazione intestinale e al miglioramento della conformità del paziente7. Pertanto, la consegna nasale è un buon mezzo di somministrazione per il nuovo nanovaccino epitopo peptidico.
Diversi biomateriali sintetici sono stati ideati per combinare epitopi di interazioni cellula-tessuto e cellula-cellula. Alcune proteine bioattive, come Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), sono state introdotte come parte della struttura dell'idrogel per conferire bioattività12. Questo peptide probabilmente contribuisce all'attaccamento, alla migrazione e alla crescita delle cellule13 e lega le integrine α 3β1 e α6β1 per interagire con diversi tipi di cellule tumorali. IKVAV è un peptide di adesione cellulare derivato dalla proteina di membrana basale della laminina αcatena 1 che è stata originariamente utilizzata per modellare il microambiente neurale e causare la differenziazione neuronale14. Pertanto, trovare un veicolo di consegna efficiente per questo nuovo vaccino è importante per il controllo della malattia.
Sistemi di emulsione recentemente riportati, come W805EC e MF59, sono stati anche composti per la somministrazione della cavità nasale del vaccino influenzale inattivato o dell'antigene di superficie dell'epatite B ricombinante e illustrati per innescare sia l'immunità mucosale che sistemica15. Le nanoemulsioni (NE) presentano i vantaggi di una facile somministrazione e di una comoda co-formazione con adiuvanti efficaci rispetto ai sistemi di erogazione della mucosa particolata16. È stato segnalato che i vaccini a nanoemulsione alterano il fenotipo allergico in modo prolungato diverso dalla desensibilizzazione tradizionale, che si traduce in effetti soppressivi a lungo termine17. Altri hanno riferito che le nanoemulsioni combinate con antigeni immunodominanti specifici per Mtb potrebbero indurre potenti risposte delle cellule della mucosa e conferire una protezione significativa18. Pertanto, è stato progettato un nuovo nanovaccino autoassemblato intranasale con il peptide sintetico IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, il peptide costituito da IKVAV legato all'OVA257-264). È importante valutare sistematicamente questo nuovo nanovaccino.
Lo scopo di questo protocollo è valutare sistematicamente le caratteristiche fisico-chimiche, la tossicità e la stabilità del nanovaccino, rilevare se l'assorbimento dell'antigene e gli effetti protettivi e terapeutici sono migliorati utilizzando mezzi tecnici ed elaborare i principali contenuti sperimentali. In questo studio, abbiamo stabilito una serie di protocolli per studiare le caratteristiche fisico-chimiche e la stabilità, determinare l'entità della tossicità dell'I-OVA NE alle cellule BEAS-2B da CCK-8 e osservare la capacità di presentare l'antigene delle cellule BEAS-2B al vaccino utilizzando la microscopia confocale, valutare i profili di rilascio di questo nuovo nanovaccino in vivo e in vitro.e rilevare l'effetto protettivo e terapeutico di questo vaccino utilizzando un modello murino portatore di tumore E.G7-OVA.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la linea guida sugli animali da laboratorio per la revisione etica del benessere degli animali (GB / T 35892-2018) e sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare. I topi sono stati sottoposti a eutanasia mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio all'1%.
1. Preparazione dell'I-OAV NE
- Mescolare 1 mg di monofosforil lipide A (MPLA) con 100 μL di DMSO, vortice per 5 minuti e lasciare riposare per 4 ore a temperatura ambiente (RT) per sciogliersi completamente.
- Aggiungere Tween 80 e I-OVA quantitativamente e mescolare.
NOTA: Tween 80 e I-OAV sono stati miscelati con un rapporto di massa di 25:119. - Aggiungere lo squalene nella miscela preparata al punto 1.2 (7:3, Smix: squalene).
- Aggiungere 100 μL di soluzione di MPLA (10 mg/ml) alla miscela preparata al punto 1.3.
- Preparare il vaccino in nanoemulsione utilizzando metodi di emulsificazione a bassa energia19: aggiungere la soluzione miscelata alle goccioline d'acqua a circa il 70% del volume totale e mescolare delicatamente per ottenere una miscela trasparente e facilmente scorrevole.
NOTA: Il controllo BNE (emulsione in bianco) è stato preparato con lo stesso metodo, sostituendo l'acqua con I-OVA.
2. Caratterizzazione fisico-chimica e stabilità
NOTA: Valutare la distribuzione delle dimensioni delle gocce, il potenziale zeta e altri dati fisico-chimici del vaccino I-OVA NE seguendo le fasi 2.1-2.3; eseguire la caratterizzazione morfologica del vaccino I-OVA NE seguendo le fasi 2.4-2.7; ed esaminare la struttura 3D del vaccino I-OVA NE seguendo i passaggi 2.8-2.9.
- Mescolare 50 mg di proteine muconiche con 100 ml di acqua per preparazioni iniettabili per preparare una soluzione di mucina allo 0,05%.
- Diluire 4 mg/mL I-OVA NE 200 volte con 0,05 mg/mL di proteine muconiche o acqua deionizzata.
- Osservare le dimensioni delle particelle, il potenziale zeta, l'indice di polidispersione (PDI) e la mobilità elettroforetica a 25 °C utilizzando un nanoanalizzatore19.
- Diluire 10 μL di I-OVA NE 200 volte con 2 ml di acqua deionizzata.
- Posizionare 5 μL di vaccino I-OVA NE prediluito (fase 2.4) su una griglia di rame rivestita di carbonio e coprirla con 10 μL di acido fosfotungstico all'1% per 3 minuti.
- Rimuovere l'acido fosfotungstico in eccesso con carta da filtro.
- Ottenere immagini utilizzando TEM. Posizionare un campione da 10 μL diluito 50 volte su una griglia di rame al carbonio a 100 maglie e lasciarlo riposare a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti prima di aggiungere 10 μL di acido fosfotungstico (1%, pH 7,4). Esaminare tutti i campioni mediante TEM ad una tensione di 120 kV.
- Caratterizzare la morfologia molecolare dell'I-OVA NEutilizzando un microscopio a forza atomica ad alta risoluzione. Ottenere le immagini a colori di I-OVA NE nelle seguenti condizioni: per sonde di tungsteno (costante di forza: 0,06 N·m-1); Intervallo di scansione: 450 nm x 450 nm; Modalità di tocco: modalità di imaging; e metodo di scansione: scansione punto per punto su RT.
3. Saggi di tossicità in vitro e in vivo
NOTA: La tossicità in vitro del vaccino I-OVA NE è stata valutata seguendo le fasi 3.1-3.9 e la tossicità in vivo del vaccino I-OVA NE è stata valutata seguendo le fasi 3.10-3.13.
- Rianimare le cellule epiteliali umane BEAS-2B seguendo le fasi 3.1.1-3.1.4 e coltivarle in un mezzo di crescita completo a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
NOTA: Per preparare il terreno di crescita completo, aggiungere siero bovino fetale (FBS) e penicillina/streptomicina al terreno RPMI-1640 a concentrazioni finali rispettivamente del 10% e dell'1%.- Accendere il bagnomaria e regolare la temperatura a 37 °C. Rimuovere i flaconcini di cellule congelati in azoto liquido e scongelarli rapidamente a bagnomaria a 37 °C.
- Dopo lo scongelamento, pipettare rapidamente le cellule in una provetta sterile da centrifuga da 15 ml, aggiungere 2 ml del terreno di coltura completo e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 2 ml del terreno di crescita completo per risospendere le cellule e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 6 ml di terreno di crescita completo per risospendere le cellule e trasferire le cellule in un pallone di coltura T25 per coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Quando la densità cellulare raggiunge l'80% -90%, scartare il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per digerire le cellule per 1-2 minuti. Quando si osserva l'arrotondamento delle cellule, aggiungere immediatamente 4 ml del mezzo di crescita completo per neutralizzare la tripsina.
- Mescolare e aspirare i campioni in una provetta sterile da 15 ml e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di mezzo completo RPMI-1640. Utilizzare 20 μL per il conteggio delle cellule e diluire le cellule a 1 x 105 cellule/ml.
- Placcare le celle BEAS-2B ad una densità di 1 x 104 celle/pozzetto in piastre a 96 pozzetti in 100 μL di RPMI-1640 mezzo completo e preincubare le piastre per 24 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Scartare il surnatante e aggiungere 100 μL di I-OVA NE, 100 μL di I-OVA+BNE (miscelati fisicamente) e 100 μL di I-OAV prediluiti con un mezzo di crescita completo a varie concentrazioni finali (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml), con BNE come controllo. Incubare per 24 h a 37 °C.
NOTA: Aggiungere 100 μL di terreno di crescita completo ai gruppi di controllo negativi e 100 μL di sospensione cellulare (1 x 105/mL) ai gruppi di controllo positivi. - Rimuovere il mezzo e aggiungere 90 μL di terreno di crescita completo e 10 μL di soluzione CCK-8 a ciascun pozzetto della piastra.
- Incubare la piastra per 2 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di piastre marcato con enzima.
- Calcolare il rapporto di sopravvivenza delle cellule BEAS-2B come indicato nella seguente equazione:
(Campione OD450− Controllo negativo OD450/Controllo positivo OD450− Controllo negativo OD450) × 100% - Dividere casualmente topi C57BL / 6 di 6 settimane in cinque gruppi (n = 5 in ciascun gruppo) e anestetizzarli con isoflurano al 4% per l'induzione. Mantenere l'anestesia con isoflurano al 2%. Utilizzare l'unguento al solfato di neomicina sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza.
- Utilizzare punte per pipette da 10 μL per eseguire l'immunizzazione nasale dei topi con 10 μL/narice di I-OVA, I-OVA+BNE e IOVA NE a 4 mg/ml per tutti i 3 giorni. Utilizzare BNE e PBS come controllo sperimentale.
NOTA: Fornire supporto termico fino a quando l'animale non si riprende dall'anestesia. - Eutanasia di tutti i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg 1% di sodio pentobarbital il giorno 4.
- Tagliare campioni di circa 3 mm di spessore di tessuti nasali con le forbici e rimuovere i tessuti polmonari.
- Fissare i tessuti nasali e l'intero tessuto polmonare in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Disidratare i tessuti attraverso un gradiente seriale di alcol e xilene e quindi incorporarli nella paraffina. Tagliare i blocchi di cera finiti su un'affettatrice di paraffina con uno spessore di 4 μm.
- Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina (H & E). Quindi, osservare al microscopio la tossicità della mucosa, tra cui iperemia, edema, infiltrazione di neutrofili e danni strutturali nella mucosa nasale e nel tessuto polmonare, 7.
4. Assorbimento cellulare in vitro
- Piastre BEAS-2B celle ad una densità di 5 x 10 5 celle/pozzetto in piastre da 12 pozzetti con vetrini di copertura in 2 ml del terreno di crescita completo e preincubare le piastre per una notte a 37 °C in un incubatore al5 % di CO2 .
- Aggiungere 100 μL di I-OVA NE marcato con FITC (purezza: 98,3%, prodotto dall'azienda, 4 mg/ml) o I-OVA (4 mg/ml) a 900 μL di sospensione cellulare e porre a 37 °C per 90 minuti.
NOTA: Preparare I-OVA NE marcato con FITC come descritto al punto 4.1. Aggiungere 1 mL di terreno di crescita completo ai gruppi di controllo. - Lavare tre volte con 0,1 M PBS (1 mL/pozzetto) per 30 minuti a 37 °C dopo il trattamento.
- Fissare questi campioni con paraformaldeide al 4% per 20 minuti al buio. Dopo la fissazione, rimuovere la paraformaldeide e lavare 3 volte con 0,1 M PBS (1 mL/pozzetto) per 30 minuti a 37 °C.
- Preincubare i campioni con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) ad una concentrazione finale di 10 μg/mL per 10 minuti al buio, quindi lavare 5 volte con 0,1 M PBS (1 mL/pozzetto) per 30 minuti a 37 °C dopo il trattamento.
- Ottenere l'assorbimento cellulare da parte di CLSM con le seguenti impostazioni dei parametri: Dimensioni fotogramma: 512 px x 512 px, Velocità di scansione: 8; Passo di linea: 1; Media: 2.
5. Rilascio in vivo
- Anestetizzare topi nudi con gas isoflurano al 4% e mantenere l'anestesia al 2% di isoflurano. Immunizzare topi nudi per via intranasale con 10 μL di I-OAV marcato con PE a 4 mg/ml o I-OVA NE marcato con PE a 4 mg/ml in ciascuna narice.
- A 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h e 24 h, catturare tutti i topi sotto anestesia dal sistema IVIS.
- Eseguire una scansione in background immediatamente prima della somministrazione intranasale per fornire un valore di soglia (Min = 1,06 x 106) per regolare le immagini raccolte in tutti i punti temporali.
- Fare clic sul software Living Image per avviare la sequenza e fare clic su Inizializza per inizializzare il sistema IVIS
- Quando viene inizializzata, la spia di stato della temperatura nel pannello di controllo di acquisizione IVIS è rossa. Quando la spia di stato della temperatura diventa verde, è possibile eseguire l'imaging.
- Fare clic su Creazione guidata immagini e quindi scegliere Fluorescenza nella finestra di dialogo visualizzata.
- Regolare i seguenti parametri: Tempo di esposizione: auto sec, Binning: 8, F/Stop: 2, Campo visivo: D.
- Selezionare il filtro di eccitazione da 620 nm e il filtro di emissione da 670 nm. Fare clic su Acquisisci sequenza per acquisire l'immagine.
- Elabora le immagini live di tutti i mouse e i dati di radianza con il software Living Image.
- Dopo aver acquisito l'immagine, fai clic su Strumenti ROI nella tavolozza degli strumenti, seleziona Cerchio e crea un cerchio ROI .
- Clicca su Misura ROI per ottenere un valore quantitativo per l'area ROI .
6. Efficacia antitumorale in vivo
- Rinfrescare e coltivare le cellule E.G7-OVA del linfoma di topo da EL4 con un terreno di crescita completo seguendo i passaggi 2.1.1-2.1.4.
NOTA: Per preparare il terreno di coltura completo della cella E.G7-OVA, mescolare RPMI 1640 terreno con 2 mM di L-glutammina regolato per contenere 1,5 g / L di bicarbonato di sodio, 4,5 g / L di glucosio, 10 mM HEPES e 1,0 mM di piruvato di sodio e integrato con 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo e 0,4 mg / mL G418, 90% e siero fetale bovino, 10%. - Sottocoltura delle cellule con un rapporto di 1:2 quando le cellule raggiungono una densità compresa tra 1 x 106 cellule/ml e 1 x 107 cellule/ml.
- Valutare l'effetto protettivo preventivo sui topi come descritto nei passaggi 6.3.1-6.3.4.
- Dividere casualmente topi C57BL / 6 di 6 settimane in cinque gruppi (n = 8 in ciascun gruppo). Anestetizzare topi nudi con gas isoflurano al 4% e mantenere l'anestesia con isoflurano al 2%. Rasare parzialmente i peli posteriori e l'unguento al solfato di neomicina sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza.
- Immunizzare per via intranasale i topi con 10 μL di 1 mg / mL I-OVA, BLE + I-OVA o I-OVA NE in ciascuna narice, BNE (diluito quattro volte con PBS) o un controllo PBS 3 volte con un intervallo di 7 giorni tra ogni immunizzazione.
- Inoculare tutti i topi ipodermicamente nella schiena destra con 5 x 105 cellule E. G7-OAV il 7 ° giorno dopo l'immunizzazione finale.
- A 0, 6, 9, 12, 15 e 18 giorni dopo l'immunizzazione finale, monitorare i volumi del tumore misurando due assi del tumore utilizzando calibri digitali e registrare la sopravvivenza di 30 giorni (dopo l'immunizzazione finale) dei topi.
- Valutare l'effetto protettivo terapeutico sui topi dopo inoculazione di cellule E.G7-OAV come descritto nelle fasi 6.4.1-6.4.3. Per il raggruppamento e la manipolazione dei topi fare riferimento al punto 6.3.1.
- Il giorno 0, iniettare i topi C57BL/6 per via sottocutanea nella schiena destra con cellule E.G7-OAV (5 x 105 cellule/topo).
- A 0, 7 e 14 giorni dopo l'iniezione, immunizzare tutti i topi immunizzati per via intranasale con 10 μL di I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (tutti a concentrazioni di 1 mg / ml), BNE o PBS tre volte in ciascuna narice.
- A 0, 6, 9, 12, 15 e 18 giorni dopo l'iniezione, monitorare il volume del tumore e registrare la sopravvivenza a 30 giorni dei topi.
NOTA: Se il volume del tumore supera i 3.000 mm3, i topi dovrebbero essere eutanizzati per ragioni umane e questi topi saranno considerati morti nella curva di sopravvivenza. Il volume del tumore è calcolato con una formula ellissoidale modificata come indicato nella seguente equazione:
Volume = π/6 x L xL 2
dove L rappresenta la lunghezza del tumore e W rappresenta la larghezza del tumore (unità di lunghezza: mm, unità di volume: mm3).
7. Analisi statistica
- Analizza le differenze nei dati tra i diversi gruppi utilizzando un software statistico appropriato con ANOVA unidirezionale, confronti multipli di Tukey o test t di uno studente. Utilizzare il metodo Kaplan-Meier per stimare i risultati di sopravvivenza e confrontare i gruppi con le statistiche log-rank. Esprimere tutti i risultati come media ± SD. Il significato dei valori P P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001 è rappresentato utilizzando *, ** e ***, rispettivamente, sui grafici.
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Representative Results
Secondo il protocollo, abbiamo completato la preparazione e la valutazione sperimentale in vitro e in vivo della somministrazione del nanovaccino del tumore nasale. TEM, AFM e DLS sono mezzi efficaci per la valutazione delle caratteristiche di base del potenziale zeta superficiale e della dimensione delle particelle del nanovaccino (Figura 1). Le cellule epiteliali BEAS-2B sono un utile modello di screening per i test di tossicità in vitro dei vaccini nasali (Figura 2A). Le microfotografie colorate con H & E illustrano che I-OVA NE non aveva alcuna tossicità mucosa evidente, inclusi danni ai tessuti, sanguinamento o infiltrazione cellulare infiammatoria (Figura 2B). L'assorbimento efficiente dell'antigene da parte delle cellule BEAS-2B nella cavità nasale è un prerequisito per la presentazione dell'antigene per suscitare successive risposte immunitarie (Figura 3). Il sistema IVIS aiuta a chiarire l'effetto a rilascio prolungato di I-OVA NE in vitro e suggerisce che questo nanovaccino può ritardare il rilascio rapido, prolungare il tempo nell'area nasale e migliorare l'assorbimento dei peptidi nelle cellule (Figura 4). I modelli protettivi preventivi e i modelli protettivi terapeutici riflettono direttamente l'effetto protettivo del vaccino I-OVA NE e la capacità del vaccino I-OVA NE di inibire la crescita tumorale e prolungare il tempo mediano di sopravvivenza dei topi (Figura 5). I risultati sperimentali di cui sopra sono stati pubblicati da Yang et al.7.
Figura 1: Caratteristiche fisiche e stabilità di I-OVA NE . (A) Micrografia elettronica a trasmissione (TEM), barra di scala = 100 nm. (B) Micrografia a forza atomica (AFM). Gli assi X e Y hanno entrambi una lunghezza totale di 450 nm. (C) Diametro dimensionale e distribuzione. (D) Potenziale Zeta e distribuzione delle analisi I-OVA NE eseguite utilizzando Nano ZS. (E) Dimensioni delle particelle, (F) indici di polidispersità, (G) potenziali zeta e (H) mobilità elettroforica di I-OVA NE nelle analisi di stabilità della mucina eseguite utilizzando Nano ZS. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Yang et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Tossicità in vitro e in vivo di I-OVA NE. (A) Vitalità relativa delle cellule BEAS-2B in coltura esposte a diverse concentrazioni peptidiche di I-OVA, BNE + I-OVA e I-OVA NE per 24 ore. BNE è stato utilizzato come controllo. I dati sono espressi come media ± SD (n = 3). (B) Esame microscopico di sezioni patologiche della mucosa nasale e dei tessuti polmonari fissati 5 ore dopo la sfida. Le immagini sono state catturate con ingrandimento 100x e 200x. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Yang et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Assorbimento cellulare dell'I-OVA NE. Imaging a fluorescenza confocale in vitro di cellule BEAS-2B trattate per 1 ora con I-OVA o I-OVA NE. PBS è stato utilizzato come controllo, I-OVA è stato etichettato con FITC (fluorescenza verde) e i nuclei sono stati colorati con DAPI (fluorescenza blu) (barra di scala = 50 μm). Questa cifra è stata adattata con il permesso di Yang et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Rilascio in vitro di I-OVA NE. (A) Imaging a fluorescenza in vivo di I-OAV marcato con PE nella cavità nasale del topo. Intensità di fluorescenza relativa registrata a 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h e 24 h dopo somministrazione nasale di I-OAV o I-OVA NE. (B) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza. I dati sono espressi come media ± DS (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0.01; e ***: P < 0,001. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Yang et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Efficacia antitumorale in vivo di I-OVA NE . (A) Curve di crescita tumorale medie dei topi vaccinati nei modelli protettivi preventivi. (B) Percentuale di sopravvivenza dei topi vaccinati nei modelli protettivi preventivi. (C) Curve medie di crescita tumorale dei topi vaccinati nei modelli terapeutici protettivi. (D) Tasso percentuale di sopravvivenza dei topi vaccinati nei modelli terapeutici protettivi. *: P < 0,05; **: P < 0,01; e ***: P < 0,001. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Yang et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I nanovaccini funzionalizzati con membrane di immunociti hanno grandi vantaggi nella terapia mirata alla malattia e gli effetti collaterali sono ridotti al minimo da proprietà come il tropismo tumorale unico, l'identificazione di bersagli specifici, circolazione prolungata, interazioni intercellulari migliorate e bassa tossicità sistemica. Possono anche essere facilmente integrati con altri moduli di trattamento per trattare i tumori in modo cooperativo16,20. Gli attributi desiderabili possono essere ottenuti controllando le proprietà fisiche e chimiche come la misurazione, la forma e la carica elettrica. Pertanto, i nanovaccini sono diventati importanti in una vasta gamma di applicazioni21. Queste proprietà sono importanti fattori decisivi per quanto riguarda l'assorbimento e la tossicità, e i nanovaccini possono essere resi non tossici solo mediante manipolazione22. Pertanto, questo protocollo per lo studio delle caratteristiche fisico-chimiche, tra cui forma, dimensioni e carica, è vitale. TEM è uno strumento altamente preciso che è stato ampiamente utilizzato nella comunità scientifica per molti anni23. È diventato uno strumento essenziale per comprendere le proprietà dei materiali nanostrutturati e per manipolare i loro comportamenti. Inoltre, la microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come una potente tecnica per la caratterizzazione nanomeccanica di campioni biologici24. Può fornire informazioni 3D e su scala nanometrica ad alta risoluzione, analizzando anche i dettagli della superficie a livello atomico. Oltre a determinare i cambiamenti nella distribuzione delle dimensioni delle particelle, DLS può misurare sia la dimensione che la carica per fornire informazioni sullo stato di aggregazione delle nanoparticelle nella soluzione25.
È stato riportato che elevati valori di potenziale zeta sono essenziali per la buona stabilità delle sospensioni colloidali26. In questo studio, abbiamo utilizzato questi protocolli per valutare le caratteristiche fisico-chimiche dei nanovaccini con TEM, AFM e DLS. Inoltre, la superficie della mucosa nasale contiene una grande quantità di muco, che fornisce lubrificazione, umidità e una barriera protettiva chimica. Ciò potrebbe essere dovuto all'interazione tra il muco e alcuni antigeni o sistemi di rilascio, con conseguente accumulo e "cattura" di antigeni o sistemi di rilascio e la loro successiva rimozione, riducendo enormemente l'efficienza di consegna7. È noto che la stabilità dei nanovaccini è vitale per la somministrazione nasale. Pertanto, abbiamo utilizzato Nano ZS per determinare una serie di parametri di stabilità, tra cui la dimensione delle particelle, gli indici di polidispersità, i potenziali zeta e la mobilità dell'elettroforesi, dopo il trattamento con lo 0,5% di proteina mucina.
I saggi di istocompatibilità in vivo e di vitalità cellulare in vitro hanno dimostrato che questo nuovo nanovaccino non era tossico nell'intervallo delle concentrazioni testate27. Le cellule epiteliali bronchiali normali umane (BEAS-2B) sono linee cellulari standard utilizzate per studiare il tratto respiratorio umano28. A causa del suo costo inferiore, della rapidità e delle preoccupazioni etiche minime, la valutazione della tossicità in vitro è un metodo importante. In questo studio, il test di vitalità cellulare in vitro è stato determinato mediante un test CCK8. Inoltre, la valutazione della tossicità in vivo viene solitamente eseguita in modelli animali come topi e ratti. L'esame istopatologico viene spesso eseguito su tessuti esposti a nanoparticelle, come cuore, occhio, cervello, fegato, reni, polmoni e milza29. Pertanto, abbiamo utilizzato questi metodi per valutare la tossicità di questo nuovo nanovaccino in vitro e in vivo.
L'assorbimento e il prolungamento dell'antigene sono prerequisiti per la presentazione dell'antigene per innescare una successiva risposta immunitaria30. È necessario determinare l'assorbimento cellulare di BEAS-2B e i profili di rilascio del nuovo nanovaccino in vivo e in vitro. CLSM è l'implementazione commerciale più comune della tecnologia pertinente, che può essere trovata nella grande maggioranza dei laboratori di imaging e ha una vasta gamma di applicazioni. Questi strumenti sono ampiamente utilizzati e relativamente facili da usare; Tuttavia, di solito non sono ottimali per la raccolta di dati quantitativi.
Nel nostro protocollo, l'assorbimento cellulare è stato rilevato da CLSM a causa della chiara risoluzione, della capacità di sezionamento ottico e della versatilità con l'imaging3D 31. Inoltre, IVIS è stato utilizzato per ottenere i profili di rilascio in vivo del nuovo nanomateriale perché può fornire una camera di imaging con luce esterna esclusa per la bioluminescenza quantitativa e l'imaging a fluorescenza in vivo e in vitro. Pertanto, in questo protocollo, abbiamo utilizzato questi metodi per determinare i profili di assorbimento e rilascio cellulare di nuovi nanovaccini in vivo e in vitro.
È anche importante valutare l'efficacia tumorale del nuovo nanovaccino. Nel nostro studio, il modello portatore di tumore E.G7 è stato utilizzato per determinare gli effetti terapeutici e protettivi del vaccino. Le cellule EL4 derivano dai linfociti T di topi C57BL/6 con neoplasie di alto grado. Le cellule E.G7 derivano da cellule di linfoma EL4 trasfettate mediante elettroporazione32. Nel nostro studio, questo nanovaccino ha indotto l'immunità protettiva nei topi portatori di tumore E.G7-OVA. In sintesi, è necessario stabilire una serie di protocolli per studiare le caratteristiche fisico-chimiche, la stabilità, la tossicità, i profili di rilascio, l'assorbimento cellulare e gli effetti antitumorali dei nanovaccini in vitro e in vivo. Questi protocolli forniranno risultati utili per il nuovo nanovaccino nasale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal n. 31670938, 32070924, 32000651 del National Natural Science Foundation Program of China, n. 2014jcyjA0107 e n. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing, n. 2020XBK24 e n. 2020XBK26 dei progetti speciali dell'Università medica dell'esercito e n. 202090031021 e n. 202090031035 del programma nazionale di innovazione e imprenditorialità per studenti universitari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
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