Summary
Här presenteras ett protokoll som använder Leishmania major promastigotes för att bestämma bindning, cytotoxicitet och signalering inducerad av porbildande toxiner. Ett proof-of-concept med streptolysin O tillhandahålls. Andra toxiner kan också användas för att utnyttja de genetiska mutanter som finns i L. major för att definiera nya mekanismer för toxinresistens.
Abstract
Att förstå funktionen och mekanismen för porbildande toxiner (PFT) är utmanande eftersom celler motstår membranskador orsakade av PFT. Medan biofysiska tillvägagångssätt hjälper till att förstå porbildning, förlitar de sig ofta på reduktionistiska tillvägagångssätt som saknar det fullständiga komplementet av membranlipider och proteiner. Odlade mänskliga celler utgör ett alternativt system, men deras komplexitet och redundanser i reparationsmekanismer gör det svårt att identifiera specifika mekanismer. Däremot erbjuder den mänskliga protozopatogenen som är ansvarig för kutan leishmaniasis, Leishmania major, en optimal balans mellan komplexitet och fysiologisk relevans. L. major är genetiskt lätthanterlig och kan odlas till hög densitet in vitro, och eventuella effekter av störningar på infektion kan mätas i etablerade murina modeller. Dessutom syntetiserar L. major lipider som skiljer sig från deras däggdjurs motsvarigheter, vilket kan förändra membrandynamiken. Dessa förändringar i membrandynamiken kan undersökas med PFT från den bäst karakteriserade toxinfamiljen, kolesterolberoende cytolysiner (CDC). CDC binder till ergosterol i Leishmania-membranet och kan döda L. major promastigotes, vilket indikerar att L. major är ett lämpligt modellsystem för att bestämma de cellulära och molekylära mekanismerna för PFT-funktionen. Detta arbete beskriver metoder för att testa PFT-funktion i L. major promastigotes, inklusive parasitkultur, genetiska verktyg för att bedöma lipidkänslighet, membranbindande analyser och celldödsanalyser. Dessa analyser kommer att möjliggöra snabb användning av L. major som ett kraftfullt modellsystem för att förstå PFT-funktion över en rad evolutionärt olika organismer och likheter i lipidorganisation.
Introduction
Porbildande toxiner (PFT) är den största familjen av bakterietoxiner1, men mekanismerna genom vilka de perforerar och förstör celler är dåligt förstådda. Den bäst studerade familjen av porbildande toxiner är den av kolesterolberoende cytolysiner (CDC). CDC syntetiseras främst av grampositiva bakterier, inklusive orsaksmedlet för nekrotiserande fasciit, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes utsöndrar CDC-streptolysin O (SLO), som binder till steroler i plasmamembranet i värdceller som monomerer, oligomeriserar och sätter in ~ 20-30 nm porer i membranet1. Den roll som lipider spelar i denna process förblir dåligt bestämd.
Ett sätt att studera lipid-CDC-interaktioner är användningen av kemiskt definierade liposomer. Medan definierade liposomer ger information om de nödvändiga trösklarna för lipider för att upprätthålla toxinbindning och porbildning3,4, rekapitulerar de inte helt cellulära funktioner. Till exempel saknar rekonstituerade liposomer lipidasymmetrin hos däggdjursvärdar och lipidmodifieringar som svar på toxiner5. Ett alternativ till liposomer är att använda däggdjurscellinjer. Även om dessa cellinjer är mer fysiologiskt relevanta, finns det en stor grad av redundans i toxinavkännings- och resistensmekanismer2. Som en konsekvens förblir reparationsvägarna som används för att motstå CDC: er dåligt bestämda. I synnerhet är Ca2+ tillströmning den primära aktivatorn för membranreparation1. Nedströms Ca2+ tillströmning är flera vägar inkopplade, inklusive en ceramidberoende reparation 6,7 och en MEK-beroende reparationsväg6. Dessa vägar interagerar med andra proteineffektorer, inklusive det endosomala sorteringskomplex som krävs för transport (ESCRT)8 och bilagorna 6,9,10. Att dissekera dessa vägar i däggdjursceller är utmanande på grund av redundansen, vilket förvirrar datatolkningen.
Ett sätt att balansera komplexitet med enkelhet för att dissekera reparationsvägar är användningen av enklare organismer, såsom protozopatogener i släktet Leishmania. orsakar leishmaniasis hos människor och andra djur. Leishmaniasis sträcker sig från kutan leishmaniasis (självbegränsade hudskador) till den dödliga viscerala leishmaniasis (hepatosplenomegali), beroende på art och andra faktorer11. Leishmania major, orsaksmedlet för kutan leishmaniasis, överförs till människor via en sandflyvektor och används för att förstå Leishmania-funktion och infektion12. Dessutom är Leishmania sp. digenic12. De existerar som intracellulära däggdjursmakrofagparasiter som kallas amastigotes och som frisimmande, flagellerade promastigotes i sandflugan12. L. större promastigotes kan odlas i serumkompletterade medier såsom M199 till hög densitet13. Promastigotes är också genetiskt lätthanterliga; Många genknockouts finns, inklusive de som riktar sig mot lipidbiosyntesvägar13. Dessa knockouts kan utvärderas för tillväxt och skillnader i smittsamhet och lesionsutveckling via infektion av Balb / c möss13.
Förutom den relativa lättheten hos Leishmania-kulturen och utbudet av lipidbiosyntes knockouts, har parasiten ett enklare genom än däggdjur. Den bäst karakteriserade arten av Leishmania är L. major, som har många befintliga genetiska verktyg, såsom mutanter med defekt lipidmetabolism14. I synnerhet är många reparationsproteiner frånvarande. L. major har hittills inga homologer identifierade för viktiga däggdjursreparationsproteiner som annexiner. Detta möjliggör karakterisering av evolutionärt bevarade reparationsvägar utan komplexiteten hos däggdjurssystem. Reparationsvägar har dock hittills inte karakteriserats i Leishmania. Samtidigt bevaras viktiga signalvägar som är involverade i reparation, såsom MEK-vägen6, i Leishmania sp.15,16, även om homologer måste valideras. Den mitogenaktiverade proteinkinas (MAPK) -vägen är väl studerad i L. mexicana, där den bidrar till intracellulär överlevnad och termostabilitet i däggdjursceller och kontrollerar metacyklogenes16. I Leishmania sp., 10 av de 15 MAPKs har karakteriserats17. LmMAPK9 och LmMAPK13 förutspås vara de mest lika däggdjurs ERK1/2 baserat på identitet i den bevarade fosforyleringsläppsekvensen. Fosforyleringsläppsekvensen är TEY för både däggdjur ERK1/2 och LmMAPK9 och LmMAPK13. Åtta av Leishmania MAPKs har dock ett TDY-fosforyleringsmotiv15. Minst två homologer av MEK har identifierats i Leishmania sp., LmxMKK18 och MEKK-relaterat kinas (MRK1)19. Detta tyder på att insikter som identifierats i Leishmania kan översättas till däggdjurssystem. Där de inte översätts till däggdjurssystem representerar de terapeutiska mål för behandling av leishmaniasis.
För att kunna använda L. major promastigotes för att studera membranreparation och interaktioner med toxiner behövs tekniker för medelhög genomströmning. Medan högupplöst levande cellavbildning möjliggör visualisering av märkta proteiner och membran i realtid, är det låg genomströmning och kanske inte mäter cellulär överlevnad. Medelkapacitetsviabilitetsanalyser inkluderar färgupptag mätt med flödescytometri, mätning av mitokondriell aktivitet eller frisättning av cellulära proteiner som laktatdehydrogenas (LDH). I däggdjursceller mäter LDH-analyser inte kvantitativt celldöd20. Dessutom tillåter populationsbaserade analyser som LDH-frisättning eller mitokondriell aktivitet inte robust encells- eller multiparametrisk analys20. Däremot möjliggör flödescytometribaserade analyser multiparametrisk encellsanalys20. Emellertid, dessa analyser har inte tillämpats för att förstå toxin biologi eller svar på toxiner i L. större promastigotes.
I denna studie används SLO som ett verktyg för att förstå plasmamembranstörningen av sfingolipid null-mutanten av L. major i två olika buffertar - M199-mediet som rutinmässigt används för att odla L. major promastigotes och den enklare Tyrodes buffert . En cytometrianalys med medelhög genomströmning beskrivs och används för att generera toxindos-responskurvor. Data från flödescytometriska analysen modelleras till en logistisk kurva för att bestämma LC50-värdena . Med denna information kan en sublytisk dos av SLO bestämmas så att MAPK-antikroppar kan valideras med western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla lämpliga riktlinjer och standardmetoder för mikrobiologisk, säkerhets- och cellodling användes för användning och hantering av RG2-patogenen Leishmania major och rekombinant DNA. Alla experiment med levande L. major utfördes i ett biosäkerhetsskåp i ett BSL-2-certifierat laboratorium. Arbetet övervakades av Texas Tech University Institutional Biosafety Committee.
OBS: Ur ett säkerhetsperspektiv är levande L. större promastigotes riskgrupp 2-patogener. Hantera med lämplig inneslutning, försiktighetsåtgärder och tillsyn från Institutional Biosafety Committee (IBC). Hantera giftiga ämnen och kemikalier i enlighet med institutionella förfaranden för giftiga ämnen. Om rekombinanta toxiner används kan IBC-godkännande och tillsyn behövas för rekombinant DNA-arbete.
1. Odling och beredning av L. större promastigotes
- Erhålla, eller tillverka och validera, L. större genetiska mutanter som tidigare beskrivits med antingen homolog rekombination eller CRISPR-baserade metoder13,21. Använd knockouts kompletterat med genen som läggs tillbaka på en plasmid för att säkerställa specificitet av knockouten.
- Odla vilda typ L. major och spt2- promastigotes vid 27 °C i komplett M199-medium. Odla de episomala addbackcellerna (spt2-/+SPT2) i komplett M199 plus 10 μg/ml G418 (se tabell 1 och materialtabell).
OBS: Hela experimentinstallationen med experiment med L. större celler måste utföras i ett BSL2-certifierat biosäkerhetsskåp. - Odla promastigotes i komplett M199 medium22 tills de når loggfas (2-8 x 106 celler / ml), som bestäms av L. större tillväxtkurvanalyser gjorda tidigare23. Planera 1 x 10 5 celler för varje brunn för cytotoxicitet, plus 5 x 105 celler för färgningskontroll. För western blot, planera 2 x 107 celler per brunn.
OBS: Utför cytotoxicitetsanalys med två tekniska replikat. - För att verifiera rätt celltäthet, blanda en alikvot (10-40 μL) promastigotes med en lika stor volym fixativ (3,7% paraformaldehyd i 1x PBS). Ladda 10 μl av det fasta provet på varje sida av hemacytometern.
VARNING: Formaldehyd är en giftig kemikalie. Hantera i enlighet med institutionella policyer för farliga kemikalier. - Utför cellräkning med ett mikroskop med 20x förstoring. Räkna alla celler i de 25 små rutorna i mitten av hemacytometern. Upprepa för rutorna på båda sidor och medelvärdet av räkningarna.
OBS: Om variationen mellan räkningarna är >10, räkna om och medelvärde. Om medelantalet är <10 eller >100, ändra utspädningen och omräkningen och beräkna sedan odlingstätheten med följande formel:
(Eq 1)
Till exempel, om det i genomsnitt finns 250 Leishmania i 25 rutor, är odlingstätheten 5 x 106 celler / ml. - Efter räkning, överför 5 x 106 celler till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 1 500 x g i 8 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Kassera supernatanten med en 10 ml pipett och virvla kort cellpelleten. Tillsätt 5 ml 1x PBS till samma rör och tvätta cellerna genom att försiktigt invertera 3-6x. Centrifugera vid 1 500 x g i 8 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Kassera supernatanten med en 10 ml pipett och återsuspendera 5 x 10 6-cellpelleten i 5 ml medium (t.ex. M199 eller 1x Tyrodes buffert) som används för experimenten med en 5 ml pipett för att ge en slutlig koncentration på 1 x 106 celler/ml.
(Eq 1)2. Cytotoxicitetsanalys
- Experimentell förberedelse
- Rena toxinet som tidigare beskrivits24, eller köp toxinet från en leverantör. Alikvot i alikvoter för engångsbruk och lagra −80 °C i upp till 1 år. Undvik flera frys-tina cykler.
- Bestäm den hemolytiska aktiviteten för varje toxin med hjälp av humana röda blodkroppar (se materialförteckning)24.
OBS: Hemolytisk aktivitet används eftersom den styr för skillnader i aktivitet på grund av rening, mutationer etc. Artvalet av erytrocyter kan förändra den hemolytiska aktiviteten (t.ex. intermedilysin kräver humana röda blodkroppar). - Planera två tekniska replikat för varje tillstånd, sju utspädningar för dos-responskurvan och en kontroll utan toxin.
OBS: Med promastipoter av vildtyp (WT), spt2 och spt2-/+SPT2 kan två behandlingar testas i en V-botten 96-brunnsplatta. Till exempel kan känslighet för media jämföras (figur 1). I stället för en V-bottenplatta kan 1,2 ml mikrotiterrör (se materialförteckning) användas. På grund av förvärvstiderna på cytometern rekommenderas inte att köra mer än en platta åt gången. - Bestäm vilken analysbuffert som ska användas baserat på de testförhållanden som behövs och syftet med experimentet.
OBS: I det här exemplet jämförs två analysbuffertar: M199 och Tyrodes buffert kompletterad med viabilitetsfärgämnet propidiumjodid (PI). Kolesterol i serum kommer att störa CDC-aktivitet24. - Beräkna mängden toxin som behövs baserat på förhållandena och antalet behandlade genotyper. Se till att 50% specifik lys inträffar halvvägs ner i utspädningskurvan.
OBS: För CDC: er kommer en tvåfaldig seriell utspädning att ge ett bra intervall för senare logistisk modellering. För spt2-promastigotes är 4 000 HU/ml SLO den rekommenderade startutspädningen. Om inaktiva toxiner används kan i stället en massa som motsvarar den högsta dosen användas. - Planera en slutlig volym på 200 μL per brunn och lägg till en liten volym extra (50-100 μL) för att ta hänsyn till pipettfel.
OBS: Med tre genotyper, var och en gjord i två exemplar, kommer det att finnas sex prover för den seriella utspädningen. - Bestäm den totala mängden toxin som behövs med följande formel:
(Eq 2)
där ActivityMax är den högsta koncentration som används (HU/ml), TotalFinalVolume är den totala volymen (för sex prover, 200 x 6 + 100 = 1 300 μL); ActivityStock är toxinstammens aktivitet (HU/ml); och VolStockToxin är den volym toxinlager som behövs. - Förbered tillräcklig analysbuffert som behövs för experimentet. Komplettera basalmediet med ett viabilitetsfärgämne och eventuell Ca 2+ eller EGTA som behövs för att kontrollera Ca2+ nivåer. Vortex att blanda.
OBS: För varje 10 ml Tyrodes buffert, tillsätt till exempel 50 μL 2 mg/ml PI och 200 μL 100 mMCaCl2, vilket ger slutliga koncentrationer på 10 μg/ml respektive 2 mM. - Se till att viabilitetsfärgen PI inte står i konflikt med andra sonder som används, till exempel för fluorescerande bindningsanalyser med Cy5 eller AlexaFluor647-konjugerade toxiner20,25.
- Planera toxinutspädningar för att göra en 2x lösning av toxin. Tillsätt analysbuffert till 1,5 ml centrifugrör och kyla på is. Tillsätt endast toxinet omedelbart innan testet påbörjas.
OBS: I detta exempel skulle 1,3 ml analysbuffert tillsättas för den övre utspädningen och 650 μL tillsättas för seriella utspädningar för att bereda 2x toxinlösningen.
- Experiment
- Reservera 0,5 ml bearbetade promastigotes från steg 1.8 i ett separat rör som "Unstained control".
OBS: Detta prov kommer att användas för att ställa in gating på flödescytometern. - Tillsätt 2 mg/ml PI till en slutlig koncentration på 10 μg/ml till de återstående promastiroterna. Vortex i 3 s.
OBS: Efter tillsats av PI till de bearbetade promastiroterna kan dessa celler endast användas under en tidsperiod av 2,5 h. Efter 2,5 h börjar cellerna dö och resultaten blir felaktiga. - Tillsätt 1 x 105 (i 100 μl/brunn) bearbetade promastigotes till varje brunn i en V-botten 96-brunnsplatta eller 1,2 ml mikrotiterrör (figur 1). Placera plattan eller rörstället på is i cirka 45° vinkel från visning. Utför arbetet i ett biosäkerhetsskåp vid hantering av Leishmania promastigotes.
- Tillsätt 100 μL analysbuffert med PI till varje kontroll utan toxin (sista raden). Kontrollera att kontrollen har lagts till korrekt genom att visuellt identifiera rör med en total volym på 200 μl som ser mörkare ut i färgen.
- Ta bort toxinalikvoterna från −80 °C, tina på is och poola efter behov. Tillsätt den volym toxin som beräknats i steg 2.1.5 till den högsta utspädningen (beredd i steg 2.1.10). Späd sedan toxinet seriellt (Figur 1). Pipettera upp och ner minst 8x för att säkerställa blandning.
OBS: Utför på is eftersom CDC: er snabbt inaktiveras vid rumstemperatur. - Börja från den lägsta toxinkoncentrationen, tillsätt snabbt 100 μl toxin till rätt rad (figur 1 och figur 2) och fortsätt tills allt toxin har tillsatts cellerna.
- Försegla plattan med tätningstejp. Inkubera vid 37 °C i 30 minuter. Efter inkubationsperioden, packa och transportera plattan till flödescytometern.
- Reservera 0,5 ml bearbetade promastigotes från steg 1.8 i ett separat rör som "Unstained control".
- Insamling av uppgifter
- Ställ in flödescytometern (se materialförteckningen) och anskaffningsprogramvaran enligt tillverkarens instruktioner och per anläggningspolicy. Utför inte flödescytometriproceduren utan föregående träning på cytometern.
I det här exemplet användes en 4-laser Attune NxT. PI samlades in på YL-1-kanalen (upphetsad av en 561 nm laser, passerade genom en 577 LP, reflekterades från 600 DLP och filtrerades genom 585/16 bandpass), även om det breda spektrumet av PI tillåter insamling på andra kanaler. - Använd det ostoppade L. major-promastigoteprovet och ställ in grindarna för spridning framåt och på sidan och de ursprungliga fluorescerande parametrarna baserat på de valda färgämnena.
- Inkludera en extra parameter om så önskas för punktdiagram för att kontrollera autofluorescens (t.ex. "ingen fläck") (figur 3).
I det här exemplet användes BL-1-kanalen (upphetsad av en 488 nm-laser, passerade genom 495 DLP och 503 LP, reflekterad från 555 DLP och filtrerad via 530/30 bandpass). - Använd enstaka färgade kontroller, ställ in grindarna för viabilitetsfärgen (PI i denna studie) och eventuella fluorescerande märkta toxiner. Övervaka spridning framåt kontra tid för mikroträskor.
OBS: PI kommer att svagt fläcka alla celler ovanför ofärgade kontroller. Döda celler kommer att vara lätt separerbara, med övergående permeabiliserade celler mellan populationer. - Skaffa > 10 000 gated events för varje prov på cytometern.
OBS: Det rekommenderas att läsa från mest känsliga till minst känsliga, men förvärvsordningen kan vändas för att bestämma eventuell inverkan av läsordningen på provresultaten. - Spara data och exportera efter behov för analys.
- Ställ in flödescytometern (se materialförteckningen) och anskaffningsprogramvaran enligt tillverkarens instruktioner och per anläggningspolicy. Utför inte flödescytometriproceduren utan föregående träning på cytometern.
- Analys av data
OBS: I den här studien kan plugin-programmet Excel med Problemlösaren (se Tabell över material) användes för dataanalys (se Kompletterande fil 1).- Gate total, encelliga L. major promastigotes genom att gating på framåt- och sidospridning och tid efter behov (figur 3). Använd höjd eller yta som rekommenderas för flödescytometern.
OBS: För flödescytometern som används här är höjd den rekommenderade parametern istället för area. - Identifiera och grinda döda celler som "PI high". Grind mellanliggande celler som "PI low". PI-höga celler är döda celler, medan PI-låga celler är övergående permeabiliserade26.
OBS: PI-höga celler visar vanligtvis ett 2-3 loggskift från negativa celler. - Exportera data till Excel. Hämta provnamnet/ID:t och %PI high för att fastställa dödandet.
OBS: Om fluorescerande toxiner användes kommer medianfluorescerande intensitet (MFI) för levande, övergående permeabiliserade och negativa populationer att behövas. %PI low kan exporteras för övergående permeabilisering. - Bestäm den genomsnittliga %PI high för varje tillstånd mellan de två tekniska replikaten.
OBS: Om genomsnittlig MFI behövs för fluorescerande toxiner, beräkna detta också. - Beräkna %Specific Lysis from the %PI high med följande formel24,25:
(Eq 3)
där PIhighxpt är %PI hög för det experimentella tillståndet; och PIhighctl är% PI hög för no-toxin kontroll. - Plot %Specifik lys mot toxinkoncentration för dos-responskurvan (figur 4).
- Organisera dos-responskurvan i Excel för logistisk modellering. Inkludera toxinkoncentration och genomsnittlig% specifik lys tillsammans med experimentella detaljer och / eller rå% PI höga beräkningar (tabell 2).
- Kontrollera att tillägget Problemlösaren är aktiverat.
Om du vill aktivera Problemlösaren i skrivbordsversionen av Excel går du till Alternativ för > för fil > tillägg och markerar rutan Problemlösaren . Starta om Excel. - Märk ytterligare fyra kolumner som "modellerade", "rester", "parametrar" och "parametervärden". Kontrollera att de första kolumnerna motsvarar experimentparametrarna, toxinkoncentrationen och %Specifik lys (tabell 2).
- Lägg till följande parametrar i kolumnen "parametrar": L, k, c, SUM och LC50. Initiera parametrarna L, k och c genom att ange följande värden i kolumnen "parametervärden": 100, 0,05, 1 000.
- I kolumnen "modellerad" skapar du logistikmodellen med följande formel:
(Eq 4)
Ange L, k och c till cellerna som innehåller dessa parametrar i kolumnen "parametervärden".
Ställ in x på cellen som innehåller toxinkoncentrationen.
OBS: För tabell 2, cell G4, är formeln följande: = $J$ 3 / (1 + EXP (-$J $ 4 * (D4-$J $ 5))) - Använd den här ekvationen på alla %Specific Lysis-värden utom no-toxin-kontrollen.
- I kolumnen "rester" beräknar du kvadraten av skillnaden mellan det modellerade numret och den faktiska specifika lysen med hjälp av följande ekvation:
(Ekv. 5)
där y är den experimentella %specifika lysen; och m är motsvarande värde i kolumnen "modellerad" beräknad i steg 2.4.10-2.4.11. - I kolumnen "parametervärden" bredvid "SUM" summerar du alla värden i kolumnen residuals.
- I kolumnen "parametervärden" bredvid "LC50" initierar du ekvationen för att beräkna LC50 från de bestämda värdena. Detta löser Eq 4 för x när m = 50.
(Eq 6)
För tabell 2 är Excel-formeln följande: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4 - Öppna Problemlösaren på fliken Data. Markera det angivna målet som ska vara den cell som innehåller summan av de beräknade resterna. Ställ in den på Min.
- Ändra variabelcellerna för parametervärdena för L, k och c.
Problemlösaren kan bete sig bättre om "Gör obegränsade variabler icke-negativa" lämnas markerat. - För negativa k-värden, modifiera Eq 4 och Eq 6 genom att räkna ut −1 från k för att ändra k till positiv. Använd GRG Nonlinear lösningsmetod. Klicka på Lös.
- Kontrollera kurvan och att LC50 beräknas automatiskt med hjälp av Eq 6 (tabell 2). Verifiera passformen genom att grafiskt plotta både % Specifik lys och modellering mot toxinkoncentration.
OBS: Det kan också kontrolleras genom att beräkna R2 för kurvan.
- Gate total, encelliga L. major promastigotes genom att gating på framåt- och sidospridning och tid efter behov (figur 3). Använd höjd eller yta som rekommenderas för flödescytometern.
(Eq 2)
(Eq 3)
(Eq 4)
(Ekv. 5)
(Eq 6)3. Proteinanalys av toxinutmanade L. major promastigotes
- Bered L. major promastigotes enligt beskrivningen i avsnitt 1.
- Återsuspendera 2 x 107 WT, spt2- och spt2-/+SPT2 L. större promastigotes i 2 ml av önskad analysbuffert med en 5 ml pipett (t.ex. serumfri M199). Tillsätt toxin till en slutlig sublytisk koncentration och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
OBS: Till exempel är en sublytisk dos av SLO för spt2-promastigotes 500 HU / ml. - Inkludera andra genotyper och kontroller utan toxin.
- Centrifugera promastigotes vid 1 500 x g i 10 minuter för att pelletera cellerna. Kassera supernatanten med en pipett på 10 ml. Kör det slutna röret som innehåller cellpelleten snabbt tre gånger över en oregelbunden yta, såsom grillen i biosäkerhetsskåpet, för att bryta upp cellpelleten.
OBS: Cellpelleten är nästan osynlig för blotta ögat. - Återställ 1x SDS-PAGE-provbuffert med 2-merkaptoetanol omedelbart före användning och värm till 95 °C i 10 minuter innan den tillsätts till cellpelleten. Återsuspendera cellpelleten i varm 1x SDS-PAGE-provbuffert och blanda väl genom att pipettera upp och ner. Värm den återsuspenderade cellpelleten i 1x provbuffert vid 95 °C i 10 minuter.
OBS: Efter solubilisering i provbuffert, förvara proverna på lång sikt vid −20 °C om så krävs. - Förbered lösningsgelén. Avgasa alla komponenter utom ammoniumpersulfat (APS) och TEMED i 15 min.
- Tillsätt APS och TEMED omedelbart innan du gjuter gelén. Överlägg försiktigt den upplösande gelén med vatten. Låt lösningsgelen polymeriseras, ~30-45 min.
- Dekantera vattnet och förbered staplingsgelen. Tillsätt staplingsgelen, var noga med att undvika bubblor. Sätt i en kam med relevant antal brunnar och låt polymerisera i 5 min. Övervaka polymerisationen med eventuell kvarvarande staplingsgel.
- Montera gelén för att köra SDS-PAGE och tillsätt reservoarbuffert till kammaren.
- Ladda 10 μl av varje prov per brunn, eller 8 μl av proteinstegen. Kör vid 180 V tills proverna kommer in i upplösningsgelen och minska sedan spänningen till ~ 160 V och kör tills färgfronten är ~ 0,5 cm från plattans kant.
OBS: Den tid det tar för proverna att nå botten kan variera mellan 1-1,5 timmar. Tiden kan förlängas genom att minska spänningen. Sänk aldrig spänningen till noll. Högre spänningar kan öka gelén "leende" och spricka plattorna. - Överför gelén antingen till Coomassie-fläck (för proteinfärgning) eller till 1x överföringsbuffert (för western blotting). För Coomassie-färgning, fläcka över natten och sedan avstå, avbilda och torka.
- För western blot, förbered överföringssystemet enligt tillverkarens instruktioner.
- För en våt överföring, använd kall 1x överföringsbuffert och förvåta dynor, filterpapper och nitrocellulosa. För Bio-rad Protean III-systemet (se materialtabell) som används här kan filterpapperet skäras till 10 cm x 7,5 cm. Skär nitrocellulosan till 9 cm x 6,75 cm.
OBS: Nitrocellulosa är mycket brandfarligt. Undvik öppna lågor och andra potentiella antändningskällor. - Lägg ut överföringskassetten med dynor, filterpapper och nitrocellulosa. Rulla ut luftbubblor. Tillsätt gelén försiktigt.
- Tillsätt filterpapperet och rulla ut luftbubblor. Lägg till dynan, stäng kassetten och sätt in i hållaren i rätt riktning (se till att nitrocellulosa vetter mot den röda terminalen). Lägg till en omrörningsstång och ett ispaket på sidan och fyll på behållaren med kall 1x överföringsbuffert. Överför vid 110 V i 90 min.
OBS: Värmen som genereras under överföringen kan påverka överföringen negativt. För att säkerställa en bra överföring, använd alltid kall 1x överföringsbuffert. - Ta bort nitrocellulosan och fläcka med Ponceau-lösning i ~ 5 min. Skölj med ultrarent vatten. Markera proteinstegen med blyerts och trimma fläcken efter behov. Fläcka fläcken med hjälp av kvarvarande överföringsbuffert.
OBS: Ponceau kan återanvändas många gånger. - Blockera nitrocellulosan i 25 ml 5% BSA i 1x TBST vid 4 °C, med skakning, över natten. Kassera sedan blockeringslösningen och tillsätt primär antikropp (1:1 000) i 1% BSA i 1x TBST. Skaka vid 4 °C över natten.
OBS: Den primära antikroppen kan sparas vid −20 °C och återanvändas flera gånger. - Tvätta nitrocellulosan 3x i 10 min vardera i 1x TBST med skakning. Kassera tvätten och tillsätt 10 ml HRP-konjugerad sekundär antikropp (1:10 000) i 1% BSA i 1x TBST. Skaka vid rumstemperatur i 1 timme. Tvätta nitrocellulosan 3x i 10 min vardera i 1x TBST med skakning.
- Bered ECL-reagens omedelbart före avbildning av nitrocellulosa. Omedelbart före avbildning, dekantera TBST och tillsätt ECL-reagenset till nitrocellulosa. Skaka i 1 min. Föreställ dig gelén.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ökad promastigotekänslighet för SLO i Tyrodes buffert jämfört med M199
SLO-känsligheten hos L. major promastigotes jämfördes mellan olika analysbuffertar. Wild-type, spt2- och spt2-/+SPT2 promastigotes utmanades med SLO i serumfri M199 eller Tyrodes buffert kompletterad med 2 mM CaCl2i 30 min före analys på en flödescytometer. Lämpliga parasiter för analys var enstaka celler som identifierades med spridningsprofiler framåt/sida (figur 3A,B). Data samlades in med hjälp av kanalerna BL1 (488 excitation, 530/30 emissionsfilter) som autofluorescenskontroll och YL1 (561 nm excitation, 585/16 emissionsfilter) för PI. BL1 användes för att identifiera potentiella autofluorescens- eller kompensationsproblem (x-axeln i figur 3C-E). Användningen av 561 nm-linjen minskade genomblödningen från PI till BL1-kanalen. Fraktionen av döda celler bestämdes för varje tillstånd, och% Specifik lys bestämdes. Wildtype- och spt2-/+SPT2-promastigotes var resistenta mot SLO i serumfri M199 men hade mindre (<20%) specifik lys i Tyrodes buffert (figur 4A). De sfingolipid-bristfälliga spt2-promastigotesna var känsliga för SLO i både serumfri M199 och Tyrodes buffert (figur 4). För att kvantifiera ökningen av känsligheten från Tyrodes buffert jämfört med serumfri M199 anpassades dos-responskurvan till en logistisk modell och LC50 beräknades för varje tillstånd (figur 4B). Spt2- promastigoterna var ungefär åtta gånger känsligare för SLO i Tyrodes buffert än i M199 (figur 4B). Dessa data visar att toxinkänsligheten kan variera beroende på vilken buffert som används. Kurvpassning gör det möjligt att jämföra förändringar i hela dos-responskurvan. Således möjliggör flödescytometri en medium-throughput-analys för att jämföra toxinkänsligheten hos L. major promastigotes under olika förhållanden.
Aktivering av MEK-vägen vid L. dur oberoende av toxinutmaning
Encellsdata om cellulär överlevnad från cytotoxicitetsanalysen möjliggör nedströmsanalyser vid sublytiska toxindoser. Till exempel kan L. major analyseras för biokemiska vägar genom western blotting efter toxinutmaning. MEK-vägen aktiveras under membranreparation i däggdjursceller6. Det är okänt om denna väg aktiveras efter SLO-utmaning i L. major eller om de kommersiellt tillgängliga antikropparna känner igen några L. major MAPK-homologer. WT-, spt2- och spt2-/+SPT2-promastigotes utmanades med en sublytisk (500 HU/ml) dos SLO och analyserades med western blotting. Ett ~120 kDa-band observerades för fosfo-MEK i L. major promastigotes (figur 5). För total MEK observerades band vid ~ 120 kDa och ~ 55 kDa (figur 5), som överensstämmer med storlekarna på MRK1 respektive LmxMKK. Fosfo-ERK detekterade liknande band, medan ERK-antikroppsfärgningen inte var robust i denna analys (figur 5). Lipophosphoglycan (LPG) och tubulin blottades också som lastkontroller. Dessa data avslöjar vikten av att validera antikroppar för användning i L. major.
Figur 1: 96-brunnsplattor möjliggör en ordnad inställning för cytotoxicitetsanalyser. Cytotoxicitetsanalysen är uppdelad i sex kolumner med två tekniska replikat vardera. Med kontroller tillåter detta att två villkor testas per platta. I detta exempel jämförs L.major promastigotes resuspenderade i serumfri M199 med dem i Tyrodes buffert. Genotyperna följer ordningen vildtyp (WT) (grön), spt2- (röd) och spt2-/+SPT2 (blå). Toxinet (SLO) tillsätts så att koncentrationen går från den högsta koncentrationen högst upp på plattan till botten och lämnar den sista raden som en kontroll utan toxin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Konsekvent inställning möjliggör reproducerbara cytotoxicitetsresultat. Efter beräkning av mängden toxin som behövs framställs volymen analysbuffert som är nödvändig för en 2x-lösning. Viabilitetsfärgen (PI) och CaCl2 tillsätts efter behov och bufferten dispenseras i 1,5 ml rör. Efter tvättning och återupphängning i analysbuffert dispenseras lika många L. större promastigotes i varje brunn på 96-brunnsplattan. Toxinet tillsätts till analysbufferten och späds seriellt från den högsta toxindosen (1: a röret) ner till den lägsta dosen (7: e röret) omedelbart före tillsats till cellerna. Toxinet tillsätts till celler i 96-brunnsplattan som börjar från botten av plattan vid den lägsta toxindosen (7: e raden) och arbetar upp till den högsta dosen (1: a raden). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Gatingstrategin skiljer levande och döda populationer av celler. L. större promastigotes färgade med PI och utmanade med SLO analyserades med flödescytometri. (A,B) Gating-strategin identifierar enstaka celler från total L. major baserat på framåt- och sidospridning. (C–E) PI-färgning utvärderas nästa och celler gated till PI-höga, PI-låga och PI-negativa populationer. Representativa data för (C) inget toxin, (D) 1 000 HU/ml och (E) 4 000 HU/ml SLO visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tyrodes buffert ökar känsligheten hos L. major promastigotes jämfört med M199. Wildtype (WT), spt2-, och spt2-/+SPT2 L. större promastigotes i serumfri M199 eller Tyrodes buffert kompletterad med 2 mM CaCl2 utmanadesmed SLO vid de angivna koncentrationerna vid 37 °C i 30 min, och PI-upptag analyserades med flödescytometri. %Specific Lysis beräknades. En logistisk modell konstruerades och LC50 beräknades för spt2- mutanterna. Grafer visar (A) medelvärde ± SEM eller (B) enskilda experiment från tre oberoende experiment. En Students oparade t-test med Welchs korrigering användes för LC50-värdena. ** p < 0,01 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fosfo-ERK och fosfo-MEK1/2 detekterar L. viktiga proteiner oberoende av sfingolipider eller toxinutmaning. Wildtype (WT), spt2-, och spt2-/+SPT2 L. större promastigotes utmanades i 30 min vid 37 °C med eller utan 500 HU/ml SLO i serumfri M199 kompletterad med 2 mM CaCl2. Celllysaterna löstes av SDS-PAGE, överfördes till nitrocellulosa och undersöktes för fosfo-MEK (pMEK), total MEK, fosfo-ERK (pERK), total ERK, lipofosfoglykan (LPG) eller tubulin, följt av HRP-konjugerade sekundära antikroppar och ECL. En representativ fläck från två oberoende experiment visas i varje enskilt fall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Buffert- och mediesammansättningar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Exempellayout för Excel-beräkningar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande fil 1: Excel-kalkylblad med formler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskrevs metoder för att studera PFT: s molekylära mekanismer och funktioner, med hjälp av den mänskliga patogenen Leishmania major som modellsystem. En cytometribaserad cytotoxicitetsanalys med medelhög genomströmning för att mäta encellsviabilitet utvecklades. Livskraften är kvantitativ på populationsnivå eftersom LC50-värden kan beräknas från dos-responskurvan med hjälp av logistisk modellering. Som ett principbevis användes en flödescytometrisk analys för att illustrera att valet av media kan förändra vildtyp och sfingolipidbrist L.major känslighet för SLO och för att bestämma den sublytiska toxindosen i varje medium. Som ett principbevis i nedströmsanalyser testades fosfo-MAPC- och fosfo-ERK-antikroppar i L. major promastigotes under toxinutmaning. Sammantaget är L. major promastigotes ett patogent relevant och genetiskt lätthanterligt modellsystem som kan användas för att bättre förstå mekanismerna och funktionerna för toxinmedierad skada på celler.
Flödescytometrianalysen erbjuder hög flexibilitet. Andra viabilitetsfärger kan ersättas med PI om så önskas. I däggdjursceller observerades inga skillnader i rapporteringsförmågan för ett intervall av viabilitetsfärgämnen20. Valet av toxin, L. major genotyp, tillsats av eventuella behandlingar, och valet av analysbuffert kan varieras efter behov. Toxinbindning kan bedömas antingen parallellt med eller istället för cytotoxicitet om det använda toxinet är konjugerat med en fluorofor, såsom Cy5. För L. större genotyper är det viktigt att inkludera kompletterade stammar för att säkerställa att fenotypen beror på att genen slås ut. I denna proof-of-concept-studie gav basmediet som användes för odling av L. major, M199, mer skydd för L. major promastigotes än Tyrodes buffert. Tyrods buffert ökade känsligheten hos spt2-mutanten av L. major promastigotes jämfört med användningen av serumfri M199, ett basalmedium som används för att sprida L. major promastigotes in vitro. Detta tyder på att det finns en eller flera cytoprotektiva komponenter i M199. Två potentiella cytoprotektiva medel är glycin eller alanin, som är cytoprotektiva i andra däggdjurssystem27,28. Sammantaget ger flödescytometricytotoxicitetsanalysen en flexibel plattform för att analysera olika toxiner, tillstånd och parasitgenotyper.
Kopplingen av flödescytometrisk analys med logistisk modellering ger förbättrad information om cellkänslighet för PFT. Först användes hemolytiska enheter istället för massa för aktiva toxiner. Detta möjliggjorde normalisering av data över olika toxinpreparat och konsekventa analysresultat och möjliggjorde en direkt jämförelse av dödande mellan toxiner och mål. Medan specifik lys användes för att analysera toxinets bidrag till dödlighet, ger de kontroller som behövs för varje tillstånd information om baslinjedödande. Om ett medel är specifikt giftigt kommer det att visas i dessa kontroller. Specifik lys över flera koncentrationer gör det möjligt att skapa en dos-responskurva. Dos-responskurvor är viktiga för att tolka toxinaktiviteten. I många fall, laboratorier kommer att rapportera skillnader i toxin mottaglighet vid en enda koncentration. Beroende på vilken del av dos-responskurvan som valts kan denna skillnad förvrängas för att ge önskat intryck av känslighet eller resistens. Analys av hela dos-responskurvorna kan göras genom logistisk modellering. Logistisk modellering är enkel med hjälp av lättillgänglig programvara och ger ytterligare information om LC50, kurvans branthet (k) och maximal lys (L). Skillnader i alla dessa parametrar kan användas för att bestämma statistisk signifikans mellan kurvorna. Förändringar av maximal lys kan vara användbara för delvis aktiva toxiner, inaktiva toxiner eller resistenta celltyper. Sammantaget tillhandahölls kvantitativa metoder för att mäta förändringar i cytotoxicitet.
Trots fördelarna med att använda en kvantitativ, medium-throughput flöde cytometrisk cytotoxicitetsanalys, finns det försiktighetsåtgärder att tänka på när man använder denna analys. I synnerhet begränsar bristen på serum inkubationstiderna till 1-2 timmar. Vid senare tidpunkter komplicerar högre bakgrundsdöd tolkningen av resultat. Avlägsnandet av serum är nödvändigt för CDC eftersom kolesterolet i serumet hämmar CDC24. Andra serumfaktorer kan också förändra cellkänsligheten för toxiner. En annan utmaning är koncentrationen av kalcium som används i analysen. Medan membranreparationsanalyser vanligtvis använder 2 mM Ca 2+ för att efterlikna extracellulär Ca2+, kan högkalciumbuffertar riskera kalciumavsättning i flödescytometern, vilket kan orsaka cellklumpning och / eller täppa till mikrofluidiken. Rengöring av cytometern med 2 mM EDTA före rengöring med Hellmanex III (se materialförteckning) och/eller blekmedel minskar uppbyggnaden av Ca2+. En sista varning är den logistiska modelleringen. Solver-plugin kommer ibland att "fastna" i ett lokalt minimivärde som inte ger en optimal passform. I dessa fall kan modellen förbättras om du ändrar parametrarna manuellt och kör Problemlösaren igen. När hela logistikkurvan inte tillhandahålls kan problemlösaren också extrapolera stora värden för L. Det är viktigt att samla in tillräckligt med datapunkter för att generera en komplett logistisk kurva. Om dos-responskurvan inte enkelt kan modelleras med en logistisk kurva kan LC 50-värdena lämnas odefinierade (t.ex. > 4000 HU/ml) eller så kan en annan kurva anpassas till data.
När den sublytiska dosen av SLO hade bestämts kunde cellulära svar på SLO testas. Ett principbevis tillhandahölls genom att testa antikroppar i MEK-ERK-vägen i L. major eftersom MEK-aktivering kontrollerar ~ 70% av reparationen mot SLO i däggdjursceller6. Fosfo-MEK-antikroppen detekterade ett ~ 120 kDa-band som överensstämmer med MRK1. Robust fosforylering av LmxMKK-homologen, förväntad vid 55 kDa, upptäcktes inte. MEK-antikroppen detekterade emellertid band som överensstämmer med både MRK1 och LmxMKK. Fosfo-ERK-antikroppen detekterade också band vid ~ 120 kDa och 55 kDa. 55 kDa-bandet överensstämmer med storleken på MAPK5. ERK-antikroppen var inte robust i denna analys. Masspektrometri eller andra metoder skulle behövas för att bekräfta identiteten hos dessa proteiner. Fosforyleringen av leishmaniala homologer av MEK1/2 och ERK1/2 detekterades oberoende av toxinutmaningen. Sammantaget användes en sublytisk dos toxin bestämd av flödescytometri för att detektera kinaser i en nedströms analys, som western blotting.
Det finns också förbehåll med de västra fläckanalyserna. Noterbart är att de flesta kommersiella antikroppar inte höjs specifikt mot leishmanialproteiner. Istället måste antikroppar riktade mot homologer i andra organismer valideras och titreras först. Provberedning kan ha en inverkan på det slutliga fläckresultatet. Reduktionsmedlet i provbufferten, 2-merkaptoetanol, måste tillsättas omedelbart innan SDS-provbufferten tillsätts till cellpelleten. Medan återsuspenderade cellpellets kan lagras vid −20 ° C, överlever de inte många frys- / upptiningscykler. Primära antikroppar som riktar sig mot homologa proteiner som MAPK i Leishmania måste inkuberas med fläckarna över natten för band av högre kvalitet på västerländska blottar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av National Institute Of Allergy And Infectious Diseases of the National Institutes of Health grant R21AI156225 till PAK och KZ (co-I) och R01AI139198 till KZ (co-I). CH vill uppmärksamma institutionen för biologiska vetenskaper för den lärarassistenttjänst som tillhandahållits under studietiden.
Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analys eller tolkning av data; i skrivandet av manuskriptet; inte heller i beslutet att offentliggöra resultaten. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärernas officiella åsikter. Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i Keyel- och Zhang-laboratorierna för deras kritiska granskning av manuskriptet. Författarna tackar College of Arts and Sciences Microscopy för användningen av anläggningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2-/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
- Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
- Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
- Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
- Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
- Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
- Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
- Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
- Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
- Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
- Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
- Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
- Wiese, M. Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
- Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).
- Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G.
- Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
- Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
- Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602 (2019).
- Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).
- Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
- Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
- Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
- Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326 (2019).
