Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Forberedelse, egenskaper, toksisitet og effekt Evaluering av nasal selvmontert nanoemulsjonstumorvaksine in vitro og in vivo

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA

Summary

Her presenterer vi detaljerte metoder for fremstilling og evaluering av nasal selvmontert nanoemulsjonstumorvaksine in vitro og in vivo .

Abstract

Epitoppeptider har tiltrukket seg stor oppmerksomhet innen tumorvaksiner på grunn av deres sikkerhet, høye spesifisitet og praktiske produksjon; Spesielt kan noen MHC I-begrensede epitoper indusere effektiv cytotoksisk T-lymfocyttaktivitet for å fjerne tumorceller. I tillegg er nasal administrasjon en effektiv og sikker leveringsteknikk for tumorvaksiner på grunn av dens bekvemmelighet og forbedret pasientoverensstemmelse. Imidlertid er epitoppeptider uegnet for nasal levering på grunn av deres dårlige immunogenisitet og mangel på leveringseffektivitet. Nanoemulsjoner (NE) er termodynamisk stabile systemer som kan lastes med antigener og leveres direkte til neseslimhinnens overflate. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) er kjernen pentapeptid av laminin, et integrinbindende peptid uttrykt av humane respiratoriske epitelceller. I denne studien ble en intranasal selvmontert epitoppeptid NE-tumorvaksine inneholdende det syntetiske peptidet IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) fremstilt ved en lavenergiemulgeringsmetode. Kombinasjonen av IKVAV og OVA257-264 kan øke antigenopptaket i neseslimhinneepitelceller. Her etablerer vi en protokoll for å studere de fysisk-kjemiske egenskapene ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), atomkraftmikroskopi (AFM) og dynamisk lysspredning (DLS); stabilitet i nærvær av mucinprotein; toksisitet ved å undersøke cellelevedyktigheten til BEAS-2B-celler og nese- og lungevev hos C57BL/6-mus; cellulært opptak ved konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM); frigjøringsprofiler ved avbildning av små dyr in vivo; og den beskyttende og terapeutiske effekten av vaksinen ved bruk av en E.G7 tumorbærende modell. Vi forventer at protokollen vil gi tekniske og teoretiske ledetråder for fremtidig utvikling av nye T-celleepitop-peptidslimhinnevaksiner.

Introduction

Som en av de mest kritiske folkehelseinnovasjonene spiller vaksiner en nøkkelrolle i å bekjempe den globale byrden av menneskelig sykdom1. For eksempel testes for tiden mer enn 120 kandidatvaksiner for COVID-19-sykdommer, hvorav noen er godkjent i mange land2. Nylige rapporter sier at kreftvaksiner effektivt har forbedret fremdriften av kliniske kreftbehandlinger fordi de leder immunsystemet til kreftpasienter til å gjenkjenne antigener som fremmede for kroppen3. Videre kan flere T-celleepitoper lokalisert i eller utenfor tumorceller brukes til å designe peptidvaksiner, som har vist fordeler ved behandling av metastatisk kreft på grunn av mangel på signifikant toksisitet forbundet med strålebehandling og kjemoterapi 4,5. Siden midten av 1990-tallet har prekliniske og kliniske studier for tumorbehandling hovedsakelig blitt utført ved bruk av antigenpeptidvaksiner, men få vaksiner har tilstrekkelig terapeutisk effekt på kreftpasienter6. Videre har kreftvaksiner med peptidepitoper dårlig immunogenitet og utilstrekkelig leveringseffektivitet, noe som kan skyldes rask nedbrytning av ekstracellulære peptider som diffunderer raskt fra administrasjonsstedet, noe som fører til utilstrekkelig antigenopptak av immunceller7. Derfor er det nødvendig å overvinne disse hindringene med vaksineleveringsteknologi.

OVA 257-264, MHC klasse I-bindende257-264 epitop uttrykt som et fusjonsprotein, er en hyppig brukt modellepitop8. I tillegg er OVA257-264 avgjørende for den adaptive immunresponsen mot svulster, som avhenger av cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) respons. Det medieres av antigenspesifikke CD8+ T-celler i svulsten, som induseres av OVA257-264-peptidet . Det er preget av utilstrekkelig granzyme B, som frigjøres av cytotoksiske T-celler, noe som fører til apoptose av målceller8. Imidlertid kan fri OVA257-264 peptidadministrasjon indusere liten CTL-aktivitet fordi opptaket av disse antigenene forekommer i uspesifikke celler i stedet for antigenpresenterende celler (APCer). Mangelen på passende immunstimulering resulterer i CTL-aktivitet5. Derfor krever induksjon av effektiv CTL-aktivitet betydelig fremgang.

På grunn av barrieren fra epitelceller og kontinuerlig sekresjon av slim, fjernes vaksineantigener raskt fra neseslimet 9,10. Å utvikle en effektiv vaksinevektor som kan passere gjennom slimhinnevevet er avgjørende fordi de antigenpresenterende cellene ligger under slimhinneepitelet9. Intranasal injeksjon av vaksiner induserer teoretisk slimhinneimmunitet for å bekjempe slimhinneinfeksjon11. I tillegg er nasal levering en effektiv og sikker administrasjonsmetode for vaksiner på grunn av dens bekvemmelighet, unngåelse av tarmadministrasjon og forbedret pasientoverensstemmelse7. Derfor er nasal levering et godt administrasjonsmiddel for den nye peptidepitopen nanovaccine.

Flere syntetiske biomaterialer har blitt utviklet for å kombinere epitoper av celle-vev og celle-celle-interaksjoner. Visse bioaktive proteiner, som Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), har blitt introdusert som en del av hydrogelens struktur for å gi bioaktivitet12. Dette peptidet bidrar sannsynligvis til cellefeste, migrasjon og utvekst13 og binder integriner α 3β1 ogα 6β1 for å interagere med forskjellige kreftcelletyper. IKVAV er et celleadhesjonspeptid avledet fra lamininkjellermembranproteinet α1-kjeden som opprinnelig ble brukt til å modellere det nevrale mikromiljøet og forårsake nevrondifferensiering14. Derfor er det viktig å finne et effektivt leveringsmiddel for denne nye vaksinen for sykdomskontroll.

Nylig rapporterte emulsjonssystemer, som W805EC og MF59, har også blitt forsterket for nesehulelevering av inaktivert influensavaksine eller rekombinant hepatitt B overflateantigen og illustrert for å utløse både mukosal og systemisk immunitet15. Nanoemulsjoner (NE) har fordelene ved enkel administrasjon og praktisk samdannelse med effektive hjelpestoffer sammenlignet med partikkelformige slimhinneleveringssystemer16. Nanoemulsjonsvaksiner har blitt rapportert å endre den allergiske fenotypen på en vedvarende måte forskjellig fra tradisjonell desensibilisering, noe som resulterer i langsiktige undertrykkende effekter17. Andre rapporterte at nanoemulsjoner kombinert med Mtb-spesifikke immunodominante antigener kunne indusere potente slimhinnecelleresponser og gi betydelig beskyttelse18. Derfor ble en ny intranasal selvmontert nanovaksine med det syntetiske peptidet IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, peptidet bestående av IKVAV bundet til OVA257-264) designet. Det er viktig å vurdere denne nye nanovaksinen systematisk.

Formålet med denne protokollen er å systematisk evaluere de fysisk-kjemiske egenskapene, toksisiteten og stabiliteten til nanovaccinen, oppdage om antigenopptak og beskyttende og terapeutiske effekter forbedres ved hjelp av tekniske midler, og utdype det viktigste eksperimentelle innholdet. I denne studien etablerte vi en rekke protokoller for å studere de fysisk-kjemiske egenskapene og stabiliteten, bestemme størrelsen på toksisiteten til I-OVA NE til BEAS-2B-celler ved CCK-8, og observere antigenpresenterende evne til BEAS-2B-celler til vaksinen ved hjelp av konfokalmikroskopi, evaluere frigjøringsprofilene til denne nye nanovaccinen in vivo og in vitro , og oppdage den beskyttende og terapeutiske effekten av denne vaksinen ved å bruke en E.G7-OVA tumorbærende musemodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøkene ble utført i samsvar med Laboratory Animal-Guideline for ethical review of animal welfare (GB / T 35892-2018) og ble godkjent av Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee of the Third Military Medical University. Musene ble avlivet ved en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg av 1% natriumpentobarbital.

1. Tilberedning av I-OVA NE

  1. Bland 1 mg monofosforyllipid A (MPLA) med 100 μL DMSO, virvel i 5 minutter, og la den stå i 4 timer ved romtemperatur (RT) for å oppløses helt.
  2. Tilsett Tween 80 og I-OVA kvantitativt og bland.
    MERK: Tween 80 og I-OVA ble blandet i et masseforhold på 25:119.
  3. Tilsett skvalen i blandingen tilberedt i trinn 1.2 (7:3, Smix: squalen).
  4. Tilsett 100 mikrol MPLA-oppløsning (10 mg/ml) til blandingen tilberedt i trinn 1.3.
  5. Forbered nanoemulsjonsvaccinen ved hjelp av lavenergiemulgeringsmetoder19: tilsett den blandede løsningen til vanndråper ved ca. 70% av totalvolumet og rør forsiktig for å oppnå en gjennomsiktig og lett flytende blanding.
    MERK: BNE-kontrollen (blank emulsjon) ble fremstilt med samme metode, og erstattet vann med I-OVA.

2. Fysisk-kjemisk karakterisering og stabilitet

MERK: Vurder dråpestørrelsesfordelingen, zetapotensialet og andre fysisk-kjemiske data for I-OVA NE-vaksinen etter trinn 2.1-2.3; utføre morfologisk karakterisering av I-OVA NE-vaksinen etter trinn 2.4-2.7; og undersøke 3D-strukturen til I-OVA NE-vaksinen etter trinn 2.8-2.9.

  1. Bland 50 mg mucinprotein med 100 ml vann til injeksjonsvæsker for å fremstille en 0,05 % mucinoppløsning.
  2. Fortynn 4 mg/ml i-ova ne 200 ganger med 0,05 mg/ml mucinprotein eller avionisert vann.
  3. Observer partikkelstørrelser, zetapotensial, polydispersitetsindeks (PDI) og elektroforetisk mobilitet ved 25 °C ved hjelp av en nanoanalysator19.
  4. Fortynn 10 μL I-OVA NE 200 ganger med 2 ml avionisert vann.
  5. Plasser 5 μL fortynnet I-OVA NE-vaksine (trinn 2.4) på et karbonbelagt kobbergitter, og dekk det med 10 μL 1% fosfotungstisk syre i 3 minutter.
  6. Fjern overflødig fosfotungstisk syre med filterpapir.
  7. Få bilder ved hjelp av TEM. Plasser en 10 μL-prøve fortynnet 50 ganger på et 100-mesh karbonkobbergitter og la det stå ved romtemperatur (RT) i 5 minutter før du tilsetter 10 μL fosfotungstisk syre (1%, pH 7,4). Undersøk alle prøvene med TEM ved en spenning på 120 kV.
  8. Karakterisere molekylær morfologi av I-OVA NEved hjelp av et høyoppløselig atomkraftmikroskop. Få fargebilder av I-OVA NE under følgende forhold: for wolframprober (kraftkonstant: 0,06 N · m-1); skanneområde: 450 nm x 450 nm; trykkemodus: bildemodus; og skannemetode: punkt-for-punkt-skanning ved RT.

3. In vitro og in vivo toksisitetsanalyser

MERK: In vitro-toksisiteten til I-OVA NE-vaksinen ble vurdert etter trinn 3.1-3.9, og in vivo-toksisiteten til I-OVA NE-vaksinen ble vurdert etter trinn 3.10-3.13.

  1. Gjenopplive humane BEAS-2B epitelceller ved å følge trinn 3.1.1-3.1.4 og dyrke dem i et komplett vekstmedium ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
    MERK: For å forberede hele vekstmediet, tilsett føtalt bovint serum (FBS) og penicillin / streptomycin til RPMI-1640-mediet ved endelige konsentrasjoner på henholdsvis 10% og 1%.
    1. Slå på vannbadet og juster temperaturen til 37 °C. Fjern cellehetteglassene som er frosset i flytende nitrogen og tine raskt i et vannbad på 37 °C.
    2. Etter tining pipetterer du cellene raskt inn i et 15 ml sterilt sentrifugerør, tilsett 2 ml av det komplette vekstmediet og sentrifuge ved 129 x g i 5 minutter.
    3. Fjern supernatanten, tilsett 2 ml av hele vekstmediet for å resuspendere cellene, og sentrifuger ved 129 x g i 5 minutter.
    4. Fjern supernatanten, tilsett 6 ml komplett vekstmedium for å resuspendere cellene, og overfør cellene til en T25-kulturkolbe for å dyrke cellene ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator.
  2. Når celletettheten når 80% -90%, kast kulturmediet og vask cellene to ganger med 2 ml PBS. Tilsett 1 ml 0,25% trypsin for å fordøye cellene i 1-2 minutter. Når avrunding av cellene observeres, tilsett umiddelbart 4 ml av det komplette vekstmediet for å nøytralisere trypsinet.
  3. Bland og aspirer prøvene til et 15 ml sterilt sentrifugerør og sentrifuge ved 129 x g i 5 minutter.
  4. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml RPMI-1640 komplett medium. Bruk 20 μL til celletelling, og fortynn cellene til 1 x 105 celler/ml.
  5. Plate BEAS-2B-cellene med en tetthet på 1 x 104 celler / brønn i 96-brønnplater i 100 μL RPMI-1640 komplett medium og preinkuber platene i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator.
  6. Kast supernatanten og tilsett 100 μL I-OVA NE, 100 μL I-OVA+BNE (fysisk blandet) og 100 μL I-OVA forfortynnet med et komplett vekstmedium ved forskjellige endelige konsentrasjoner (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml), med BNE som kontroll. Inkuber i 24 timer ved 37 °C.
    MERK: Legg til 100 μL komplett vekstmedium til de negative kontrollgruppene og 100 mikrol cellesuspensjon (1 x 105/ml) til de positive kontrollgruppene.
  7. Fjern mediet og tilsett 90 μL komplett vekstmedium og 10 μL CCK-8-løsning til hver brønn på platen.
  8. Inkuber platen i 2 timer ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
  9. Mål absorbansen til hver brønn ved 450 nm ved hjelp av en enzymmerket plateleser.
  10. Beregn overlevelsesforholdet mellom BEAS-2B-celler som angitt i følgende ligning:
    (OD450 prøve− OD450 negativ kontroll/OD450 positiv kontroll− OD450 negativ kontroll) × 100 %
  11. Del tilfeldig 6 uker gamle C57BL/6 mus inn i fem grupper (n = 5 i hver gruppe) og bedøv dem med 4% isofluran for induksjon. Oppretthold anestesi med 2% isofluran. Bruk neomycinsulfatsalve på musens øyne for å forhindre tørrhet.
  12. Bruk 10 μL pipettespisser for å utføre nasal immunisering av musene med 10 μL / nesebor av I-OVA, I-OVA + BNE og IOVA NE ved 4 mg / ml i alle de 3 dagene. Bruk BNE og PBS som eksperimentell kontroll.
    MERK: Gi termisk støtte til dyret gjenoppretter fra anestesi.
  13. Avlive alle musene ved en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital på dag 4.
  14. Klipp ca. 3 mm tykke prøver av nesevev med saks, og fjern lungevevvet.
  15. Fest nesevevet og hele lungevevvet i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Dehydrer vevet gjennom en seriell alkohol- og xylengradient og legg deretter inn i parafin. Skjær de ferdige voksblokkene på en parafinskive med en tykkelse på 4 μm.
  16. Flekk seksjonene med hematoksylin og eosin (H&E). Deretter observere slimhinnetoksisitet, inkludert hyperemi, ødem, nøytrofil infiltrasjon og strukturell skade i neseslimhinnen og lungevevvet, under et mikroskop (100x og 200x)7.

4. In vitro cellulært opptak

  1. Plate BEAS-2B-celler med en tetthet på 5 x 10 5 celler / brønn i 12-brønnsplater med deksel i 2 ml av det komplette vekstmediet og preinkuber platene over natten ved 37 ° C i en5 % CO2 -inkubator.
  2. Tilsett 100 μL FITC-merket I-OVA NE (renhet: 98,3%, produsert av selskapet, 4 mg / ml) eller I-OVA (4 mg / ml) til 900 μL cellesuspensjon og sett ved 37 ° C i 90 minutter.
    MERK: Forbered FITC-merket I-OVA NE som beskrevet i trinn 4.1. Legg til 1 ml komplett vekstmedium til kontrollgruppene.
  3. Vask tre ganger med 0,1 M PBS (1 ml/brønn) i 30 minutter ved 37 °C etter behandlingen.
  4. Fest disse prøvene med 4% paraformaldehyd i 20 minutter i mørket. Etter fiksering, fjern paraformaldehydet og vask 3 ganger med 0,1 M PBS (1 ml / brønn) i 30 minutter ved 37 ° C.
  5. Preinkuber prøvene med DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol) i en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml i 10 minutter i mørket, og vask deretter 5 ganger med 0,1 M PBS (1 ml/brønn) i 30 minutter ved 37 °C etter behandling.
  6. Få det cellulære opptaket ved CLSM med følgende parameterinnstillinger: Rammestørrelse: 512 px x 512 px, Skannehastighet: 8; Linje trinn: 1; Gjennomsnitt: 2.

5. In vivo-utgivelse

  1. Bedøv nakne mus med 4% isofluran gass og oppretthold anestesi ved 2% isofluran. Immuniser nakne mus intranasalt med 10 μL PE-merket I-OVA ved 4 mg / ml eller PE-merket I-OVA NE ved 4 mg / ml i hvert nesebor.
  2. Ved 0 timer, 0,5 timer, 1,5 timer, 3, 6 timer, 9 timer, 12 timer og 24 timer, fang alle musene under anestesi av IVIS-systemet.
  3. Utfør en bakgrunnsskanning umiddelbart før intranasal administrering for å gi en terskelverdi (Min = 1,06 x 106) for å justere bildene samlet på alle tidspunkter.
  4. Klikk på Living Image-programvaren for å starte sekvensen og klikk Initialiser for å initialisere IVIS-systemet
  5. Når den initialiseres, lyser temperaturstatuslampen i IVIS-oppsamlingskontrollpanelet rødt. Når temperaturstatuslyset skifter til grønt, kan avbildning utføres.
  6. Klikk Bildeveiviser, og velg deretter Fluorescens i dialogboksen som vises.
  7. Juster følgende parametere: Eksponeringstid: automatisk sek, Binning: 8, F / Stop: 2, Synsfelt: D.
  8. Velg 620 nm eksitasjonsfilter og 670 nm utslippsfilter. Klikk på Skaff sekvens for å skaffe bildet.
  9. Behandle levende bilder av alle musene og utstrålingsdataene med Living Image-programvaren.
    1. Etter å ha anskaffet bildet, klikk på ROI-verktøy i verktøypaletten, velg sirkel og lag en ROI-sirkel.
    2. Klikk på Mål avkastning for å få en kvantitativ verdi for ROI-området.

6. In vivo antitumor effekt

  1. Oppdater og dyrk muselymfom E.G7-OVA-celler fra EL4 med et komplett vekstmedium etter trinn 2.1.1-2.1.4.
    MERK: For å forberede E.G7-OVA-celle komplett vekstmedium, bland RPMI 1640 medium med 2 mM L-glutamin justert for å inneholde 1,5 g / l natriumbikarbonat, 4,5 g / l glukose, 10 mM HEPES og 1,0 mM natriumpyruvat og supplert med 0,05 mM 2-merkaptoetanol og 0,4 mg / ml G418, 90% og føtalt bovint serum, 10%.
  2. Subkultur cellene i forholdet 1:2 når cellene når en tetthet mellom 1 x 106 celler/ml og 1 x 107 celler/ml.
  3. Evaluer den forebyggende beskyttende effekten på mus som beskrevet i trinn 6.3.1-6.3.4..
    1. Del tilfeldig 6 uker gamle C57BL/6 mus inn i fem grupper (n = 8 i hver gruppe). Bedøv nakne mus med 4% isofluran gass og oppretthold anestesi med 2% isofluran. Barber delvis bakhåret og neomycinsulfatsalven på musens øyne for å forhindre tørrhet.
    2. Immuniser musene intranasalt med 10 μL 1 mg / ml i-ova, BNE + I-OVA eller I-OVA NE i hvert nesebor, BNE (fortynnet fire ganger med PBS), eller en PBS-kontroll 3 ganger med et 7-dagers intervall mellom hver immunisering.
    3. Inokuler alle musene hypodermisk inn i høyre rygg med 5 x 105 E. G7-OVA-celler på den 7. dagen etter den endelige immuniseringen.
    4. Ved 0, 6, 9, 12, 15 og 18 dager etter den endelige immuniseringen, overvåke tumorvolumene ved å måle to akser av svulsten ved hjelp av digitale kalipere, og registrere 30-dagers (etter den endelige immuniseringen) overlevelse av musene.
  4. Evaluer den terapeutiske beskyttende effekten på mus etter inokulering av E.G7-OVA-celler som beskrevet i trinn 6.4.1-6.4.3. For gruppering og håndtering av mus, se trinn 6.3.1.
    1. På dag 0, injiser C57BL/6-musene subkutant i høyre rygg med E.G7-OVA-celler (5 x 105 celler/mus).
    2. Ved 0, 7 og 14 dager etter injeksjon, immuniser alle musene intranasalt immunisert med 10 μL I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (alle i konsentrasjoner på 1 mg / ml), BNE eller PBS tre ganger i hvert nesebor.
    3. Ved 0, 6, 9, 12, 15 og 18 dager etter injeksjon, overvåke tumorvolumet og registrere musens 30-dagers overlevelse.
      MERK: Hvis tumorvolumet overstiger 3000 mm3, bør musene avlives av humane årsaker, og disse musene vil bli ansett som døde i overlevelseskurven. Tumorvolum beregnes med en modifisert ellipsoidformel som angitt i følgende ligning:
      Volum = π/6 x L x B2
      hvor L representerer tumorlengden, og W representerer tumorbredden (lengdeenhet: mm, volumenhet: mm3).

7. Statistisk analyse

  1. Analyser forskjellene i data mellom de forskjellige gruppene ved hjelp av passende statistisk programvare med enveis ANOVA, Tukeys flere sammenligninger eller en Student t-test. Bruk Kaplan-Meier-metoden til å estimere overlevelsesutfall og sammenligne gruppene med log-rank-statistikk. Uttrykk alle resultatene som gjennomsnitt ± SD. Betydningen av P-verdiene P < 0,05, P < 0,01 og P < 0,001 er representert ved bruk av henholdsvis *, ** og *** på plottene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I henhold til protokollen fullførte vi preparatet og in vitro og in vivo eksperimentell evaluering av nasal tumor nanovaccine levering. TEM, AFM og DLS er effektive midler for vurdering av de grunnleggende egenskapene til overflatezetapotensialet og partikkelstørrelsen til nanovaksinen (figur 1). BEAS-2B epitelceller er en nyttig screeningmodell for in vitro toksisitetstesting av nasale vaksiner (figur 2A). Mikrofotografiene farget med H&E illustrerer at I-OVA NE ikke hadde noen åpenbar slimhinnetoksisitet, inkludert vevsskade, blødning eller inflammatorisk celleinfiltrasjon (figur 2B). Effektivt opptak av antigenet i BEAS-2B-celler i nesehulen er en forutsetning for at antigenpresentasjon skal fremkalle senere immunresponser (figur 3). IVIS-systemet bidrar til å belyse effekten av I-OVA NE in vitro og antyder at denne nanovaksinen kan forsinke rask frigjøring, forlenge tiden i neseområdet og forbedre opptaket av peptider i celler (figur 4). De forebyggende beskyttelsesmodellene og de terapeutiske beskyttelsesmodellene reflekterer direkte den beskyttende effekten av I-OVA NE-vaksinen og I-OVA NE-vaksinens evne til å hemme tumorvekst og forlenge median overlevelsestid hos mus (figur 5). Ovennevnte eksperimentelle resultater er publisert av Yang et al.7.

Figure 1
Figur 1: Fysiske egenskaper og stabilitet av I-OVA NE . (A) Transmisjonselektronmikrografi (TEM), skalastang = 100 nm. (B) Atomkraftmikroskopi (AFM) mikrograf. X- og Y-aksene har begge en total lengde på 450 nm. (C) Størrelse, diameter og fordeling. (D) Zeta-potensial og distribusjon av I-OVA NE-analyser utført ved bruk av Nano ZS. (E) Partikkelstørrelser, (F) polydispersitetsindekser, (G) zetapotensialer og (H) elektroforesemobilitet av I-OVA NE i mucin stabilitetsanalyser utført ved bruk av Nano ZS. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Yang et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: In vitro og in vivo toksisitet av I-OVA NE. (A) Relativ levedyktighet av BEAS-2B-celler i kultur eksponert for forskjellige peptidkonsentrasjoner av I-OVA, BNE+I-OVA, og I-OVA NE i 24 timer. BNE ble brukt som kontroll. Dataene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n = 3). (B) Mikroskopisk undersøkelse av patologiske deler av neseslimhinnen og lungevevet fast 5 timer etter utfordringen. Bildene ble tatt med 100x og 200x forstørrelse. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Yang et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Cellulært opptak av I-OVA NE. IN vitro konfokal fluorescensavbildning av BEAS-2B-celler behandlet i 1 time med I-OVA eller I-OVA NE. PBS ble brukt som kontroll, I-OVA ble merket med FITC (grønn fluorescens), og kjernene ble farget med DAPI (blå fluorescens) (skala bar = 50 μm). Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Yang et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: In vitro frisetting av I-OVA NE. (A) In vivo fluorescensavbildning av PE-merket I-OVA i nesehulen hos mus. Relativ fluorescensintensitet registrert ved 0 timer, 0,5 timer, 1,5 timer, 3 timer, 6 timer, 9 timer, 12 timer og 24 timer etter nasal administrering av I-OVA eller I-OVA NE. (B) Kvantifisering av fluorescensintensitet. Dataene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; og ***: P < 0,001. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Yang et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: In vivo antitumoreffekt av I-OVA NE . (A) Gjennomsnittlige tumorvekstkurver for de vaksinerte musene i de forebyggende beskyttelsesmodellene. (B) Prosent overlevelse av de vaksinerte musene i de forebyggende beskyttelsesmodellene. (C) Gjennomsnittlige tumorvekstkurver for de vaksinerte musene i de terapeutiske beskyttelsesmodellene. (D) Prosentvis overlevelse av de vaksinerte musene i de terapeutiske beskyttelsesmodellene. *: P < 0,05; **: P < 0,01; og ***: P < 0,001. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Yang et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanovacciner funksjonalisert med immunocytmembraner har store fordeler i sykdomsmålrettet terapi, og bivirkningene minimeres av egenskaper som unik tumortropisme, identifisering av spesifikke mål, langvarig sirkulasjon, forbedrede intercellulære interaksjoner og lav systemisk toksisitet. De kan også enkelt integreres med andre behandlingsmoduler for å behandle kreft i fellesskap16,20. Ønskelige egenskaper kan oppnås ved å kontrollerefysiske og kjemiske egenskaper som måling, form og elektrisk ladning. Derfor har nanovaksiner blitt viktige i et bredt spekter av applikasjoner21. Disse egenskapene er viktige avgjørende faktorer når det gjelder opptak og toksisitet, og nanovaksiner kan bare gjøres ikke-toksiske ved manipulering22. Derfor er denne protokollen for studiet av fysisk-kjemiske egenskaper, inkludert form, størrelse og ladning, viktig. TEM er et svært presist instrument som har vært mye brukt i det vitenskapelige samfunnet i mange år23. Det har blitt et viktig verktøy for å forstå egenskapene til nanostrukturerte materialer og å manipulere deres oppførsel. I tillegg har atomkraftmikroskopi (AFM) dukket opp som en kraftig teknikk for nanomekanisk karakterisering av biologiske prøver24. Det kan gi høyoppløselig 3D- og nanoskalainformasjon samtidig som det analyserer overflatedetaljer på atomnivå. I tillegg til å bestemme endringer i partikkelstørrelsesfordeling, kan DLS måle både størrelse og ladning for å gi informasjon om aggregeringstilstanden til nanopartikler i løsning25.

Det har blitt rapportert at høye zeta-potensialverdier er avgjørende for god stabilitet av kolloidale suspensjoner26. I denne studien brukte vi disse protokollene til å vurdere de fysisk-kjemiske egenskapene til nanovacciner med TEM, AFM og DLS. Videre inneholder overflaten av neseslimhinnen en stor mengde slim, som gir smøring, fuktighet og en kjemisk beskyttende barriere. Dette kan skyldes samspillet mellom slim ognoen antigener eller leveringssystemer, noe som resulterer i akkumulering og "fangst" av antigener eller leveringssystemer og deres påfølgende fjerning, noe som reduserer leveringseffektivitetenenormt. Det er velkjent at stabiliteten til nanovaksiner er avgjørende for nasal administrasjon. Derfor brukte vi Nano ZS til å bestemme en rekke stabilitetsparametere, inkludert partikkelstørrelse, polydispersitetsindekser, zetapotensialer og elektroforesemobilitet, etter behandling med 0,5% mucinprotein.

In vivo histokompatibilitets- og in vitro-cellelevedyktighetsanalysene viste at denne nye nanovaksinen ikke var toksisk i området for de testede konsentrasjonene27. Humane normale bronkialepitelceller (BEAS-2B) er standard cellelinjer som brukes til å studere menneskets luftveier28. På grunn av lavere kostnader, hurtighet og minimale etiske bekymringer, er in vitro toksisitetsvurdering en viktig metode. I denne studien ble levedyktighetsanalysen for in vitro-celler bestemt ved hjelp av en CCK8-analyse. I tillegg utføres in vivo toksisitetsvurdering vanligvis i dyremodeller som mus og rotter. Histopatologisk undersøkelse utføres ofte på vev utsatt for nanopartikler, som hjerte, øye, hjerne, lever, nyre, lunge og milt29. Derfor brukte vi disse metodene for å vurdere toksisiteten til denne nye nanovaccinen in vitro og in vivo.

Antigenopptak og forlengelse er forutsetninger for at antigenunderkastelse skal utløse en påfølgende immunrespons30. Det er nødvendig at det cellulære opptaket av BEAS-2B og frigjøringsprofilene til den nye nanovaksinen in vivo og in vitro bestemmes. CLSM er den vanligste kommersielle implementeringen av den aktuelle teknologien, som finnes i de aller fleste bildelaboratorier og har et bredt spekter av applikasjoner. Disse instrumentene er mye brukt og relativt enkle å bruke; Imidlertid er de vanligvis ikke optimale for kvantitativ datainnsamling.

I vår protokoll ble cellulært opptak detektert av CLSM på grunn av den klare oppløsningen, optisk seksjoneringsevne og allsidighet med 3D-avbildning31. I tillegg ble IVIS brukt til å oppnå in vivo-frigjøringsprofilene til det nye nanomaterialet fordi det kan gi et avbildningskammer med utvendig lys utelukket for kvantitativ bioluminescens og fluorescensavbildning in vivo og in vitro. Derfor brukte vi i denne protokollen disse metodene for å bestemme de cellulære opptaks- og frigjøringsprofilene til nye nanovacciner in vivo og in vitro.

Det er også viktig å vurdere tumoreffekten av den nye nanovaccinen. I vår studie ble den tumorbærende modellen E.G7 brukt for å bestemme den terapeutiske og beskyttende effekten av vaksinen. EL4-celler er avledet fra T-lymfocytter av C57BL/6-mus med høygradig malignitet. E.G7-celler er avledet fra EL4-lymfomceller transfeksjonert ved elektroporering32. I vår studie induserte denne nanovaccinen beskyttende immunitet i E.G7-OVA-tumorbærende mus. Oppsummert er det nødvendig å etablere en rekke protokoller for å studere fysisk-kjemiske egenskaper, stabilitet, toksisitet, frigjøringsprofiler, cellulært opptak og antitumoreffekter av nanovacciner in vitro og in vivo. Disse protokollene vil gi nyttige resultater for den nye nasale nanovaccinen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha syntes å påvirke arbeidet rapportert i denne artikkelen.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av nr. 31670938, 32070924, 32000651 av National Natural Science Foundation Program of China, nr. 2014jcyjA0107 og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 av Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, nr. 2020XBK24 og nr. 2020XBK26 av Army Medical University Special prosjekter, og nr. 202090031021 og nr. 202090031035 av nasjonalt innovasjons- og entreprenørskapsprogram for studenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.		 tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 187
Forberedelse, egenskaper, toksisitet og effekt Evaluering av nasal selvmontert nanoemulsjonstumorvaksine <em>in vitro</em> og <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., … More

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter