Summary
כאן, אנו מציגים שיטות מפורטות להכנה והערכה של החיסון לגידול ננו-תחליב בהרכבה עצמית באף במבחנה ו-in vivo.
Abstract
פפטידים אפיטופיים משכו תשומת לב נרחבת בתחום חיסוני הגידול בגלל בטיחותם, ספציפיות גבוהה וייצור נוח; בפרט, כמה אפיטופים מוגבלים MHC I יכולים לגרום לפעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים T יעילה כדי לנקות תאים סרטניים. בנוסף, מתן אף הוא טכניקת מסירה יעילה ובטוחה לחיסונים לגידולים בשל הנוחות שלה והיענות משופרת למטופלים. עם זאת, פפטידים אפיטופיים אינם מתאימים לאספקת האף בגלל האימונוגניות הירודה שלהם וחוסר יעילות ההעברה. ננו-תחליבים (NEs) הם מערכות יציבות מבחינה תרמודינמית שניתן לטעון באנטיגנים ולהעביר ישירות לפני השטח של רירית האף. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) הוא פנטפפטיד הליבה של למינין, פפטיד קושר אינטגרין המתבטא על ידי תאי אפיתל נשימתיים אנושיים. במחקר זה, חיסון לגידול אפיטופ פפטיד NE בהרכבה עצמית תוך אפי המכיל את הפפטיד הסינתטי IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) הוכן בשיטת תחליב באנרגיה נמוכה. השילוב של IKVAV ו- OVA257-264 יכול לשפר את ספיגת האנטיגן על ידי תאי אפיתל ברירית האף. כאן, אנו קובעים פרוטוקול לחקר המאפיינים הפיזיקוכימיים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM), מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ופיזור אור דינמי (DLS); יציבות בנוכחות חלבון מוצין; רעילות על ידי בחינת יכולת הקיום התאית של תאי BEAS-2B ורקמות האף והריאות של עכברי C57BL/6; קליטה סלולרית על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM); לשחרר פרופילים על ידי הדמיה של חיות קטנות in vivo; וההשפעה המגנה והטיפולית של החיסון באמצעות מודל נושא גידול E.G7. אנו צופים כי הפרוטוקול יספק רמזים טכניים ותיאורטיים לפיתוח עתידי של חיסונים ריריים חדשניים מסוג תאי T אפיטופים פפטידיים.
Introduction
כאחד החידושים הקריטיים ביותר בתחום בריאות הציבור, חיסונים ממלאים תפקיד מפתח במאבק בנטל העולמי של מחלות אנושיות1. כך למשל, בימים אלה נבדקים למעלה מ-120 חיסונים מועמדים לקורונה, חלקם אושרו במדינות רבות2. דיווחים אחרונים קובעים כי חיסונים נגד סרטן שיפרו ביעילות את התקדמות הטיפולים הקליניים בסרטן מכיוון שהם מכוונים את המערכת החיסונית של חולי סרטן לזהות אנטיגנים כזרים לגוף3. יתר על כן, אפיטופים מרובים של תאי T הממוקמים בתוך או מחוץ לתאי הגידול יכולים לשמש לתכנון חיסונים פפטידיים, אשר הראו יתרונות בטיפול בסרטן גרורתי בגלל היעדר הרעילות המשמעותית הקשורה להקרנות וכימותרפיה 4,5. מאז אמצע שנות התשעים נערכו ניסויים פרה-קליניים וקליניים לטיפול בגידולים בעיקר באמצעות חיסונים נגד פפטידי אנטיגן, אך מעטים החיסונים המציגים השפעה טיפולית מספקת על חולי סרטן6. יתר על כן, חיסונים לסרטן עם אפיטופים פפטידים הם בעלי אימונוגניות ירודה ויעילות אספקה לא מספקת, אשר עשויה לנבוע מהתפרקות מהירה של פפטידים חוץ-תאיים המתפזרים במהירות ממקום הנתינה, מה שמוביל לספיגת אנטיגן לא מספקת על ידי תאי החיסון7. לכן, יש צורך להתגבר על מכשולים אלה עם טכנולוגיית משלוח חיסונים.
OVA 257-264, אפיטופ MHC Class I-binding257-264 מבוטא כחלבון היתוך, הוא אפיטופ מודל8 הנמצא בשימוש תכוף. בנוסף, OVA257-264 חיוני לתגובה החיסונית הנרכשת נגד גידולים, אשר תלויה בתגובת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL). הוא מתווך על ידי תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בגידול, המושרים על ידי פפטיד OVA257-264 . הוא מאופיין על ידי גרנים B מספיק, אשר משוחרר על ידי תאי T ציטוטוקסיים, המוביל אפופטוזיס של תאי המטרה8. עם זאת, מתן פפטידי OVA257-264 חופשי עשוי לגרום לפעילות CTL מועטה מכיוון שהספיגה של אנטיגנים אלה מתרחשת בתאים לא ספציפיים ולא בתאים מציגי אנטיגן (APC). מחסור בגירוי חיסוני מתאים גורם לפעילות CTL5. לכן, השראת פעילות CTL יעילה דורשת התקדמות ניכרת.
בשל המחסום המסופק על ידי תאי אפיתל והפרשת ריר מתמשכת, אנטיגנים חיסוניים מוסרים במהירות מרירית האף 9,10. פיתוח וקטור חיסון יעיל שיכול לעבור דרך הרקמה הרירית הוא חיוני מכיוון שהתאים מציגי האנטיגן ממוקמים מתחת לאפיתל הרירית9. הזרקה תוך אפית של חיסונים גורמת תיאורטית לחסינות רירית להילחם בזיהום רירית11. בנוסף, מתן האף הוא שיטת מתן יעילה ובטוחה לחיסונים בשל הנוחות שלה, הימנעות ממתן מעיים ושיפור היענות המטופל7. לכן, אספקת האף היא אמצעי טוב למתן ננו-חיסון אפיטופ פפטידי חדש.
מספר ביו-חומרים סינתטיים פותחו כדי לשלב אפיטופים של אינטראקציות בין רקמת התא לתא. חלבונים ביו-אקטיביים מסוימים, כגון Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), הוכנסו כחלק ממבנה ההידרוג'ל כדי להעניק פעילות ביולוגית12. פפטיד זה תורם ככל הנראה להיקשרות, נדידה וצמיחה של תאים13 וקושר אינטגרינים α-3β1ו-α-6β1 כדי לקיים אינטראקציה עם סוגי תאים סרטניים שונים. IKVAV הוא פפטיד היצמדות תאים הנגזר מחלבון קרום מרתף למינין α שרשרת1 ששימש במקור למדל את המיקרו-סביבה העצבית ולגרום להתמיינות עצבית14. לכן, מציאת רכב משלוח יעיל לחיסון חדשני זה חשובה לבקרת מחלות.
מערכות תחליב שדווחו לאחרונה, כגון W805EC ו- MF59, הורכבו גם עבור אספקת חלל האף של חיסון שפעת מומת או אנטיגן משטח רקומביננטי של הפטיטיס B והודגמו כמעוררות חסינות רירית ומערכתית15. לננו-תחליבים (NEs) יש את היתרונות של ניהול קל וקופורמציה נוחה עם אדג'ובנטים יעילים בהשוואה למערכות העברת רירית חלקיקים16. חיסוני ננו-תחליב דווחו כמשנים את הפנוטיפ האלרגי באופן מתמשך שונה מדסנסיטיזציה מסורתית, המביאה להשפעות דיכוי ארוכות טווח17. אחרים דיווחו כי ננו-תחליבים בשילוב עם אנטיגנים אימונודומיננטיים ספציפיים ל-Mtb יכולים לגרום לתגובות חזקות של תאי רירית ולהעניק הגנה משמעותית18. לכן, תוכנן ננו-חיסון חדשני בהרכבה עצמית תוך אפית עם הפפטיד הסינתטי IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, הפפטיד המורכב מ- IKVAV הקשור ל- OVA257-264). חשוב להעריך ננו-חיסון חדשני זה באופן שיטתי.
מטרת פרוטוקול זה היא להעריך באופן שיטתי את המאפיינים הפיזיקוכימיים, הרעילות והיציבות של הננו-חיסון, לזהות אם ספיגת האנטיגן וההשפעות המגינות והטיפוליות משופרות באמצעים טכניים, ולפרט את תכני הניסוי העיקריים. במחקר זה, ביססנו סדרה של פרוטוקולים לחקר המאפיינים הפיזיקוכימיים והיציבות, לקבוע את עוצמת הרעילות של תאי I-OVA NE עד BEAS-2B על ידי CCK-8, ולבחון את יכולת הצגת האנטיגן של תאי BEAS-2B לחיסון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, להעריך את פרופילי השחרור של ננו-חיסון חדשני זה in vivo ו-in vitroולזהות את ההשפעה המגנה והטיפולית של חיסון זה באמצעות מודל עכבר נושא גידול E.G7-OVA.,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיה לבחינה אתית של רווחת בעלי חיים (GB/T 35892-2018) ואושרו על ידי ועדת האתיקה ורווחת חיות המעבדה של האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה. העכברים הומתו על ידי זריקה תוך צפקית של 100 מ"ג / ק"ג של 1% נתרן pentobarbital.
1. הכנת I-OVA NE
- Admix 1 מ"ג של מונופוספוריל ליפיד A (MPLA) עם 100 μL של DMSO, מערבולת במשך 5 דקות, ולאפשר לו לעמוד במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT) להתמוסס לחלוטין.
- מוסיפים כמות של Tween 80 ו-I-OVA ומערבבים.
הערה: Tween 80 ו- I-OVA היו מעורבים ביחס מסה של 25:119. - הוסיפו סקוואלן לתערובת שהוכנה בשלב 1.2 (7:3, Smix: squalene).
- הוסף 100 μL של תמיסת MPLA (10 מ"ג / מ"ל) לתערובת שהוכנה בשלב 1.3.
- הכינו את החיסון נגד ננו-תחליב בשיטות תחליב באנרגיה נמוכה19: הוסיפו את התמיסה המעורבת לטיפות מים בכ-70% מהנפח הכולל וערבבו בעדינות לקבלת תערובת שקופה וזורמת בקלות.
הערה: בקרת BNE (תחליב ריק) הוכנה באותה שיטה, והחליפה מים ב- I-OVA.
2. אפיון פיסיקוכימי ויציבות
הערה: להעריך את התפלגות גודל הטיפות, פוטנציאל ZETA ונתונים פיסיקוכימיים אחרים של חיסון I-OVA NE בעקבות שלבים 2.1-2.3; לבצע אפיון מורפולוגי של חיסון I-OVA NE בעקבות שלבים 2.4-2.7; ולבחון את המבנה התלת-ממדי של החיסון I-OVA NE בעקבות שלבים 2.8-2.9.
- ערבבו 50 מ"ג של חלבון מוצין עם 100 מ"ל מים להזרקה להכנת תמיסת מוצין 0.05%.
- לדלל 4 מ"ג/מ"ל I-OVA NE פי 200 עם 0.05 מ"ג/מ"ל חלבון מוצין או מים נטולי יונים.
- התבונן בגודל החלקיקים, פוטנציאל הזטה, מדד הפיזור הפולי-פיזור (PDI) והניידות האלקטרופורטית ב-25°C באמצעות ננואנלייזר19.
- לדלל 10 μL של I-OVA NE פי 200 עם 2 מ"ל של מים deionized.
- מניחים 5 μL של חיסון I-OVA NE מדולל מראש (שלב 2.4) על רשת נחושת מצופה פחמן, ומכסים אותו עם 10 μL של 1% חומצה phosphotungstic במשך 3 דקות.
- הסר את עודף חומצה phosphotungstic עם נייר סינון.
- השג תמונות באמצעות TEM. הניחו דגימה של 10 μL מדוללת 50 פעמים על רשת נחושת פחמנית של 100 רשת ואפשרו לה לעמוד בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות לפני הוספת 10 μL של חומצה פוספוטונגסטית (1%, pH 7.4). בדוק את כל הדגימות על ידי TEM במתח של 120 kV.
- לאפיין את המורפולוגיה המולקולרית של I-OVA NEבאמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ברזולוציה גבוהה. קבל את התמונות הצבעוניות של I-OVA NE בתנאים הבאים: עבור בדיקות טונגסטן (קבוע כוח: 0.06 N·m-1); טווח סריקה: 450 ננומטר x 450 ננומטר; מצב הקשה: מצב הדמיה; ושיטת הסריקה: סריקה נקודתית ב-RT.
3. מבחני רעילות במבחנה ו-in vivo
הערה: רעילות החוץ גופית של חיסון I-OVA NE הוערכה בעקבות שלבים 3.1-3.9, והרעילות in vivo של חיסון I-OVA NE הוערכה בעקבות שלבים 3.10-3.13.
- להחיות תאי אפיתל BEAS-2B אנושיים לאחר שלבים 3.1.1-3.1.4 ולתרב אותם במדיום גידול מלא ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
הערה: כדי להכין את מדיום הגידול המלא, הוסף סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין למדיום RPMI-1640 בריכוזים סופיים של 10% ו-1%, בהתאמה.- הפעל את אמבט המים והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. הסר את בקבוקוני התא הקפואים בחנקן נוזלי והפשיר במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר ההפשרה, מכניסים במהירות את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל, מוסיפים 2 מ"ל ממדיום הגידול השלם, וצנטריפוגה ב 129 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant, להוסיף 2 מ"ל של מדיום הגידול המלא כדי להשעות מחדש את התאים, צנטריפוגה ב 129 x גרם במשך 5 דקות.
- הסר את הסופרנטנט, הוסף 6 מ"ל של מדיום גידול מלא כדי להשהות מחדש את התאים, ולהעביר את התאים לבקבוק תרבית T25 כדי לגדל את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
- כאשר צפיפות התא מגיעה ל-80%-90%, יש להשליך את מדיום התרבית ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל PBS. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין כדי לעכל את התאים במשך 1-2 דקות. כאשר עיגול של התאים הוא ציין, מיד להוסיף 4 מ"ל של מדיום הגידול המלא כדי לנטרל את טריפסין.
- מערבבים ושואבים את הדגימות לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 129 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של RPMI-1640 מדיום שלם. השתמש 20 μL לספירת תאים, ודלל את התאים ל 1 x 105 תאים / מ"ל.
- לוחים את תאי BEAS-2B בצפיפות של 1 x 104 תאים/באר בצלחות 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של RPMI-1640 שלמות בינוניות ודוגרים מראש על הלוחות למשך 24 שעות ב-37°C באינקובטור 5% CO2 .
- השליכו את הסופרנטנט, והוסיפו 100 μL של I-OVA NE, 100 μL של I-OVA+BNE (מעורב פיזית), ו-100 μL של I-OVA מדולל במדיום גידול מלא בריכוזים סופיים שונים (0.5 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, 2 מ"ג/מ"ל, 4 מ"ג/מ"ל, 8 מ"ג/מ"ל), עם BNE כבקרה. לדגור במשך 24 שעות ב 37 ° C.
הערה: הוסף 100 μL של מדיום גדילה מלא לקבוצות הבקרה השליליות ו- 100 μL של תרחיף תאים (1 x 105/mL) לקבוצות הביקורת החיוביות. - הסר את המדיום והוסף 90 μL של מדיום צמיחה מלא ו 10 μL של פתרון CCK-8 לכל באר של הצלחת.
- לדגור על הצלחת במשך 2 שעות ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
- מדוד את הספיגה של כל באר ב- 450 ננומטר באמצעות קורא לוחות עם תווית אנזים.
- חשב את יחס ההישרדות של תאי BEAS-2B כפי שמצוין במשוואה הבאה:
( דוגמת OD450 - שליטה שלילית OD450 / בקרה חיובית OD450 - בקרה שלילית OD450) × 100% - חלקו באופן אקראי עכברי C57BL/6 בני 6 שבועות לחמש קבוצות (n = 5 בכל קבוצה) והרדימו אותם עם 4% איזופלורן לצורך זירוז. לשמור על הרדמה עם 2% isoflurane. השתמש משחה neomycin סולפט על העיניים של העכברים כדי למנוע יובש.
- השתמש 10 μL פיפטה טיפים לבצע חיסון האף של העכברים עם 10 μL / נחיר של I-OVA, I-OVA + BNE, ו IOVA NE ב 4 מ"ג / מ"ל במשך כל 3 ימים. השתמש BNE ו- PBS כבקרה ניסיונית.
הערה: ספק תמיכה תרמית עד שבעל החיים יתאושש מההרדמה. - הרדימו את כל העכברים על ידי זריקה תוך צפקית של 100 מ"ג/ק"ג 1% נתרן פנטוברביטל ביום הרביעי.
- חותכים דגימות בעובי של כ -3 מ"מ של רקמות האף עם מספריים, ולהסיר את רקמות הריאה.
- תקן את רקמות האף ואת כל רקמות הריאה ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות. יש לייבש את הרקמות באמצעות שיפוע טורי של אלכוהול וקסילן ולאחר מכן להטמיע בפרפין. פורסים את קוביות השעווה המוגמרות על פרוסת פרפין בעובי של 4 מיקרומטר.
- מכתימים את החלקים עם hematoxylin ו eosin (H&E). לאחר מכן, התבוננו ברעילות הרירית, כולל היפרמיה, בצקת, חדירת נויטרופילים ונזק מבני ברירית האף וברקמת הריאה, תחת מיקרוסקופ (100x ו-200x)7.
4. ספיגה תאית במבחנה
- צלחת BEAS-2B תאים בצפיפות של 5 x 105 תאים / באר בלוחות 12 באר עם כיסויים ב 2 מ"ל של מדיום הגידול השלם לדגור מראש את הלוחות לילה ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
- הוסף 100 μL של I-OVA NE (טוהר: 98.3%, מיוצר על ידי החברה, 4 מ"ג / מ"ל) או I-OVA (4 מ"ג / מ"ל) ל 900 μL של תרחיף תאים ומניחים על 37 ° C למשך 90 דקות.
הערה: הכן את I-OVA NE עם תווית FITC כמתואר בשלב 4.1. הוסף 1 מ"ל של מדיום גידול מלא לקבוצות הביקורת. - יש לשטוף שלוש פעמים עם 0.1 M PBS (1 מ"ל/באר) למשך 30 דקות ב-37°C לאחר הטיפול.
- תקן דגימות אלה עם 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות בחושך. לאחר הקיבוע, יש להסיר את הפרפורמאלדהיד ולשטוף 3 פעמים עם 0.1 M PBS (1 מ"ל/באר) למשך 30 דקות ב-37°C.
- יש לדגור על הדגימות עם DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל למשך 10 דקות בחושך, ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים עם 0.1 M PBS (1 מ"ל/באר) למשך 30 דקות ב-37°C לאחר הטיפול.
- השג את הקליטה הסלולרית על ידי CLSM באמצעות הגדרות הפרמטרים הבאות: גודל מסגרת: 512 פיקסלים x 512 פיקסלים, מהירות סריקה: 8; שלב קו: 1; ממוצע: 2.
5. שחרור In vivo
- מרדימים עכברים עירומים עם 4% גז איזופלורן ושומרים על הרדמה ב-2% איזופלורן. חסן עכברים עירומים תוך אפית עם 10 μL של I-OVA המסומן ב- PE ב- 4 מ"ג / מ"ל או I-OVA NE המסומן ב- PE ב- 4 מ"ג / מ"ל בכל נחיר.
- ב 0 שעות, 0.5 שעות, 1.5 שעות, 3, 6 שעות, 9 שעות, 12 שעות, ו 24 שעות, ללכוד את כל העכברים תחת הרדמה על ידי מערכת IVIS.
- בצע סריקת רקע מיד לפני מתן תוך אפי כדי לספק ערך סף (מינימום = 1.06 x 106) כדי להתאים את התמונות שנאספו בכל נקודות הזמן.
- לחץ על תוכנת Living Image כדי להתחיל את הרצף ולחץ על Initialize כדי לאתחל את מערכת IVIS
- כאשר הוא מאותחל, נורית מצב הטמפרטורה בלוח הבקרה של רכישת IVIS אדומה. כאשר נורית מצב הטמפרטורה משתנה לירוקה, ניתן לבצע הדמיה.
- לחץ על אשף הדימות ולאחר מכן בחר פלואורסצנטיות בתיבת הדו-שיח שמופיעה.
- התאם את הפרמטרים הבאים: זמן חשיפה: שניות אוטומטיות, בינינג: 8, F/Stop: 2, שדה ראייה: D.
- בחר את מסנן העירור של 620 ננומטר ואת מסנן הפליטה של 670 ננומטר. לחץ על Purchase Sequence כדי להשיג את התמונה.
- עבד את התמונות החיות של כל העכברים ואת נתוני הזוהר באמצעות תוכנת Living Image.
- לאחר רכישת התמונה, לחץ על כלי ROI בלוח הכלים, בחר עיגול וצור מעגל ROI.
- לחץ על מדידת החזר השקעה כדי לקבל ערך כמותי עבור אזור החזר ההשקעה.
6. יעילות אנטי-סרטנית In vivo
- רעננו ותרביתו את תאי הלימפומה של עכבר E.G7-OVA מ-EL4 עם מדיום גדילה מלא לפי השלבים 2.1.1-2.1.4.
הערה: להכנת מדיום גידול מלא של תאי E.G7-OVA, יש לערבב RPMI 1640 בינוני עם 2 mM L-גלוטמין מותאם להכיל 1.5 גרם/ליטר סודיום ביקרבונט, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, 10 mM HEPES ו-1.0 mM נתרן פירובט בתוספת 0.05 mM 2-מרקפטואתנול ו-0.4 מ"ג/מ"ל G418, 90%, וסרום בקר עוברי, 10%. - תרבית משנה של התאים ביחס של 1:2 כאשר התאים מגיעים לצפיפות בין 1 x 106 תאים / מ"ל ו 1 x 107 תאים / מ"ל.
- הערך את השפעת ההגנה המונעת על עכברים כמתואר בשלבים 6.3.1-6.3.4..
- חלקו באופן אקראי עכברי C57BL/6 בני 6 שבועות לחמש קבוצות (n = 8 בכל קבוצה). מרדימים עכברים עירומים עם 4% גז איזופלורן ושומרים על הרדמה עם 2% איזופלורן. יש לגלח חלקית את השיער האחורי ואת משחת נאומיצין סולפט על עיני העכברים כדי למנוע יובש.
- חיסון תוך-אפי של העכברים עם 10 μL של 1 מ"ג/מ"ל I-OVA, BNE+I-OVA, או I-OVA NE בכל נחיר, BNE (מדולל ארבע פעמים עם PBS), או בקרת PBS 3 פעמים עם מרווח של 7 ימים בין כל חיסון.
- חסן את כל העכברים באופן היפודרמי לגב הימני עם 5 x 105 תאי E. G7-OVA ביום השביעי לאחר החיסון הסופי.
- ב-0, 6, 9, 12, 15 ו-18 יום לאחר החיסון הסופי, עקבו אחר נפחי הגידול על ידי מדידת שני צירים של הגידול באמצעות קליפרים דיגיטליים, ותיעדו את הישרדותם של העכברים במשך 30 יום (לאחר החיסון הסופי).
- להעריך את ההשפעה המגנה הטיפולית על עכברים לאחר חיסון תאי E.G7-OVA כמתואר בשלבים 6.4.1-6.4.3. עבור הקיבוץ והטיפול בעכברים, עיין בשלב 6.3.1.
- ביום 0, הזריקו את עכברי C57BL/6 תת עורית לגב הימני עם תאי E.G7-OVA (5 x 105 תאים / עכבר).
- ב-0, 7 ו-14 ימים לאחר ההזרקה, יש לחסן את כל העכברים שחוסנו תוך אפית ב-10 מיקרוליטר של I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE (כולם בריכוזים של 1 מ"ג/מ"ל), BNE או PBS שלוש פעמים בכל נחיר.
- ב 0, 6, 9, 12, 15, ו 18 ימים לאחר ההזרקה, לפקח על נפח הגידול ולתעד את הישרדות 30 יום של העכברים.
הערה: אם נפח הגידול עולה על 3,000 מ"מ3, יש להרדים את העכברים מסיבות אנושיות, ועכברים אלה ייחשבו למתים בעקומת ההישרדות. נפח הגידול מחושב על ידי נוסחה אליפסואידית שונה כמצוין במשוואה הבאה:
נפח = π/6 x אורך x רוחב2
כאשר L מייצג את אורך הגידול, ו-W מייצג את רוחב הגידול (יחידת אורך: mm, יחידת נפח: mm3).
7. ניתוח סטטיסטי
- נתח את ההבדלים בנתונים בין הקבוצות השונות באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה עם ANOVA חד-כיוונית, השוואות מרובות של Tukey, או מבחן t של סטודנט. השתמש בשיטת קפלן-מאייר כדי להעריך את תוצאות ההישרדות ולהשוות את הקבוצות עם סטטיסטיקות לוג-דרג. בטא את כל התוצאות כממוצע ± SD. המשמעות של ערכי P P < 0.05, P < 0.01 ו- P <- 0.001 מיוצגת באמצעות *, ** ו- ***, בהתאמה, בחלקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על פי הפרוטוקול, השלמנו את ההכנה ואת ההערכה הניסויית in vitro and in vivo של אספקת ננו-חיסון הגידול באף. TEM, AFM ו-DLS הם אמצעים יעילים להערכת המאפיינים הבסיסיים של פוטנציאל הזטה בפני השטח וגודל החלקיקים של ננו-חיסון (איור 1). תאי אפיתל BEAS-2B הם מודל סינון שימושי לבדיקת רעילות חוץ גופית של חיסונים לאף (איור 2A). המיקרו-תצלומים המוכתמים ב-H&E מדגימים כי ל-I-OVA NE לא הייתה רעילות רירית ברורה, כולל נזק לרקמות, דימום או חדירת תאים דלקתיים (איור 2B). ספיגה יעילה של האנטיגן על-ידי תאי BEAS-2B בחלל האף היא תנאי מוקדם להצגת אנטיגן כדי לעורר תגובות חיסוניות עוקבות (איור 3). מערכת IVIS עוזרת להבהיר את השפעת השחרור המתמשך של I-OVA NE IN VITRO ומציעה כי ננו-חיסון זה יכול לעכב שחרור מהיר, להאריך את הזמן באזור האף ולשפר את ספיגת הפפטידים בתאים (איור 4). מודלי ההגנה המונעת ומודלי ההגנה הטיפוליים משקפים ישירות את ההשפעה המגנה של החיסון I-OVA NE ואת היכולת של חיסון I-OVA NE לעכב את צמיחת הגידול ולהאריך את זמן ההישרדות החציוני של עכברים (איור 5). תוצאות הניסוי לעיל פורסמו על ידי Yang et al.7.
איור 1: מאפיינים פיזיקליים ויציבות של I-OVA NE . (A) מיקרוגרף אלקטרונים תמסורת (TEM), סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (B) מיקרוגרף של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). צירי X וציר Y הם שניהם באורך כולל של 450 ננומטר. (ג) גודל, קוטר והתפלגות. (D) פוטנציאל Zeta והתפלגות של ניתוחי I-OVA NE שבוצעו באמצעות Nano ZS. (E) גדלי חלקיקים, (F) אינדקסי פיזור פולידיספוזיה, (G) פוטנציאלי זטה, ו-(H) ניידות אלקטרופורזה של I-OVA NE בניתוחי יציבות מוצין שבוצעו באמצעות Nano ZS. נתון זה הותאם באישור Yang et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: רעילות במבחנה ו-in vivo של I-OVA NE. (A) הכדאיות היחסית של תאי BEAS-2B בתרבית שנחשפו לריכוזים פפטידים שונים של I-OVA, BNE+I-OVA ו-I-OVA NE במשך 24 שעות. BNE שימש כבקרה. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD (n = 3). (B) בדיקה מיקרוסקופית של מקטעים פתולוגיים של רירית האף ורקמות הריאה הקבועות 5 שעות לאחר האתגר. התמונות צולמו בהגדלה של פי 100 ופי 200. נתון זה הותאם באישור Yang et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ספיגה תאית של I-OVA NE. IN VITRO CONFOCAL FLUORESCENCE IMAGING OF BEAS-2B cells שטופלו במשך שעה אחת עם I-OVA או I-OVA NE. PBS שימש כבקרה, I-OVA סומן ב-FITC (פלואורסצנטיות ירוקה), והגרעינים הוכתמו ב-DAPI (פלואורסצנטיות כחולה) (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). נתון זה הותאם באישור Yang et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שחרור חוץ גופי של I-OVA NE. (A) הדמיה פלואורסצנטית In vivo של I-OVA המסומן ב-PE בחלל האף של העכבר. עוצמת פלואורסצנטיות יחסית נרשמה ב- 0 שעות, 0.5 שעות, 1.5 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 9 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות לאחר מתן האף של I-OVA או I-OVA NE. (ב) כימות עוצמת הפלואורסצנטיות. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD (n = 5). *: P < 0.05; **: P <0.01; ו- ***: P < 0.001. נתון זה הותאם באישור Yang et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יעילות In vivo נגד גידולים של I-OVA NE . (A) עקומות גידול ממוצעות של עכברים מחוסנים במודלים של הגנה מונעת. (B) אחוזי הישרדות של עכברים מחוסנים במודלים של הגנה מונעת. (C) עקומות גידול ממוצעות של העכברים המחוסנים במודלים הטיפוליים המגנים. (D) אחוזי הישרדות של העכברים המחוסנים במודלים הטיפוליים המגנים. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ו- ***: P < 0.001. נתון זה הותאם באישור Yang et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לננו-חיסונים המתפקדים עם קרומי אימונוציטים יש יתרונות גדולים בטיפול ממוקד מחלה, ותופעות הלוואי ממוזערות על ידי תכונות כגון טרופיזם גידולי ייחודי, זיהוי מטרות ספציפיות, זרימת דם ממושכת, אינטראקציות בין-תאיות משופרות ורעילות מערכתית נמוכה. הם יכולים גם להיות משולבים בקלות עם מודולי טיפול אחרים לטיפול בסרטן בשיתוף פעולה16,20. תכונות רצויות ניתן להשיג על ידי שליטהתכונות פיסיקליות וכימיות כגון מדידה, צורה, מטען חשמלי. לפיכך, ננו-חיסונים הפכו חשובים במגוון רחב של יישומים21. תכונות אלה הן גורמים מכריעים עיקריים לגבי ספיגה ורעילות, וננו-חיסונים יכולים להפוך ללא רעילים רק על ידי מניפולציה22. לכן, פרוטוקול זה לחקר מאפיינים פיסיקוכימיים, כולל צורה, גודל ומטען, הוא חיוני. TEM הוא מכשיר מדויק ביותר שנמצא בשימוש נרחב בקהילה המדעית במשך שנים רבות23. זה הפך לכלי חיוני כדי להבין את התכונות של חומרים ננו-מבניים ולתפעל את התנהגותם. בנוסף, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לאפיון ננומכני של דגימות ביולוגיות24. הוא יכול לספק מידע תלת-ממדי וננומטרי ברזולוציה גבוהה תוך ניתוח פרטי פני השטח ברמה האטומית. בנוסף לקביעת שינויים בהתפלגות גודל החלקיקים, DLS יכול למדוד הן גודל והן מטען כדי לספק מידע על מצב הצבירה של ננו-חלקיקים בתמיסה25.
דווח כי ערכים פוטנציאליים גבוהים של זטה חיוניים ליציבות טובה של מתלים קולואידים26. במחקר הזה השתמשנו בפרוטוקולים האלה כדי להעריך את המאפיינים הפיזיקוכימיים של ננו-חיסונים עם TEM, AFM ו-DLS. יתר על כן, פני השטח של רירית האף מכיל כמות גדולה של ריר, אשר מספק סיכה, לחות, מחסום מגן כימי. זה אולי בגלל האינטראקציה בין הריר ואנטיגנים מסוימים או מערכות משלוח, וכתוצאה מכך הצטברות ו "לכידה" של אנטיגנים או מערכות משלוח והסרתם לאחר מכן, הפחתת יעילות המסירה7. ידוע היטב כי יציבות הננו-חיסונים חיונית למתן האף. לכן, השתמשנו ב-Nano ZS כדי לקבוע סדרה של פרמטרים של יציבות, כולל גודל החלקיקים, מדדי פיזור רב-פיזור, פוטנציאלי זטה וניידות אלקטרופורזה, לאחר טיפול בחלבון מוצין 0.5%.
מבחני ההיסטותאימות in vivo והישימות של תאי מבחנה הראו כי ננו-חיסון חדשני זה אינו רעיל בטווח הריכוזים שנבדקו27. תאי אפיתל סימפונות נורמליים אנושיים (BEAS-2B) הם קווי תאים סטנדרטיים המשמשים לחקר דרכי הנשימה האנושיות28. בשל עלותה הנמוכה יותר, מהירותה ודאגות אתיות מינימליות, הערכת רעילות חוץ גופית היא שיטה חשובה. במחקר זה, בדיקת הכדאיות של תאים במבחנה נקבעה על ידי בדיקת CCK8. בנוסף, הערכת רעילות in vivo מבוצעת בדרך כלל במודלים של בעלי חיים כגון עכברים וחולדות. בדיקה היסטופתולוגית מבוצעת לעיתים קרובות ברקמות החשופות לננו-חלקיקים, כגון הלב, העין, המוח, הכבד, הכליות, הריאה והטחול29. לכן, השתמשנו בשיטות אלה כדי להעריך את הרעילות של ננו-חיסון חדשני זה במבחנה ו-in vivo.
ספיגה והארכה של אנטיגן הם תנאים מוקדמים להגשת אנטיגן כדי לעורר תגובה חיסונית עוקבת30. יש צורך לקבוע את הספיגה התאית של BEAS-2B ואת פרופילי השחרור של ננו-החיסון החדש in vivo ו-in vitro. CLSM הוא היישום המסחרי הנפוץ ביותר של הטכנולוגיה הרלוונטית, אשר ניתן למצוא ברוב הגדול של מעבדות הדימות ויש לו מגוון רחב של יישומים. מכשירים אלה נמצאים בשימוש נרחב וקל יחסית לשימוש; עם זאת, הם בדרך כלל אינם אופטימליים לאיסוף נתונים כמותיים.
בפרוטוקול שלנו, קליטה סלולרית זוהתה על ידי CLSM בגלל הרזולוציה הברורה, יכולת חתך אופטי ורבגוניות עם הדמיה תלת ממדית31. בנוסף, IVIS שימש להשגת פרופילי שחרור in vivo של ננו-חומר חדשני מכיוון שהוא יכול לספק תא הדמיה עם אור חיצוני שאינו נכלל עבור ביולומינסנציה כמותית והדמיה פלואורסצנטית in vivo ו- in vitro. לכן, בפרוטוקול זה, השתמשנו בשיטות אלה כדי לקבוע את פרופילי הקליטה והשחרור התאיים של ננו-חיסונים חדשניים in vivo ו-in vitro.
חשוב גם להעריך את יעילות הגידול של הננו-חיסון החדש. במחקר שלנו, נעשה שימוש במודל נושא הגידול E.G7 כדי לקבוע את ההשפעות הטיפוליות וההגנתיות של החיסון. תאי EL4 מופקים מלימפוציטים מסוג T של עכברי C57BL/6 עם ממאירות בדרגה גבוהה. תאי E.G7 נגזרים מתאי לימפומה EL4 הנגועים באלקטרופורציה32. במחקר שלנו, ננו-חיסון זה גרם לחסינות מגנה בעכברים נושאי גידול E.G7-OVA. לסיכום, יש צורך לקבוע סדרה של פרוטוקולים לחקר המאפיינים הפיזיקוכימיים, יציבות, רעילות, פרופילי שחרור, ספיגה תאית והשפעות אנטי-סרטניות של ננו-חיסונים במבחנה ו-in vivo. פרוטוקולים אלה יספקו תוצאות שימושיות עבור ננו-חיסון האף החדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מס '31670938, 32070924, 32000651 של תוכנית הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מס '2014jcyjA0107 ומס '2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג, מס '2020XBK24 ומס '2020XBK26 של האוניברסיטה הרפואית הצבאית פרויקטים מיוחדים, ומס '202090031021 ומס '202090031035 של התוכנית הלאומית לחדשנות ויזמות לתלמידי מכללות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
- Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
- Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
- Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
- Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
- Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
- Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
- Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
- Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
- Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
- Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
- Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
- Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
- Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
- Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
- O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
- Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
- Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
- Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
- George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
- Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
- Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
- Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
- Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
- Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).
