Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Препарат, характеристики, токсичность и оценка эффективности назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA

Summary

Здесь мы представляем подробные методы приготовления и оценки назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo.

Abstract

Эпитопные пептиды привлекли широкое внимание в области противоопухолевых вакцин из-за их безопасности, высокой специфичности и удобного производства; в частности, некоторые эпитопы, ограниченные MHC I, могут индуцировать эффективную активность цитотоксических Т-лимфоцитов для очистки опухолевых клеток. Кроме того, назальное введение является эффективным и безопасным методом доставки опухолевых вакцин из-за его удобства и улучшенной комплаентности пациентов. Однако эпитопные пептиды непригодны для назальной доставки из-за их плохой иммуногенности и недостаточной эффективности доставки. Наноэмульсии (НЭ) представляют собой термодинамически стабильные системы, которые могут быть загружены антигенами и доставлены непосредственно на поверхность слизистой оболочки носа. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) является основным пентапептидом ламинина, интегринсвязывающего пептида, экспрессируемого респираторными эпителиальными клетками человека. В этом исследовании методом низкоэнергетического эмульгирования была получена интраназальная самоорганизующаяся эпитопная пептидная пептидная опухолевая вакцина NE, содержащая синтетический пептид IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ). Комбинация IKVAV и OVA257-264 может усиливать поглощение антигена эпителиальными клетками слизистой оболочки носа. Здесь мы устанавливаем протокол для изучения физико-химических характеристик с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и динамического рассеяния света (DLS); стабильность в присутствии белка муцина; токсичность путем изучения жизнеспособности клеток BEAS-2B, а также тканей носа и легких мышей C57BL/6; клеточное поглощение с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM); профили высвобождения путем визуализации мелких животных in vivo; и защитный и терапевтический эффект вакцины с использованием модели E.G7, несущей опухоль. Мы ожидаем, что протокол предоставит технические и теоретические подсказки для будущей разработки новых Т-клеточных эпитопных пептидных вакцин для слизистых оболочек.

Introduction

Являясь одной из наиболее важных инноваций в области общественного здравоохранения, вакцины играют ключевую роль в борьбе с глобальным бременем болезней человека1. Например, в настоящее время тестируется более 120 вакцин-кандидатов от болезней COVID-19, некоторые из которых были одобрены во многих странах2. В недавних сообщениях говорится, что противораковые вакцины эффективно улучшили прогресс клинического лечения рака, поскольку они направляют иммунную систему больных раком на распознавание антигенов как чужеродных для организма3. Кроме того, множественные Т-клеточные эпитопы, расположенные внутри или снаружи опухолевых клеток, могут быть использованы для разработки пептидных вакцин, которые показали преимущества в лечении метастатического рака из-за отсутствия значительной токсичности, связанной с лучевой терапией и химиотерапией 4,5. С середины 1990-х годов доклинические и клинические испытания для лечения опухолей проводились в основном с использованием антигенных пептидных вакцин, но лишь немногие вакцины проявляют адекватный терапевтический эффект у онкологических больных6. Кроме того, противораковые вакцины с пептидными эпитопами имеют плохую иммуногенность и недостаточную эффективность доставки, что может быть связано с быстрой деградацией внеклеточных пептидов, которые быстро диффундируют от места введения, что приводит к недостаточному поглощению антигена иммунными клетками7. Поэтому необходимо преодолевать эти препятствия с помощью технологии доставки вакцин.

OVA 257-264, MHC класс I-связывающий эпитоп257-264, экспрессируемый в виде слитого белка, является часто используемым модельным эпитопом8. Кроме того, OVA257-264 имеет решающее значение для адаптивного иммунного ответа против опухолей, который зависит от ответа цитотоксического Т-лимфоцита (CTL). Он опосредован антиген-специфическими CD8+ Т-клетками в опухоли, которые индуцируются пептидом OVA257-264 . Характеризуется недостаточным количеством гранзима В, который высвобождается цитотоксическими Т-клетками, что приводит к апоптозу клеток-мишеней8. Однако введение свободного пептида OVA257-264 может вызывать небольшую активность CTL, поскольку поглощение этих антигенов происходит в неспецифических клетках, а не в антигенпрезентирующих клетках (APC). Дефицит соответствующей иммунной стимуляции приводит к активности CTL5. Следовательно, индукция эффективной активности CTL требует значительного прогресса.

Благодаря барьеру, обеспечиваемому эпителиальными клетками, и непрерывной секреции слизи вакцинные антигены быстро удаляются из слизистой оболочки носа 9,10. Разработка эффективного вакцинного вектора, который может проходить через ткань слизистой оболочки, имеет решающее значение, поскольку антигенпрезентирующие клетки расположены под эпителиемслизистой оболочки 9. Интраназальное введение вакцин теоретически индуцирует иммунитет слизистой оболочки для борьбы с инфекцией слизистой оболочки11. Кроме того, назальная доставка является эффективным и безопасным методом введения вакцин из-за ее удобства, предотвращения кишечного введения и улучшения комплаентности пациентов7. Таким образом, назальная доставка является хорошим средством введения новой пептидной эпитопной нановакцины.

Было разработано несколько синтетических биоматериалов для объединения эпитопов межклеточных и клеточных взаимодействий. Некоторые биологически активные белки, такие как Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), были введены как часть структуры гидрогеля для придания биологической активности12. Этот пептид, вероятно, способствует прикреплению, миграции и ростуклеток 13 и связывает интегрины α 3β1 и α6β1 для взаимодействия с различными типами раковых клеток. IKVAV представляет собой пептид клеточной адгезии, полученный из белка базальной мембраны ламинина αцепи 1, который первоначально использовался для моделирования нейронного микроокружения и вызывания дифференцировки нейронов14. Поэтому поиск эффективного средства доставки этой новой вакцины важен для борьбы с болезнью.

Недавно зарегистрированные эмульсионные системы, такие как W805EC и MF59, также были составлены для доставки в нос инактивированной вакцины против гриппа или рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и проиллюстрированы как запускающие как слизистый, так и системный иммунитет15. Наноэмульсии (НЭ) обладают такими преимуществами, как простота введения и удобное совместное образование с эффективными адъювантами по сравнению с системами доставки слизистой оболочки твердых частиц16. Сообщалось, что наноэмульсионные вакцины изменяют аллергический фенотип устойчивым образом, отличным от традиционной десенсибилизации, что приводит к долгосрочным подавляющим эффектам17. Другие сообщили, что наноэмульсии в сочетании с Mtb-специфическими иммунодоминантными антигенами могут индуцировать мощные реакции клеток слизистой оболочки и обеспечивать значительную защиту18. Поэтому была разработана новая интраназальная самоорганизующаяся нановакцина с синтетическим пептидом IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, пептид, состоящий из IKVAV, связанного с OVA257-264). Важно систематически оценивать эту новую нановакцину.

Целью этого протокола является систематическая оценка физико-химических характеристик, токсичности и стабильности нановакцины, определение того, усиливается ли поглощение антигена, а также защитные и терапевтические эффекты с помощью технических средств, и уточнение основного содержания эксперимента. В этом исследовании мы установили ряд протоколов для изучения физико-химических характеристик и стабильности, определения величины токсичности клеток I-OVA NE to BEAS-2B с помощью CCK-8 и наблюдения за антигенпрезентирующей способностью клеток BEAS-2B к вакцине с помощью конфокальной микроскопии, оценки профилей высвобождения этой новой нановакцины in vivo и in vitroи определить защитный и терапевтический эффект этой вакцины с помощью модели мыши с опухолью E.G7-OVA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по этической экспертизе благополучия животных на лабораторных животных (GB/T 35892-2018) и были одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета. Мышей усыпляли внутрибрюшинной инъекцией 100 мг / кг 1% пентобарбитала натрия.

1. Подготовка I-OVA NE

  1. Смешайте 1 мг монофосфориллипида А (MPLA) со 100 мкл ДМСО, встряхните в течение 5 мин и дайте ему постоять в течение 4 ч при комнатной температуре (RT) до полного растворения.
  2. Количественно добавьте Tween 80 и I-OVA и перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Tween 80 и I-OVA были смешаны в соотношении масс 25:119.
  3. Добавьте сквален в смесь, приготовленную на шаге 1.2 (7:3, Smix: сквален).
  4. Добавьте 100 мкл раствора MPLA (10 мг/мл) в смесь, приготовленную на этапе 1.3.
  5. Приготовьте наноэмульсионную вакцину с использованием низкоэнергетических методов эмульгирования19: добавьте смешанный раствор к каплям воды примерно на 70% от общего объема и осторожно перемешайте до получения прозрачной и легко текучей смеси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль BNE (пустая эмульсия) был приготовлен тем же методом, заменив воду I-OVA.

2. Физико-химическая характеристика и стабильность

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените распределение капель по размерам, дзета-потенциал и другие физико-химические данные вакцины I-OVA NE, выполнив шаги 2.1-2.3; провести морфологическую характеристику вакцины I-OVA NE после этапов 2.4-2.7; и изучить 3D-структуру вакцины I-OVA NE, выполнив шаги 2.8-2.9.

  1. Смешайте 50 мг белка муцина со 100 мл воды для инъекций, чтобы приготовить 0,05% раствор муцина.
  2. Разбавьте 4 мг/мл I-OVA NE в 200 раз 0,05 мг/мл белка муцина или деионизированной воды.
  3. Наблюдайте размеры частиц, дзета-потенциал, индекс полидисперсности (PDI) и электрофоретическую подвижность при 25 °C с помощью наноанализатора19.
  4. Разбавьте 10 мкл I-OVA NE в 200 раз 2 мл деионизированной воды.
  5. Поместите 5 мкл предварительно разбавленной вакцины I-OVA NE (этап 2.4) на медную сетку с углеродным покрытием и покройте ее 10 мкл 1% фосфовольфрамовой кислоты на 3 мин.
  6. Удалите излишки фосфовольфрамовой кислоты фильтровальной бумагой.
  7. Получение изображений с помощью ПЭМ. Поместите разбавленный в 50 раз образец объемом 10 мкл на сетку из углеродистой меди размером 100 меш и дайте ей постоять при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут, прежде чем добавлять 10 мкл фосфовольфрамовой кислоты (1%, pH 7,4). Исследуют все образцы методом ПЭМ при напряжении 120 кВ.
  8. Охарактеризовать молекулярную морфологию I-OVA NE с помощью атомно-силового микроскопа высокого разрешения. Получение цветных изображений I-OVA NE при следующих условиях: для вольфрамовых зондов (постоянная силы: 0,06 Н·м-1); Диапазон сканирования: 450 нм x 450 нм; Режим постукивания: режим визуализации; и метод сканирования: точечное сканирование при RT.

3. Анализы токсичности in vitro и in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Токсичность вакцины I-OVA NE in vitro оценивали после этапов 3.1-3.9, а токсичность вакцины против I-OVA NE in vivo оценивали после этапов 3.10-3.13.

  1. Оживите эпителиальные клетки BEAS-2B человека, выполнив шаги 3.1.1-3.1.4, и культивируйте их в полной питательной среде при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить полную питательную среду, добавьте эмбриональную бычью сыворотку (FBS) и пенициллин/стрептомицин в среду RPMI-1640 в конечных концентрациях 10% и 1% соответственно.
    1. Включите водяную баню и отрегулируйте температуру до 37 °C. Извлеките ячейки, замороженные в жидком азоте, и быстро разморозьте на водяной бане с температурой 37 °C.
    2. После размораживания быстро поместите клетки пипеткой в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавьте 2 мл полной питательной среды и центрифугу при 129 x g в течение 5 мин.
    3. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 2 мл полной питательной среды, чтобы ресуспендировать клетки, и центрифугу при 129 x g в течение 5 мин.
    4. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 6 мл полной питательной среды для ресуспендирования клеток и перенесите клетки в колбу для культивирования T25 для культивирования клеток при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 .
  2. Когда плотность клеток достигает 80-90%, выбросьте питательную среду и дважды промойте клетки 2 мл PBS. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина для расщепления клеток в течение 1-2 минут. Когда наблюдается округление клеток, немедленно добавляют 4 мл полной питательной среды для нейтрализации трипсина.
  3. Смешайте и аспирируйте образцы в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 129 x g в течение 5 мин.
  4. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл полной среды RPMI-1640. Используйте 20 мкл для подсчета клеток и разбавьте клетки до 1 x 105 клеток / мл.
  5. Поместите клетки BEAS-2B плотностью 1 x 104 ячейки в 96-луночные планшеты в 100 мкл полной среды RPMI-1640 и предварительно инкубируйте планшеты в течение 24 ч при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2 .
  6. Откажитесь от надосадочной жидкости и добавьте 100 мкл I-OVA NE, 100 мкл I-OVA+BNE (физически смешанный) и 100 мкл I-OVA, предварительно разбавленный полной питательной средой в различных конечных концентрациях (0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл, 4 мг/мл, 8 мг/мл), с BNE в качестве контроля. Инкубировать 24 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 100 мкл полной питательной среды в отрицательные контрольные группы и 100 мкл клеточной суспензии (1 x 105/мл) в положительные контрольные группы.
  7. Удалите среду и добавьте 90 мкл полной питательной среды и 10 мкл раствора CCK-8 в каждую лунку пластины.
  8. Инкубируйте планшет в течение 2 ч при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 .
  9. Измерьте поглощение каждой лунки на длине волны 450 нм с помощью считывателя планшетов с маркировкой ферментов.
  10. Рассчитайте коэффициент выживаемости клеток BEAS-2B, как показано в следующем уравнении:
    (образец OD450 − отрицательный контроль OD450 / положительный контроль OD450 − отрицательный контроль OD450) × 100%
  11. Случайным образом разделите 6-недельных мышей C57BL/6 на пять групп (n = 5 в каждой группе) и обезболите их 4% изофлураном для индукции. Поддерживайте анестезию 2% изофлураном. Используйте мазь сульфата неомицина на глазах мышей, чтобы предотвратить сухость.
  12. Используйте наконечники пипеток объемом 10 мкл для проведения назальной иммунизации мышей 10 мкл / ноздрю I-OVA, I-OVA + BNE и IOVA NE в дозе 4 мг / мл в течение всех 3 дней. Используйте BNE и PBS в качестве экспериментального контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тепловую поддержку до тех пор, пока животное не оправится от анестезии.
  13. Усыпьте всех мышей внутрибрюшинной инъекцией 100 мг / кг 1% пентобарбитала натрия на 4-й день.
  14. Вырежьте ножницами образцы тканей носа толщиной примерно 3 мм и удалите легочные ткани.
  15. Зафиксируйте ткани носа и все ткани легких в 4% параформальдегиде в течение 24 ч. Обезвоживайте ткани с помощью последовательного градиента спирта и ксилола, а затем добавляйте в парафин. Готовые восковые блоки нарежьте на парафиновом слайсере толщиной 4 мкм.
  16. Окрашивайте срезы гематоксилином и эозином (H&E). Затем наблюдайте токсичность слизистой оболочки, включая гиперемию, отек, инфильтрацию нейтрофилов и структурные повреждения слизистой оболочки носа и легочной ткани, под микроскопом (100x и 200x)7.

4. Клеточное поглощение in vitro

  1. Планшетные клетки BEAS-2B плотностью 5 x 10 5 клеток/лунка в 12-луночных планшетах с покровными стеклами в 2 мл полной питательной среды и предварительно инкубируют планшеты в течение ночи при 37 °C в инкубаторе5 % CO2 .
  2. Добавьте 100 мкл меченого FITC I-OVA NE (чистота: 98,3%, производства компании, 4 мг / мл) или I-OVA (4 мг / мл) к 900 мкл клеточной суспензии и поместите при 37 ° C на 90 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте I-OVA NE с маркировкой FITC, как описано в шаге 4.1. Добавьте 1 мл полной питательной среды в контрольные группы.
  3. Промыть три раза 0,1 М PBS (1 мл/лунка) в течение 30 мин при 37 °C после обработки.
  4. Зафиксируйте эти образцы 4% параформальдегидом в течение 20 минут в темноте. После фиксации удалить параформальдегид и промыть 3 раза 0,1 М PBS (1 мл/лунка) в течение 30 мин при 37 °C.
  5. Предварительно инкубируют образцы с DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 10 мин в темноте, а затем промывают 5 раз 0,1 М PBS (1 мл/лунка) в течение 30 мин при 37 °C после обработки.
  6. Получите поглощение сотовой связи CLSM со следующими настройками параметров: Размер кадра: 512 px x 512 px, Скорость сканирования: 8; Шаг линии: 1; Усреднение: 2.

5. Выпуск в естественных условиях

  1. Обезболивайте голых мышей 4% изофлурана и поддерживайте анестезию на уровне 2% изофлурана. Иммунизируйте обнаженных мышей интраназально 10 мкл I-OVA, меченного ПЭ, в дозе 4 мг / мл или меченного ПЭ I-OVA NE в дозе 4 мг / мл в каждой ноздре.
  2. Через 0 ч, 0,5 ч, 1,5 ч, 3, 6 ч, 9 ч, 12 ч и 24 ч захватите всех мышей под наркозом с помощью системы IVIS.
  3. Выполните фоновое сканирование непосредственно перед интраназальным введением, чтобы получить пороговое значение (Min = 1,06 x 106) для корректировки изображений, собранных во все моменты времени.
  4. Нажмите на программное обеспечение Living Image , чтобы запустить последовательность, и нажмите «Инициализировать», чтобы инициализировать систему IVIS
  5. Когда он инициализируется, индикатор состояния температуры на панели управления сбором данных IVIS горит красным. Когда индикатор состояния температуры меняется на зеленый, можно выполнять визуализацию.
  6. Нажмите кнопку Мастер обработки изображений, а затем выберите пункт Флуоресценция в появившемся диалоговом окне.
  7. Отрегулируйте следующие параметры: Время экспозиции: авто сек, Биннинг: 8, F / Stop: 2, Поле зрения: D.
  8. Выберите фильтр возбуждения 620 нм и эмиссионный фильтр 670 нм. Нажмите « Получить последовательность », чтобы получить изображение.
  9. Обрабатывайте живые изображения всех мышей и данные о яркости с помощью программного обеспечения Living Image.
    1. После получения изображения нажмите «Инструменты ROI» в палитре инструментов, выберите «Круг» и сделайте круг ROI .
    2. Нажмите « Измерить рентабельность инвестиций», чтобы получить количественное значение для области рентабельности инвестиций.

6. Противоопухолевая эффективность in vivo

  1. Освежите и культивируйте клетки E.G7-OVA лимфомы мыши из EL4 с полной питательной средой, выполнив шаги 2.1.1-2.1.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить среду для полного роста клеток E.G7-OVA, смешайте среду RPMI 1640 с 2 мМ L-глютамином, чтобы она содержала 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия и добавили 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,4 мг/мл G418, 90%, и эмбриональную бычью сыворотку, 10%.
  2. Субкультурируйте клетки в соотношении 1:2, когда клетки достигают плотности от 1 x 106 клеток / мл до 1 x 107 клеток / мл.
  3. Оцените профилактический защитный эффект на мышей, как описано в шагах 6.3.1-6.3.4.
    1. Случайным образом разделите 6-недельных мышей C57BL/6 на пять групп (n = 8 в каждой группе). Обезболивайте голых мышей 4% изофлурановым газом и поддерживайте анестезию 2% изофлураном. Частично сбрейте волосы на спине и мазь с неомицинсульфатом на глазах мышей, чтобы предотвратить сухость.
    2. Интраназально иммунизируйте мышей 10 мкл 1 мг / мл I-OVA, BNE + I-OVA или I-OVA NE в каждую ноздрю, BNE (разбавленную в четыре раза PBS) или контрольную PBS 3 раза с 7-дневным интервалом между каждой иммунизацией.
    3. Инокулируйте всех мышей подкожно в правую спину 5 х 105 клеток E. G7-OVA на 7-й день после окончательной иммунизации.
    4. Через 0, 6, 9, 12, 15 и 18 дней после окончательной иммунизации контролируйте объемы опухоли, измеряя две оси опухоли с помощью цифровых штангенциркулей, и записывайте 30-дневную (после окончательной иммунизации) выживаемость мышей.
  4. Оцените терапевтический защитный эффект на мышей после инокуляции клеток E.G7-OVA, как описано в шагах 6.4.1-6.4.3. Сведения о группировке и обращении с мышами см. в шаге 6.3.1.
    1. На 0-й день подкожно вводите мышам C57BL/6 в правую спину клетки E.G7-OVA (5 x 105 клеток на мышь).
    2. Через 0, 7 и 14 дней после инъекции иммунизируйте всех мышей, интраназально иммунизированных 10 мкл I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (все в концентрациях 1 мг / мл), BNE или PBS три раза в каждую ноздрю.
    3. Через 0, 6, 9, 12, 15 и 18 дней после инъекции контролируют объем опухоли и записывают 30-дневную выживаемость мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем опухоли превышает 3000мм3, мыши должны быть усыплены из гуманных соображений, и эти мыши будут считаться мертвыми в кривой выживаемости. Объем опухоли рассчитывается по модифицированной эллипсоидальной формуле, как показано в следующем уравнении:
      Объем = π/6 x Д x Ш2
      где L представляет собой длину опухоли, а W — ширину опухоли (единица длины: мм, единица объема:3 мм).

7. Статистический анализ

  1. Проанализируйте различия в данных между различными группами, используя соответствующее статистическое программное обеспечение с односторонним ANOVA, множественными сравнениями Тьюки или t-критерием Стьюдента. Используйте метод Каплана-Мейера для оценки результатов выживания и сравнения групп со статистикой логарифмических рангов. Выразите все результаты как среднее ± SD. Значимость значений P P < 0,05, P < 0,01 и P < 0,001 представлена на графиках с помощью *, ** и *** соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В соответствии с протоколом мы завершили подготовку и экспериментальную оценку in vitro и in vivo доставки нановакцины против опухоли носа. TEM, AFM и DLS являются эффективными средствами для оценки основных характеристик поверхностного дзета-потенциала и размера частиц нановакцины (рис. 1). Эпителиальные клетки BEAS-2B являются полезной скрининговой моделью для тестирования токсичности назальных вакцин in vitro (рис. 2A). Микрофотографии, окрашенные H&E, показывают, что I-OVA NE не имеет очевидной токсичности слизистой оболочки, включая повреждение тканей, кровотечение или воспалительную клеточную инфильтрацию (рис. 2B). Эффективное поглощение антигена клетками BEAS-2B в полости носа является необходимым условием для презентации антигена для вызова последующих иммунных реакций (рис. 3). Система IVIS помогает выяснить эффект замедленного высвобождения I-OVA NE in vitro и предполагает, что эта нановакцина может задерживать быстрое высвобождение, продлевать время в области носа и улучшать поглощение пептидов клетками (рис. 4). Профилактические защитные модели и терапевтические защитные модели непосредственно отражают защитный эффект вакцины I-OVA NE и способность вакцины I-OVA NE ингибировать рост опухоли и продлевать медианное время выживания мышей (рис. 5). Приведенные выше экспериментальные результаты были опубликованы Yang et al.7.

Figure 1
Рисунок 1: Физические характеристики и стабильность I-OVA NE . (A) Просвечивающая электронная микрофотография (TEM), масштабная линейка = 100 нм. (B) Микрофотография атомно-силовой микроскопии (АСМ). Оси X и Y имеют общую длину 450 нм. (C) Размер, диаметр и распределение. (D) Дзета-потенциал и распределение анализов I-OVA NE, выполненных с использованием Nano ZS. (E) Размеры частиц, (F) индексы полидисперсности, (G) дзета-потенциалы и (H) электрофорезная подвижность I-OVA NE в анализах стабильности муцина, выполненных с использованием Nano ZS. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Yang et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Токсичность I-OVA NE IN VITRO и in vivo. (A) Относительная жизнеспособность клеток BEAS-2B в культуре, подвергшейся воздействию различных концентраций пептидов I-OVA, BNE+I-OVA и I-OVA NE в течение 24 ч. BNE использовали в качестве контроля. Данные выражаются в виде среднего значения ± SD (n = 3). (B) Микроскопическое исследование патологических участков слизистой оболочки носа и тканей легких, фиксируемое через 5 ч после вызова. Изображения были получены с 100-кратным и 200-кратным увеличением. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Yang et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Клеточное поглощение I-OVA NE. Конфокальная флуоресцентная визуализация in vitro клеток BEAS-2B, обработанных в течение 1 ч I-OVA или I-OVA NE. PBS использовали в качестве контроля, I-OVA помечали FITC (зеленая флуоресценция), а ядра окрашивали DAPI (синяя флуоресценция) (масштабная линейка = 50 мкм). Этот рисунок был адаптирован с разрешения Yang et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Высвобождение I-OVA NE IN VITRO. (A) Флуоресцентная визуализация I-OVA, меченной PE, in vivo в носовой полости мыши. Относительная интенсивность флуоресценции, зарегистрированная через 0 ч, 0,5 ч, 1,5 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч и 24 ч после назального введения I-OVA или I-OVA NE. (b) Количественное определение интенсивности флуоресценции. Данные выражаются в виде среднего значения ± SD (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; и ***: P < 0,001. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Yang et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Противоопухолевая эффективность I-OVA NE IN VIVO. (A) Средние кривые роста опухоли у вакцинированных мышей в моделях профилактической защиты. (B) Процент выживаемости вакцинированных мышей в моделях профилактической защиты. (C) Средние кривые роста опухоли у вакцинированных мышей в терапевтических защитных моделях. (D) Процент выживаемости вакцинированных мышей в терапевтических защитных моделях. *: P < 0,05; **: P < 0,01; и ***: P < 0,001. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Yang et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нановакцины, функционализированные мембранами иммуноцитов, имеют большие преимущества в терапии, направленной на болезнь, а побочные эффекты сводятся к минимуму благодаря таким свойствам, как уникальный опухолевый тропизм, идентификация специфических мишеней, длительная циркуляция, усиление межклеточных взаимодействий и низкая системная токсичность. Они также могут быть легко интегрированы с другими модулями лечения для совместного лечения рака 16,20. Желательные атрибуты могут быть получены путем контроля физических и химических свойств, таких как измерение, форма и электрический заряд. Таким образом, нановакцины приобрели важное значение в широком спектре применений21. Эти свойства являются основными решающими факторами в отношении поглощения и токсичности, и нановакцины могут стать нетоксичными только путем манипуляции22. Поэтому этот протокол для изучения физико-химических характеристик, включая форму, размер и заряд, имеет жизненно важное значение. ТЭМ является высокоточным прибором, который широко используется в научном сообществе в течение многих лет23. Он стал важным инструментом для понимания свойств наноструктурированных материалов и манипулирования их поведением. Кроме того, атомно-силовая микроскопия (АСМ) стала мощным методом наномеханической характеристики биологических образцов24. Он может предоставлять 3D- и наноразмерную информацию с высоким разрешением, а также анализировать детали поверхности на атомном уровне. В дополнение к определению изменений в распределении частиц по размерам, DLS может измерять как размер, так и заряд, чтобы предоставить информацию о состоянии агрегации наночастиц в растворе25.

Сообщалось, что высокие значения дзета-потенциала необходимы для хорошей стабильности коллоидных суспензий26. В этом исследовании мы использовали эти протоколы для оценки физико-химических характеристик нановакцин с TEM, AFM и DLS. Более того, поверхность слизистой оболочки носа содержит большое количество слизи, которая обеспечивает смазку, влагу и химический защитный барьер. Это может быть связано с взаимодействием между слизью и некоторыми антигенами или системами доставки, что приводит к накоплению и «захвату» антигенов или систем доставки и их последующему удалению, что значительно снижает эффективность доставки7. Хорошо известно, что стабильность нановакцин жизненно важна для назального введения. Поэтому мы использовали Nano ZS для определения ряда параметров стабильности, включая размер частиц, индексы полидисперсности, дзета-потенциалы и подвижность электрофореза, после обработки 0,5% белком муцином.

Анализы гистосовместимости in vivo и жизнеспособности клеток in vitro показали, что эта новая нановакцина нетоксична в диапазоне протестированных концентраций27. Нормальные клетки бронхиального эпителия человека (BEAS-2B) представляют собой стандартные клеточные линии, используемые для исследования дыхательных путейчеловека 28. Из-за его более низкой стоимости, скорости и минимальных этических проблем оценка токсичности in vitro является важным методом. В этом исследовании анализ жизнеспособности клеток in vitro определялся с помощью анализа CCK8. Кроме того, оценка токсичности in vivo обычно проводится на животных моделях, таких как мыши и крысы. Гистопатологическое исследование часто проводится на тканях, подвергшихся воздействию наночастиц, таких как сердце, глаз, мозг, печень, почки, легкие и селезенка29. Поэтому мы использовали эти методы для оценки токсичности этой новой нановакцины in vitro и in vivo.

Поглощение и продление антигена являются предпосылками для подчинения антигена, чтобы вызвать последующий иммунный ответ30. Необходимо определить клеточное поглощение BEAS-2B и профили высвобождения новой нановакцины in vivo и in vitro. CLSM является наиболее распространенной коммерческой реализацией соответствующей технологии, которую можно найти в подавляющем большинстве лабораторий визуализации и которая имеет широкий спектр применения. Эти инструменты широко используются и относительно просты в использовании; Однако они, как правило, не являются оптимальными для сбора количественных данных.

В нашем протоколе клеточное поглощение было обнаружено CLSM из-за четкого разрешения, возможности оптического секционирования и универсальности с 3D-визуализацией31. Кроме того, IVIS был использован для получения профилей высвобождения нового наноматериала in vivo, поскольку он может обеспечить камеру визуализации с внешним светом, исключенным для количественной биолюминесценции и флуоресцентной визуализации in vivo и in vitro. Поэтому в этом протоколе мы использовали эти методы для определения профилей клеточного поглощения и высвобождения новых нановакцин in vivo и in vitro.

Также важно оценить опухолевую эффективность новой нановакцины. В нашем исследовании модель опухоли E.G7 использовалась для определения терапевтических и защитных эффектов вакцины. Клетки EL4 получены из Т-лимфоцитов мышей C57BL / 6 со злокачественным новообразованием высокой степени злокачественности. Клетки E.G7 получены из клеток лимфомы EL4, трансфицированных электропорацией32. В нашем исследовании эта нановакцина индуцировала защитный иммунитет у мышей с опухолями E.G7-OVA. Таким образом, необходимо разработать ряд протоколов для изучения физико-химических характеристик, стабильности, токсичности, профилей высвобождения, клеточного поглощения и противоопухолевых эффектов нановакцин in vitro и in vivo. Эти протоколы обеспечат полезные результаты для новой назальной нановакцины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано No 31670938, 32070924, 32000651 Программы Национального фонда естественных наук Китая, No 2014jcyjA0107 и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина, No 2020XBK24 и No 2020XBK26 специальных проектов Армейского медицинского университета, а также No 202090031021 и No 202090031035 Национальной программы инноваций и предпринимательства для студентов колледжей.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.		 tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 187
Препарат, характеристики, токсичность и оценка эффективности назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in <em>vitro</em> и <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., … More

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter