Summary
本プロトコルは、コムギ中のペルフルオロアルキル酸の長距離輸送のための簡便かつ効率的な方法を記載する。
Abstract
大量のペルフルオロアルキル酸(PFAA)が土壌に導入され、植物によって蓄積されており、人間の健康に潜在的なリスクをもたらしています。植物内でのPFAAの蓄積と転座を調査することが不可欠です。長距離輸送は、PFAAが植物の葉から師部を通って食用組織に移動するための重要な経路です。しかし、以前は、短期間の曝露期間における有機汚染の転座の可能性を評価することは困難でした。スプリットルート実験は、水耕栽培実験を使用してPFAAの長距離転座を効果的に明らかにするための解決策を提供し、この研究では、2つの50 mL遠心管(AおよびB)で実施され、そのうち遠心分離管Aは50 mLの4分の1強度のホーグランド滅菌栄養液を有し、遠心分離管Bは同じ量の栄養濃度を有し、 ターゲットPFAA(ペルフルオロオクタンスルホン酸、PFOS、およびペルフルオロオクタン酸、PFOA)を所定の濃度で添加します。全粒小麦の根を手作業で2つの部分に分け、チューブAとBに注意深く挿入しました。インキュベーターで7日間培養し収穫した後,根,コムギの新芽,チューブAおよびBの溶液中のPFAAs濃度をそれぞれLC-MS/MSを用いて評価した。その結果、PFOAとPFOSは師部を通る長距離輸送過程が類似しており、周囲環境に放出される可能性が示唆された。したがって、スプリットルート法を使用して、さまざまな化学物質の長距離輸送を評価できます。
Introduction
ペルフルオロアルキル酸(PFAA)は、表面活性や熱的および化学的安定性などの優れた物理化学的特性により、さまざまな商業製品および工業製品に広く使用されています1,2,3。ペルフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)とペルフルオロオクタン酸(PFOA)は、世界中で使用されている4,5,6つの最も重要なPFAAですが、これらの化合物はそれぞれ2009年と2019年の国際ストックホルム条約7,8に記載されています。PFOSとPFOAは、その持続性と広範な使用により、さまざまな環境マトリックスで広く検出されています。世界中のさまざまな河川や湖沼からの地表水中のPFOAとPFOSの濃度は、それぞれ0.15〜52.8 ng / Lと0.09〜29.7 ng / Lです9。地下水または再生水を灌漑に使用し、バイオソリッドを肥料として使用するため、PFOAとPFOSは土壌中に広く存在し、それぞれ0.01〜123μg/ kgから0.003〜162μg / kgの範囲であり10、植物に大量のPFAAを導入し、人間の健康に潜在的なリスクをもたらす可能性があります。農業用土壌および穀物(小麦およびトウモロコシ)中のPFAA(C4-C8)濃度は正の線形相関を示す11。したがって、植物内でのPFAAの蓄積と転座を調査することが不可欠です。
植物におけるPFAAの転座は、まず根から地上組織への転移が起こり、根から食用組織へのPFAAの転座は長距離輸送とみなされる12,13。以前の研究では、野菜や果物からビスフェノールA、ノニルフェノール、および天然エストロゲンが検出されており14、これはこれらの化学物質が師部を介して移動する可能性があることを示唆しています。したがって、植物におけるPFAAの転座を明らかにすることは、それらの潜在的なリスクを評価するために重要です。しかし、PFAAの蓄積と転座は土壌中のバイオアベイラビリティの影響を受けるため、植物における標的PFAAの転座能力を評価することは容易ではありません。さらに、水耕栽培実験は一般にいくつかの要因によって制限されており、植物の食用組織を取得することがより困難になっています。典型的には、師部は植物から直接採取され、植物内の長距離を介した有機化合物の転座を観察するが、植物苗から師部を取得することは困難である15。したがって、比較的短期間の曝露中の植物におけるPFAAの転座を研究するために、簡単で効果的な方法であるスプリットルート技術が導入されました。スプリットルート調査では、1つの植物苗の根が2つの部分に分かれています。一方の部分は標的PFAAを含む栄養溶液(チューブA)に入れられ、もう一方の部分はPFAAの存在しない栄養溶液(チューブB)に入れられます。数日間曝露した後、チューブBのPFAAをLC-MS/MSで測定します。チューブB内のPFAAの濃度は、植物内の師部を通るPFAAの転座の可能性を開示しています16、17、18。
スプリットルート実験は、CuOナノ粒子17、ステロイドエストロゲン18、有機リン酸エステル16など、植物における多くの化合物の長距離転座を研究するために報告されています。これらの研究は、これらの化合物が師部を介して植物の食用部分に移動する可能性があるという証拠を提供しました。ただし、PFAAが植物の転座に役立つかどうか、および化合物特性の影響をさらに調査する必要があります。これらの報告に基づき,本研究ではコムギ中のPFAAの長距離輸送を明らかにするため,スプリットルート実験を行った。
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Protocol
コムギ種子 Triticum aestivum L.を調達し( 材料表を参照)、本研究に使用した。
1.小麦苗の発芽と水耕栽培
- 同様のサイズの小麦種子を選択し、8%(w / w)過酸化水素水で15分間消毒します。
- 消毒した種子を脱イオン水でよくすすぎ、室温の暗所で湿ったろ紙の上に置いて5日間発芽させます。
- 均一なサイズの発芽苗を約9本選択し、250 mLの栄養溶液(Hoagland溶液の1/4強度、その化学組成を 表1に示す)を入れたプラスチックビーカーに移します。
注:9つのシードのうち、それぞれ3つがブランク、PFOA、およびPFOSに選択されました。 - 苗を成長チャンバーで7日間栽培した後、22°Cで14時間、27°Cで10時間のサイクルで暴露します。
2. 根分裂実験
- 2本の50mL遠沈管(AとB)で苗栽培を行います。
注:遠沈管Aには、50 mLの滅菌1/4強度のホーグランド溶液が存在し、同量の栄養溶液が遠沈管Bに存在していました。- 市販のPFOAとPFOS( 材料表を参照)をメタノールに溶解し、原液として滅菌栄養液で希釈します。次に、ストック溶液を100 μg/LのPFOA/PFOS濃度でチューブBに加えます。
- バックグラウンド汚染を監視するために、ブランクコントロールで三重に処理を実行します。スプリットルート露光実験の概略図を 図1に示します。
- ピンセットを使用して小麦苗の根全体を2等分して、根が同じ苗条に引っ掛かるようにし、それぞれチューブAとBに慎重に挿入します。
- 2本のチューブをアルミホイルで密封し、インキュベーターで7日間培養します。ステップ1.4に記載されているのと同じインキュベーション条件を維持します。
- 7日間の培養後にコムギの苗を採取し、滅菌ハサミを用いて、PFAAの添加溶液と非添加溶液で培養した苗条と根の3つの部分に小麦を分離する。
- 植物サンプルを凍結乾燥機で-55°Cで48時間凍結乾燥します。
- 根を均質化して計量し、サンプルを撮影します。スパイク溶液サンプルと非スパイク溶液サンプルを収集します。
3. 植物組織からのPFOAおよびPFOSの抽出
- 2 mLの炭酸ナトリウムバッファー(0.25 mol / L)、1 mLの硫酸水素テトラブチルアンモニウム(0.5 mol / L)、および5 mLのメチルtert-ブチルエーテル( 材料の表を参照)を、均質化した根またはシュートを含む15 mLのポリプロピレンチューブに加えます。
- チューブを250rpmで20分間振とうし、室温で2,000 x g で10分間遠心分離して上清有機相を得る。抽出プロセスを 2 回実行します。
- 採取した抽出物を混合し、穏やかな窒素(N2)流で気化乾固させた後、5 mLのメタノールで再構成し、約30秒間同じ速度を維持しながらボルテックスします。
- ペスチカルブカートリッジ( 材料表を参照)を、メタノール中の0.1%NH4OH溶液5 mL、水5 mL、およびメタノール5 mLで調整します。.
- ペスチカルブカートリッジ(500 mg / 6 mL)を通して5 mLの抽出メタノール溶液を加えて顔料を除去し、5 mLのメタノールでカートリッジを溶出し、同じチューブに集めます。
- 回収した10 mLのメタノール溶液をほぼ乾固するまで蒸発させ、200 μLのメタノールで再構成した後、室温で20分間、10,000 x g でボルテックスおよび遠心分離を行います。
4.栄養液からのサンプル調製
- 極性増強ポリマー(PEP)抽出カートリッジ(60 mg / g、3 mL)を活性化するために、5 mLのメタノールと5 mLの水で条件を付けます( 材料の表を参照)。
- カートリッジを通して、それぞれ1 mLの添加溶液または50 mLの非添加溶液サンプル(ステップ2.6)を追加します。
- ターゲットPFAAを10 mLのメタノールで溶出し、穏やかなN2で抽出物を蒸発させた後、分析のために200 μLのメタノールで再構成します。
5.機器分析
- 超高速液体クロマトグラフィーUPLCとタンデム質量分析(LC-MS/MS)を組み合わせて使用 することで、マルチ反応モード(MRM)および負のエレクトロスプレーイオン化(ESI-)でターゲットPFAAを定量します(材料表を参照)。
- 10 μLのサンプルを注入し、C18液体クロマトグラフィーカラム(1.7 μm、2.1 mm x 50 mm、 材料表を参照)を使用してターゲットPFAAを分離し、水(フェーズA)およびメタノール(フェーズB)中の2 mM酢酸アンモニウムをUPLCの移動相として使用し、流速は0.3 mL/minです。カラム温度を50°Cに維持します。
注:PFOAとPFOSのイオン遷移はそれぞれ413から369と499から80です。ターゲットPFAAを定量するためのグラジエント溶出プログラムとLC-MS/MS機器パラメータを 表2に示します。 - データ分析ソフトウェアでデータを処理します( 材料表を参照)。
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Representative Results
分割根実験では、小麦中のPFAAの長距離輸送を調査しました。図2A,Cに示すように,PFOAとPFOSの両方がコムギの根に取り込まれ,シュートに移されることができた。PFOSおよびPFOAは、ブランクコントロールのチューブAのコムギの根および溶液では検出されなかった。その結果,非添加溶液中で培養したコムギの根からPFOSおよびPFOAが検出され,0.26 ng/g ±±0.02 ng/gおよび0.64 ng/gの濃度が0.05 ng/g(dw)(n=3)であり,全粒小麦の蓄積量の1.5%および1.8%を占めていた。この結果は、PFOSとPFOAが師部を通ってシュートから根への長距離輸送を経験する可能性があることを示唆しています。PFOSとPFOAは、それぞれ17.8 ng / L±0.28 ng / Lと28.5 ng / L±5.9 ng / L(n = 3)の濃度の非添加栄養溶液にも見られ、PFOAとPFOSが根のカスパリアストリップ19,20を通過して周囲環境に放出される可能性があることを示唆しています。本研究の結果は、長距離輸送が小麦がPFAAを排除するための重要な経路でもあるという確固たる証拠を提供します。
図1:スプリットルート実験の概略図。コムギ苗の根全体を均等に2つに分け、チューブ(A)とチューブ(B)に慎重に挿入した。一致するスポンジを備えた水耕プラスチック製の根の保持器を使用して、2本のチューブを接続し、苗を固定しました。空白のグループは A の解に設定されます。Bチューブはすべてスパイクされていません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:7日間の曝露後のスプリットルート実験におけるPFOAおよびPFOS濃度の分布。 スパイク溶液(標的PFAAを含む溶液)、スパイクルート(PFAAスパイク溶液中の根)、および(A)PFOAおよび(C)PFOSのシュート。(B)PFOA(D)およびPFOSの非スパイク溶液(PFAAを含まない溶液)および非スパイクルート(非スパイク溶液中のルート)。エラーバーは標準偏差(n = 3)を示します。略称:dw =乾燥重量。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | 分子量 | 原液濃度(g/L) | 最終溶液1リットルあたりの原液量(mL) | 要素 | 栄養溶液中の元素の最終濃度(ppm) |
| 主要栄養素 | |||||
| クノ3 | 101.1 | 101.1 | 1.25 | K | 56 |
| Ca(NO3)2.4H2O | 236.16 | 236.16 | 1 | N | 58.75 |
| NH4H2PO4 | 115.08 | 115.08 | 0.5 | カリフォルニア州 | 40 |
| マグネシウム4.7H2O | 246.48 | 246.48 | 0.25 | P | 15.5 |
| ミリグラム | 6 | ||||
| S | 8 | ||||
| 鉄(EDTA-FeNa) | |||||
| EDTA-FeNa | 367.05 | 7.342 | 0.25 | 鉄 | 0.28 |
| 微量栄養素 | |||||
| H3 BO3 | 61.83 | 2.86 | B | 0.125 | |
| MnCl2.4H2O | 197.91 | 1.81 | ミネソタ | 0.125 | |
| ZnSO4.7H2O | 287.56 | 0.22 | 亜鉛 | 0.0125 | |
| CuSO4 | 159.61 | 0.051 | キュ | 0.005 | |
| H2MoO4 (85% MoO3) | 161.97 | 0.017 | モー | 0.0025 |
表1:1/4強度のホーグランド栄養液の化学組成。 この栄養溶液は、スプリットルート実験における非添加溶液を表します。
| カラム温度 | 50 °C | |||||
| 移動相 | pH = 9の水中の2 mM酢酸アンモニウム(A)およびメタノール(B) | |||||
| 勾配 | 時間 (分) | 流量(ミリリットル/分) | A (%) | B (%) | ||
| イニシャル | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 0.5 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 5 | 0.3 | 15 | 85 | |||
| 5.1 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7.1 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 9 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 質量パラメータ | キャピラリー電圧:-1.5kV | |||||
| 脱溶媒温度 500°C | ||||||
| 脱溶媒ガス流量:1000 L/h | ||||||
| コーンガス流量:150 L/h | ||||||
| 倍数 | 化合 物 | 親イオン | プロダクトイオン (m/z) | |||
| 反応 | (メートル/リットル) | |||||
| モニタリング | ||||||
| (MRM) | PFOA | 413 | 369 | |||
| 遷移 | PFOS | 499 | 80 | |||
表2:ターゲットPFAAを定量するためのLC-MS/MS機器パラメータ。
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Discussion
この方法の精度を確保するには、チューブBのスパイク溶液がチューブAの非スパイク溶液を汚染しないように注意深い操作を行う必要があります。本研究における標的PFAAの所定の濃度は、実環境での濃度よりも比較的高く、LC-MS/MSを使用して小麦および非添加溶液中の標的PFAAを確実にモニタリングしました。
この方法には制限があります。各処理区に小麦苗を1本のみ使用し、根を半分に分割したため、添加液の初期濃度が比較的低い場合、最終処理で得られるバイオマスが少ないため、非添加液で培養した根のPFAAs濃度が検出限界以下となる可能性がある。さらに、暴露時間が短いため、根から小麦の食用部分へのPFAAの輸送を決定することができませんでした。スプリットルート実験では、植物内の異なる特性を持つPFAAの師部輸送のみを分析できました16。
この方法は、植物組織中の汚染物質の長距離輸送12,13を理解するために非常に重要です。結果によると、PFAAは根に取り込まれ、主に木部を通って芽に運ばれる可能性があります。しかしながら、それらは葉から食用組織へ、ならびに師部を介して苗条から根へと転座する可能性があり、これは植物におけるそれらの転座の潜在的なリスクの評価にとって重要であることに留意すべきである。さらに、地上組織から根へのPFAAの移動とその後の周囲環境への放出は、植物におけるPFAAの除去経路の確かな証拠を提供します。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
中国自然科学財団(NSFC 21737003)、中国大学科学基金(第2452021103号)、中国ポスドク科学基金会(第2021M692651号、2021M702680号)からの財政的支援に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACQUITY UPLC BEH C18 column | Waters, Milford, MA | Liquid chromatographic column | |
| Cleanert PEP cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | Liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Lyophilizer | Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China | FD-1A50 | Freeze-dried sample |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | data analysis software | |
| Methyl tert-butyl ether | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXA0518 | the internal standards |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXB0219 | mixture of PFAA calibration standards |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | a represent PFAAs |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | a represent PFAAs |
| Sodium carbonate buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Tetrabutylammonium hydrogen sulfate | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Wheat seeds | Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) | Triticum aestivum L. |
References
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