Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udtrykke og rense rekombinante Drosophila caspases Dronc og Drice og deres anvendelse i in vitro spaltningsassays.
Abstract
Caspaser er meget specifikke celledødsproteaser, der er involveret i apoptotiske og ikke-apoptotiske processer. Mens caspases rolle under apoptose har været meget veldefineret, og mange apoptotiske proteolytiske substrater af caspaser er blevet identificeret og karakteriseret, er caspasernes rolle for ikke-apoptotiske processer ikke godt forstået. Især er der hidtil kun identificeret få ikke-apoptotiske substrater af caspaser. Her, for at lette identifikationen og karakteriseringen af potentielle caspasesubstrater, beskrives en protokol, der tillader test af kandidatsubstrater i caspase-spaltningsassays in vitro . Denne protokol omfatter produktion og oprensning af rekombinante caspaseproteiner, produktion af kandidatsubstraterne enten rekombinant eller i et cellefrit ekspressionssystem og den faktiske in vitro-spaltningsreaktion efterfulgt af SDS-PAGE og immunoblotting. Denne protokol er skræddersyet til Drosophila caspases Dronc og Drice, men kan let tilpasses til caspaser fra andre organismer, herunder pattedyr.
Introduction
Programmeret celledød eller apoptose udføres af en klasse af højt specialiserede celledødsproteaser kaldet caspaser (gennemgået i reference1). Caspaser er Cys-proteaser, der indeholder en Cys-rest i det katalytiske sted. De har defineret konsensusspaltningssteder og spaltningssubstrater proteolytisk efter Asp-rester (selvom Drosophila caspase Dronc også er rapporteret at spalte efter Glu-rester2). De er opdelt i initiator (også kendt som apikale eller opstrøms) og effektor (bøddel eller nedstrøms) caspaser. Initiator caspaser aktiverer effektor caspaser. For eksempel hos pattedyr spalter initiatoren Caspase-9 og aktiverer effektoren caspase Caspase-33. Ligeledes i Drosophila melanogaster spalter caspase-9-ortholog Dronc og aktiverer caspase-3-ortholog Drice 2,4. Under apoptose spalter effektorcasper hundredvis af substrater, hvilket fører til celle5's død.
Caspaser syntetiseres som inaktive proenzymer (zymogener) i cellen. I denne form indeholder de et N-terminalt prodomæne, en stor underenhed med de katalytiske Cys i den centrale del af proenzymet og en lille underenhed ved C-terminalen 1 (figur 1). Aktiveringsmekanismen er forskellig mellem initiator- og effektorcaspaser. Initiator-caspaser (Caspase-9, Dronc) kræver dimerisering til aktivering, som sker ved inkorporering i et stort proteinkompleks, kaldet apoptosomet6. Til inkorporering i apoptosomet bærer Caspase-9 og Dronc et caspase-aktiverings- og rekrutteringsdomæne (CARD) i N-terminal-prodomænet (figur 1). Apoptosomkomponenten Apaf-1 indeholder også et CARD og rekrutterer Caspase-9 eller Dronc via CARD / CARD-interaktion til apoptosomet 3,6,7. Mens Caspase-9 og Dronc kan proteolytisk behandles i apoptosomet, er denne behandling ikke fuldt ud nødvendig for enzymatisk aktivitet 8,9.
I modsætning hertil bærer effektorcaspaser (Caspase-3, Drice) ikke et CARD i deres prodomainer og inkorporeres ikke i store proteinkomplekser til aktivering1. De er afhængige af proteolytisk spaltning ved henholdsvis aktiv Caspase-9 eller Dronc1. Den aktive effektorcaspe danner en tetramer sammensat af to store og to små underenheder og indeholder således to katalytiske steder (figur 1). Det er vigtigt for denne protokol, at rekombinant ekspression af caspaser i E. coli forårsager automatisk behandling og aktivering af caspaser, herunder Drice 10 og Dronc 2,8,9,11,12, selv i fravær af Apaf-1. Denne automatiske behandling gør det muligt at udføre in vitro-spaltningsassays af kandidatsubstrater med rekombinant caspaseprotein.
Caspaser er ikke kun involveret i apoptose, men de kan også have mange ikke-apoptotiske funktioner, herunder spredning, differentiering, cellemigration, neuronal beskæring, medfødt immunitet og andre13,14,15. Det er i øjeblikket ukendt, hvordan celler kan overleve på trods af at de indeholder aktive caspaser under ikke-apoptotiske processer. Det er muligt, at disse celler kun aktiverer caspaser ved subletale niveauer16, eller at de sekvestrerer aktive caspaser i ikke-apoptotiske rum i cellen, såsom plasmamembranen17,18. Derfor vil identifikation og verifikation af ikke-apoptotiske substrater ikke kun afsløre, hvordan caspaser formidler ikke-apoptotiske processer, men kan også hjælpe med at forstå, hvordan celler kan overleve i nærvær af aktive caspaser.
Kandidatproteiner som caspasesubstrater kan identificeres ved hjælp af genetiske og biokemiske metoder. Identificerede proteiner kan kontrolleres for tilstedeværelsen af konsensus Dronc spaltningssteder. Dette kan gøres ved visuelt at inspicere proteinsekvensen eller bruge mere sofistikerede online bioinformatiske værktøjer såsom CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Disse værktøjer bruger de kendte konsensusspaltningssteder for caspaser og strukturelle overvejelser til at forudsige nye mål for caspaser. Mens CasCleave inkorporerer oplysningerne om verificerede substrater fra humane Caspases-1, -3, -6, -7 og -8, kan det ikke desto mindre også være nyttigt til de formål, der er beskrevet her, da disse caspaser og deres konsensusspaltningssteder er godt bevaret. Da Dronc-spaltningsstedet imidlertid ikke er veldefineret (to undersøgelser identificerede to forskellige optimale spaltningssteder, TATD/E2 og LALD9), undersøges kandidatsubstraterne også for tilstedeværelsen af andre caspase-spaltningssteder, herunder Drice.
For at validere de forudsagte substrater af caspaser er yderligere assays nødvendige. Et af disse analyser er demonstrationen af, at en given caspase faktisk kan spalte kandidatproteinet in vitro. Her leverer vi en praktisk protokol til in vitro caspase-spaltningsanalyser. Ved hjælp af denne protokol testes kandidatsubstrater med Dronc som caspase. De kan også testes som substrater af Drice. Selvom denne protokol er skrevet til Drosophila caspases Dronc og Drice, kan den også tilpasses til caspaser fra andre organismer.
Udvinding og oprensning af Dronc og Drice sammen med in vitro-spaltningsanalysen skal udføres samme dag på grund af tabet af katalytisk aktivitet af disse caspaser. Denne protokol er blevet ændret og optimeret fra tidligere publikationer 8,9,11,12,21,22. I denne protokol udtrykkes fire forskellige caspaseproteiner rekombinant i E. coli-stammen BL21 (DE3) pLysS. Disse proteiner er: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt og 6xHis-DriceC211A. Hvert af disse proteiner er mærket med 6 histidinrester (6xHis) ved N-terminalen til oprensning. Dronc wt og Dricewt er vildtypeproteinerne og kan automatisk forarbejdes til den aktive caspase ved rekombinant ekspression. DroncC318A og DriceC211A koder for mutante former for Dronc og Drice, der ændrer den katalytiske Cys-rest til en Ala-rest. Disse konstruktioner er katalytisk inaktive og kan ikke automatisk behandle (se figur 2A). De bruges som kontroller i spaltningsanalysen. Fordi DriceC211A ikke kan auto-behandle, bruges den også som modelsubstrat for Droncwt i in vitro-spaltningsanalysen, der er beskrevet her.
Protocol
1. Rekombinant caspaseekspression i bakterier
- Klon genet af interesse (Caspase eller formodet substrat) til en bakteriel ekspressionsvektor med N- og / eller C-terminal tag (er) ved hjælp af standardprotokoller23.
BEMÆRK: Tags kan øge opløseligheden af de rekombinante proteiner og bruges til oprensning af de rekombinante proteiner. Her klones Dronc, Drice og deres katalytiske mutanter i vektoren pET28a, som giver et N-terminal 6xHis tag (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (for grundoplysninger se supplerende tabel 1). - Transformér vektorerne med generne af interesse til kompetente BL21 (DE3) pLysS E. coli-celler ved hjælp af standardprocedurer23,24. Omdannelsesblandingen på LB-agarplader hældes med det relevante antibiotikum (kanamycin i tilfælde af pET28a) for at vælge transformerede bakterier. (Se supplerende tabel 2.)
- Vælg en koloni fra pladen og pod i 5 ml LB-medium indeholdende det passende antibiotikum til at vokse natten over ved 37 ° C ved 220 o / min på en rysteplatform.
- Den næste dag skal du forberede 30-50 ml (pr. Prøve) LB-medium med antibiotika og tilsæt 1 ml af den dyrkede kultur natten over. Den optiske tæthed ved 600 nm (OD600) ved hjælp af et biofotometer/spektrofotometer skal være mellem 0,1 og 0,2.
- Dyrk kulturen ved 37 °C ved 220 o/min på en rysteplatform, indtil OD600 når 0,6. Kontroller OD600 hver time, indtil den når 0,6. Dette tager cirka 2 til 3 timer.
- For at inducere protein (caspase) ekspression tilsættes IPTG til en slutkoncentration på 0,1-0,2 mM (fortyndet 1: 1.000-1: 500 fra IPTG-bestand, se supplerende tabel 2).
- Dyrkning af kulturerne i 3 timer ved 30 °C ved 220 o/min.
BEMÆRK: Tid og temperatur afhænger af, hvilken slags protein der udtrykkes og dets opløselighed. Det kan være nødvendigt at justere disse betingelser, hvis der udtrykkes forskellige caspaser eller substrater. - Efter 3 timer drejes kulturerne ned i 50 ml centrifugerør i 20 minutter ved 4 °C ved 2.000 x g. Kassér supernatanten og fortsæt med pelleten.
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes på dette tidspunkt og fortsættes senere. Bakteriepellets kan fryses ved -80 °C.
2. Udvinding af rekombinante caspaser i lille skala
- Fjern de frosne rør med pelleterede kulturer fra -80 ° C opbevaring, og hold dem på is i 10 minutter for at blødgøre pelleten.
- Efter 10 minutter tilsættes 0,6 ml bakteriecellelysisbuffer (supplerende tabel 2) suppleret med frisktilsatte proteasehæmmere, 10 mg/ml lysozym og 50 E/ml benzonase i de pilleholdige rør ved hjælp af en pipetteregulator med en 1 ml serologisk pipette.
- Med den samme pipettespids opløses pelleten ved at pipettere op og ned, indtil en klar lysegul opløsning uden pelletspartikler er synlig. Inkuberes i 30 min på is.
- Lysatet overføres til passende centrifugerør, og lysaterne centrifugeres ved 17.000 x g i 40 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanterne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Dette er det rå ekstrakt, der indeholder caspaserne.
- Hold rørene på is og fortsæt til rensning med Ni-NTA agarose.
3. Rensning af his-mærkede caspaser i lille skala
- Der tilsættes 0,2 ml 50 % opslæmning af Ni-NTA-agarose til hvert rør af caspaseekstrakterne fra trin 2.5. Rørene drejes på en ende-til-ende rotator i 1 time ved 4 °C.
- Efter 1 time tilsættes ekstraktet med Ni-NTA-agarosen til 1 ml polypropylenkolonner med spidsen intakt, anbragt i et stativ. Lad det stå i 5 min.
- Efter 5 minutter skal du fjerne hætten på søjlerne og lade supernatanten strømme ud af tyngdekraften.
- Tilsæt forsigtigt 1 ml vaskebuffer (supplerende tabel 2) til kolonnerne uden at forstyrre den pakkede harpiks af Ni-NTA-agarose og vask den gennem tyngdekraften.
- Udfør vasketrinnet tre gange.
- Til eluering af caspaserne anbringes 1,5 ml mikrocentrifugerør under kolonnernes opsamlingsdyse efter fuldstændig dræning af vaskebufferen.
- Der tilsættes 0,5 ml elueringsbuffer (suppleret med 1x proteasehæmmere umiddelbart før brug) til hver kolonne, og eluatet opsamles i 1,5 ml mikrocentrifugerørene.
BEMÆRK: Det fint rensede eluat vil være gennemsigtigt i farven. - Hold eluaterne på is og mål koncentrationen af proteiner ved Bradford assay25. Bekræft renhed/homogenitet af de rensede caspaser af SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie Blue farvning26.
BEMÆRK: Udbyttet af en 50 ml LB-kultur varierer mellem 0,5 og 1,5 mg caspaseprotein. Da der anvendes 0,5 ml elueringsbuffer til eluering, varierer koncentrationen fra 1 til 3 mg/ml. Det er vigtigt at bruge de oprensede caspaselutater til in vitro-spaltningsassays samme dag som lysis og rensning, da disse caspasepræparater mister aktivitet om natten.
4. Angivelse af det formodede caspasesubstrat i cellefrie udtrykssystemer
BEMÆRK: I denne protokol fremstilles Drice, det naturlige substrat af Dronc, ved både rekombinant ekspression i E. coli (se afsnit 3 ovenfor) og ved ekspression i kaninreticulocytlysat (RRL), et pattedyrcellefrit ekspressionssystem (dette afsnit, se nedenfor).
- Klon genet fra det formodede substrat til en ekspressionsvektor indeholdende enten en T7-, T3- eller SP6-promotor ved hjælp af standardprocedurer23.
BEMÆRK: I denne protokol anvendes DriceC211A som modelsubstrat og blev klonet ind i vektoren pT7CFE1-N-Myc, som bærer en T7-promotor til genekspression og mærker det formodede proteinsubstrat med et N-terminalt Myc-tag til påvisning ved immunoblotting. - I RRL kan kandidatsubstrater syntetiseres enten radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
- Ikke-radioaktiv syntese: I et 0,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 25 μL RRL, 2 μL reaktionsbuffer, 0,5 μL aminosyreblanding -minus leucin (1 mM), 0,5 μL aminosyreblanding-minus methionin (1 mM), 1 μL ribonukleasehæmmer (40 U/μL), 2 μL DNA-skabelon (0,5 μg/μL) og 1 μL T7-RNA-polymerase. Tilsæt nukleasefrit vand for at justere det endelige volumen af reaktionen til 50 μL. Bland forsigtigt komponenterne ved pipettering eller omrøring med pipettespidsen, og drej kort ned.
BEMÆRK: RRL-lysatet indeholder 100-200 mg / ml af de endogene proteiner. For in vitro-oversættelsesreaktioner tilsættes RRL ved 50% koncentration (her 25 μL/50 μL-reaktion). - Radioaktiv syntese: I et 0,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 25 μL RRL-lysat, 2 μL reaktionsbuffer, 0,5 μL aminosyreblanding-minus methionin (1 mM), 1 μL ribonukleasehæmmer (40 U/μL), 2 μL DNA-skabelon (0,5 μg/μL), 2 μL S35-mærket methionin (1000 Ci/mmol ved 10 mCi/ml) og 1 μL T7-RNA-polymerase. Tilsæt nukleasefrit vand for at justere det endelige volumen af reaktionen til 50 μL. Bland forsigtigt komponenterne ved pipettering eller omrøring med pipettespidsen, og drej kort ned. Bortskaf spidser og rør i en beholder til radioaktivt affald.
BEMÆRK: Tilsæt ikke aminosyreblandingen uden leucin. pT7CFE1-vektoren bruger en T7-promotor til proteinekspression. Andre vektorer bruger T3- eller SP6-promotorer. I så fald skal T3- eller SP6 RNA-polymeraser anvendes i stedet for T7 RNA-polymerase. Sørg for, at DNA-skabelonen er af høj renhed.
- Ikke-radioaktiv syntese: I et 0,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 25 μL RRL, 2 μL reaktionsbuffer, 0,5 μL aminosyreblanding -minus leucin (1 mM), 0,5 μL aminosyreblanding-minus methionin (1 mM), 1 μL ribonukleasehæmmer (40 U/μL), 2 μL DNA-skabelon (0,5 μg/μL) og 1 μL T7-RNA-polymerase. Tilsæt nukleasefrit vand for at justere det endelige volumen af reaktionen til 50 μL. Bland forsigtigt komponenterne ved pipettering eller omrøring med pipettespidsen, og drej kort ned.
- Inkubere reaktionen ved 30 °C i 90 min.
- Drej kort i 10 s og læg rørene på is. Kontroller ekspressionsniveauet for det formodede substrat i RRL af SDS-PAGE og immunoblotting / autoradiografi.
BEMÆRK: Mængden af RRL-ekstrakt, der tilsættes spaltningsreaktionen, skal baseres på den mængde protein, der kan detekteres ved påvisningsmetoden (enten immunoblotting eller S35 autoradiografi). Fortsæt til in vitro-spaltningsanalysen (næste afsnit), eller opbevar den ved -80 °C.
5. In vitro spaltningsassay med substrater genereret med RRL
- Tag de(t) formodede substrat(er), der genereres, som beskrevet i afsnit 4. I denne protokol anvendes N-Myc-DriceC211A som modelsubstrat.
- Afhængigt af ekspressionsniveauet for det formodede substrat (der bestemmes separat ved immunoblot eller autoradiografianalyse, se trin 4.4), skal du anvende 1-10 μL af RRL programmeret med proteinet af interesse i spaltningsassayet.
- Tilsæt 10 μg renset caspaseprotein genereret i afsnit 1, 2 og 3.
- Det samlede reaktionsvolumen bringes til 50 μL med caspaseassaybuffer.
- Inkubere reaktionerne i et vandbad ved 30 °C i 3 timer. Sørg for at inkludere de relevante kontroller i spaltningsanalysen. Her bruges den katalytiske mutant DroncC318A som kontrol.
- Efter 3 timer skal du stoppe reaktionerne ved at overføre rørene på is.
- Der tilsættes en volumen LDS-prøvebuffer indeholdende 50 mM DTT. Reaktionen stoppes fuldstændigt med tilsætning af LDS-prøvebuffer.
- Prøverne inkuberes ved 75 °C i en varmeblok i 10 min.
- Drej hurtigt, bland ved at svirpe, indlæs 24 μL pr. prøve og kør SDS-PAGE (se afsnit 7) eller gem prøverne ved -20 °C.
6. In vitro-spaltningsassay med bakterielt udtrykt rekombinant substratprotein
- Der tilsættes 10 μg renset kandidatsubstrat (her 6xHis-DriceC211A, genereret i afsnit 1, 2 og 3) til et 0,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 10 μg af de oprensede caspaseproteiner, der genereres i afsnit 1 og 2. Bring det samlede volumen til 50 μL ved hjælp af caspase-analysebuffer.
- Følg trin 5.5 til 5.9.
7. SDS-PAGE og immunblotting
- Læg spaltningsreaktionerne (24 μL) på 4%-12% Tris-glycin- eller Bis-Tris-gradientgeler (materialetabel) og udfør proteinelektroforese og immunoblotting (eller autoradiografi, hvis du bruger S35-mærkede substrater) for at visualisere resultater ved hjælp af standardprocedurer27,28.
BEMÆRK: Her i denne protokol blev Bis-Tris gradientgeler med Mops kørende buffer og LDS loading buffer brugt. Generelt fungerer de almindeligt anvendte PAGE-protokoller for Tris-Glycine geler ved hjælp af Tris-Glycine-SDS-løbebufferen og SDS-belastningsbufferen godt.
Representative Results
Denne protokol giver trinvise instruktioner til caspaseproteininduktion i E. coli, oprensning af de rekombinante Drosophila caspases Dronc og Drice, syntese af kandidatsubstrater og in vitro-spaltningsreaktionen med kandidatsubstrater (her DriceC211A) og caspase Dronc. Den katalytiske mutant DriceC211A blev brugt som modelsubstrat i dette assay, fordi den ikke har automatisk behandlingsaktivitet (figur 2A) og forbliver i fuld længde, indtil den spaltes af Droncwt. DriceC211A bør altid anvendes som en positiv kontrol for at validere, at Droncwt-præparatet har enzymatisk aktivitet.
Figur 2A giver et repræsentativt eksempel på ekspression og rensning af rekombinante caspaser. Fire forskellige rekombinante caspaser blev induceret og renset: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt og 6xHis-Drice C211A. De rensede caspaser blev kørt af SDS-PAGE, immunoblotted, og pletten blev undersøgt med et anti-His antistof (fortyndet 1:5.000; efterfulgt af anti-mus IgG, HRP-bundet antistof (1:10.000)). Den uforarbejdede 6xHis-Dronc (proDronc) kører med en relativ molekylvægt (MW r) på 55 kDa (bane 2) og uforarbejdet 6xHis-Drice (proDrice) har en MWr på 35 kDa (bane 4). Autobehandling af caspaserne er synlig ved udseendet af bånd af mindre MWr, som på grund af tilstedeværelsen af His-mærket ved N-terminalen repræsenterer de store underenheder af caspaserne (figur 1). I tilfælde af 6x-Dronc har den store underenhed en MWr på 40 kDa (bane 1). Den store underenhed af 6x-Drice kører ved 23 kDa (bane 3). De katalytiske mutanter 6xHis-DroncC318A og 6xHis-DriceC211A undlader automatisk at behandle og kan kun påvises som proteiner i fuld længde (bane 2 og 4).
Figur 2B For at påvise, at det bakterielt fremstillede og oprensede 6xHis-Droncwt-præparat har enzymatisk aktivitet, blev der udført et in vitro-spaltningsassay som beskrevet i denne protokol. Som negativ kontrol blev den katalytiske mutant 6xHis-DroncC318A anvendt. Substratet var RRL-genereret N-Myc-DriceC211A, som er mærket med et Myc-tag ved N-terminalen. Efter in vitro-spaltningsreaktionen blev proteinerne adskilt af SDS-PAGE, immunoblottet, og blotterne blev inkuberet med et anti-Myc-antistof (fortyndet 1:1.000) efterfulgt af anti-mus IgG, HRP-bundet antistof (1:10.000)) for at detektere N-Myc-DriceC211A. Vellykket spaltning og dermed enzymatisk aktivitet af caspasen kan demonstreres ved udseendet af mindst et bånd af mindre MWr sammenlignet med substratets fulde længde, uforarbejdede form. Uforarbejdet N-Myc-Drice C211A i fuld længde har en MWr på 40 kDa (bane 2 og 4), mens den store underenhed af forarbejdet N-Myc-DriceC211A kører ved 30 kDa (bane 3). Bane 1 repræsenterer det uprogrammerede RRL-lysat (ingen plasmid/transkription tilføjet). Lane 2 demonstrerer in vitro produktion af DriceC211A af RRL udtryk. Bane 3 indeholder in vitro-spaltningsreaktionen med 6xHis-Droncwt. Bane 4 indeholder in vitro-spaltningsreaktionen med 6xHis-DroncC318A.
Figur 2C En in vitro-spaltningsreaktion, der bruger både rekombinant og renset caspase (6xHis-Droncwt og 6x-His-DroncC318A) og substrat (6xHis-DriceC211A) i henhold til denne protokol, blev analyseret af SDS-PAGE og immunoblot. Til analyse af spaltningsreaktionen blev det anti-spaltede Drice-antistof (fortyndet 1:5.000; efterfulgt af anti-kanin IgG, HRP-bundet antistof (1:10.000)) anvendt i denne immunblot. Det anti-spaltede Drice-antistof detekterer sin neo-epitop i den store underenhed (23 kDa) af 6xHis-DriceC211A først efter behandling af 6xHis-Droncwt (bane 1). Den katalytiske mutant 6xHis-DroncC318A er ikke i stand til at behandle 6xHis-Drice C211A i dette assay, og fuld længde 6xHis-DriceC211A fremstår som svagt ubearbejdet bånd på 35 kDa (bane 2).
Figur 1: Domænestruktur af initiatorcaspaser Caspase-9 og Dronc og effektorcaspaser Caspase-3 og Drice. CARD - caspase aktivering og rekruttering domæne; Cys - relativ placering af den katalytiske cysteinrest; L - stor underenhed; S - lille underenhed. Placeringen af N-terminal-prodomainerne er angivet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater. (A) Immunoblotanalyse af oprensede rekombinante 6xHis-Dronc- og 6xHis-Drice-præparater, undersøgt med et anti-His antistof. Uforarbejdet (proDronc og proDrice) og spaltet 6xHis-Dronc og 6xHis-Drice er angivet med pile. MW-markører er angivet til venstre. (B) Immunoblotanalyse af in vitro-spaltningsreaktionen af RRL-genereret N-Myc-Drice med caspaser 6xHis-Droncwt (bane 3) eller 6x-His-DroncC318A (bane 4) undersøgt med et anti-Myc-antistof. Uprogrammerede og programmerede (N-Myc-DriceC211A) RRL-reaktioner indlæses og adskilles i bane 1 og 2. Uforarbejdet (proDrice) og kløvet N-Myc-Drice er angivet med pile. MW-markører er angivet til venstre. (C) Immunoblotanalyse af in vitro-spaltningsreaktionen af bakterielt udtrykt og oprenset rekombinant 6xHis-Drice C211A med caspaser 6xHis-Droncwt (bane 1) eller 6x-His-DroncC318A (bane 2), undersøgt med et anti-spaltet Drice-antistof. Fuld længde (proDrice) og spaltet 6xHis-DriceC211A er angivet med pile. MW-markører er angivet til venstre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Denne tabel indeholder primere, der bruges til kloning i pET28a vektor. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Denne tabel indeholder sammensætningen af buffere og medier. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Størstedelen af vores viden om caspaser og caspasefunktion er afledt af intenst arbejde med apoptose i løbet af de sidste tre årtier. Det er meget veletableret, at initiatorcaspaser proteolytisk behandler effektorcaspaser, og hundredvis af proteiner er blevet identificeret som effektorcaspasesubstrater under apoptose 5,29. I modsætning hertil er der meget mindre kendt om funktionen af caspaser til ikke-apoptotiske processer, og hvilke ikke-apoptotiske substrater de behandler. Det er tænkeligt, at initiativtagere er vigtige beslutningstagere her. Under apoptose aktiverer de effektorcaspaser, der forårsager celledød. For at udløse ikke-apoptotiske processer kan de imidlertid aktivere forskellige proteiner (bortset fra effektorcaspaser), som styrer den ikke-apoptotiske proces. Denne protokol tester kandidatproteiner som substrater af initiatoren caspase Dronc i Drosophila 17,30.
De substrater, der skal testes i spaltningsanalysen, kan fremstilles enten i et in vitro-cellefrit ekspressionssystem som RRL eller ved rekombinant ekspression i E. coli. Der er flere fordele ved in vitro-ekspression ved hjælp af RRL i forhold til bakteriel ekspression. RRL-ekspressionsprotokollen er enkel og hurtig, så mange forskellige substrater kan fremstilles parallelt. I mange tilfælde kan RRL-ekstraktet, der indeholder det pågældende protein, opbevares ved -80 °C før brug i spaltningsanalysen (selvom dette skal bestemmes separat for hvert substrat). Det formodede substrat kan mærkes med S35-Met, hvilket gør det let at analysere ved autoradiografi efter SDS-PAGE. Det er især nyttigt, hvis der ikke er noget substratspecifikt antistof til rådighed. Alternativt, hvis S35-Met-mærkning ikke ønskes, kan det formodede substrat mærkes med almindelige tags som Flag-, HA- eller Myc-tags, hvilket gør det muligt at detektere caspase-spaltning ved immunoblotting.
Det skal kraftigt understreges, at succesen med denne protokol afhænger af den omhyggelige og konsekvente oprensning af de rekombinante Dronc- og Drice-proteiner. Desværre kan disse proteiner ikke opbevares - ikke engang kortvarigt - hverken i køleskabet eller frosne. De mister den enzymatiske aktivitet natten over i enhver lagret form. Derfor skal de tilberedes frisk på dagen for spaltningsanalysen. Uanset hvilket eller hvilke kandidatproteiner der testes, bør DriceC211A altid anvendes som en positiv kontrol til validering af Droncwt-præparatets enzymatiske aktivitet (se figur 2B,C). Alternativt kan aktiviteten af Dronc- og Drice-præparaterne også testes ved in vitro-spaltning af fluorogene syntetiske tetrapeptidsubstrater 2,9,31.
Hvis antistoffer anvendes til at detektere kandidatsubstraterne, skal de valideres af brugeren32,33. Det gælder også for kommercielt tilgængelige antistoffer, der detekterer epitopmærker som Flag, HA, Myc eller andre. Dårlig antistofkvalitet kan skjule vigtige resultater. Dobbelt-epitop-mærkning af kandidatsubstraterne på både N- og C-endestation med forskellige tags anbefales også34. Hvis der opstår spaltning, hjælper dobbeltmærkning med at spore begge spaltningsprodukter og kan hjælpe med at belyse, om spaltning forekommer på et eller flere steder.
Mens denne protokol let validerer det kendte biologiske substrat af Dronc, Drice, er der også begrænsninger. En begrænsning er, at dette er en in vitro-protokol med rekombinante proteiner. I disse assays er caspaserne til stede i en ufysiologisk høj koncentration, hvilket fremgår af observationen af, at de spontant kan autobehandle i E. coli. Den spontane autobehandling forekommer normalt ikke under de fysiologiske forhold. Denne høje caspasekoncentration kan forårsage falsk aktivitet, hvilket resulterer i falske positiver. Falske positiver kan elimineres ved at sænke caspasekoncentrationen i in vitro-spaltningsreaktionen. Som beskrevet mere detaljeret nedenfor er yderligere assays desuden nødvendige for at bekræfte ægte substrater og eliminere falske positiver.
De rekombinante caspaser har muligvis ikke den samme specificitet, som de har i deres normale cellulære miljø in vivo. For eksempel kan caspasernes aktivitet ændres ved posttranslationelle ændringer. Disse er ikke til stede på de rekombinante proteiner. Desuden inkorporeres in vivo initiatorcaspaser, herunder Dronc, i store proteinkomplekser såsom apoptosomet. Under betingelserne i denne protokol opnås dannelse af apoptosomet ikke. Det ville kræve rekombinant udtryk for Drosophila Apaf-1 (aka Dark eller Hac-1)35-37, som har sine egne udfordringer. Derfor har Dronc in vitro muligvis ikke den samme specificitet, som den har in vivo.
Det er også tænkeligt, at Dronc er inkorporeret i et andet proteinkompleks til ikke-apoptotiske processer. Dette kan give Dronc en anden spaltningsspecificitet, hvilket også kan forklare, hvorfor Dronc ikke inducerer apoptose under ikke-apoptotiske forhold. I forbindelse med dette bruger CasCleave de kendte spaltningskonsensussteder til at forudsige nye caspase-substrater. Det er imidlertid ukendt, om de samme spaltningskonsensussteder også bruges til ikke-apoptotiske processer. Faktisk blev det for nylig vist, at Caspase-3 ændrer sit foretrukne konsensussted under en ikke-apoptotisk proces i den udviklende auditive hjernestamme i kyllingembryoet38. Ligeledes, hvis initiatorcaspaser inkorporeres i forskellige proteinkomplekser, kan de have en anden specificitet og kan således kløve ved forskellige konsensussekvenser.
Disse begrænsninger illustrerer, at det ikke er tilstrækkeligt udelukkende at basere sig på de in vitro-spaltningsanalyser, der er beskrevet i denne protokol. Der bør anvendes alternative metoder til yderligere validering af de resultater, der er opnået ved hjælp af denne protokol. Ideelt set bør in vivo-assays bruges til at behandle følgende spørgsmål: Behandles kandidatproteinet proteolytisk under den ikke-apoptotiske proces in vivo? Hvis ja, bruges det samme spaltningssted in vivo og in vitro? Hvad er konsekvensen, hvis spaltningen blokeres af mutagenese af spaltningsstedet? Er behandlingen af kandidatsubstratet afhængig af caspaser, og i bekræftende fald hvilken? Hvad er spaltningsfragmenternes rolle for den ikke-apoptotiske proces? Disse spørgsmål kan let løses i de genetiske modelorganismer som C. elegans og Drosophila ved hjælp af standard genetiske og transgene metoder.
Sammenfattende beskriver denne protokol en pålidelig og konsistent metode til fremstilling af enzymatisk aktive caspaser, specifikt Drosophila caspases Dronc og Drice. Det endelige mål med denne protokol er at undersøge, om Dronc kan spalte kandidatsubstrater in vitro, som blev identificeret ved genetiske, biokemiske eller bioinformatiske tilgange. Som forklaret i det foregående afsnit kræves yderligere assays for at validere disse proteiner som caspasesubstrater in vivo. I betragtning af graden af bevarelse af caspasegener på tværs af metazoer bør det også være muligt at tilpasse denne protokol til caspaser fra andre organismer.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Elif Kamber-Kaya for hendes hjælp til at etablere protokollen i laboratoriet. Dr. Guy Salvesen leverede venligst DriceC211A mutant9. Dette arbejde blev finansieret af en MIRA-pris fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) fra National Institutes of Health (NIH) under tilskudsnummer 2R35GM118330. Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
| Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
| BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
| Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
| ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
| Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
| Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
| Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
| Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
| Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
| Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
| Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
| Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
| Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
| PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
| 14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
| QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
| Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
| rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
| 1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
| TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
| Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |
References
- Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
- Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
- Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
- Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
- Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
- Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
- Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
- Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
- Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
- Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
- Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
- Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
- Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
- Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
- Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
- Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
- Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
- Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
- Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
- Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
- Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
- Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
- Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
- Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).
