Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for langdistansetransport av perfluoralkylsyrer i hvete.
Abstract
Store mengder perfluoralkylsyrer (PFAA) har blitt introdusert i jorda og akkumulert av planter, noe som utgjør potensielle farer for menneskers helse. Det er viktig å undersøke akkumulering og translokasjon av PFAAer i planter. Langdistansetransport er en viktig vei for PFAAer overført fra plantebladene til spiselige vev gjennom floem. Det var imidlertid tidligere vanskelig å vurdere translokasjonspotensialet for organisk forurensning i en kortvarig eksponeringsperiode. Split-root-eksperimentet gir en løsning for effektivt å avdekke langdistansetranslokasjonen av PFAA-er ved hjelp av et hydroponisk eksperiment, som i denne studien ble utført i to 50 ml sentrifugerør (A og B), hvorav sentrifugerør A hadde 50 ml av en fjerdedel styrke Hoagland steril næringsoppløsning, mens sentrifugerør B hadde samme mengde næringskonsentrasjon, og mål-PFAA-ene (perfluoroktansulfonsyre, PFOS og perfluoroktansyre, PFOA) tilsatt ved en gitt konsentrasjon. En hel hveterot ble manuelt delt i to deler og satt forsiktig inn i rør A og B. Konsentrasjonen av PFAAer i røttene, hveteskuddene og løsningene i rør A og B ble evaluert ved bruk av henholdsvis LC-MS / MS etter å ha blitt dyrket i en inkubator i 7 dager og høstet. Resultatene antydet at PFOA og PFOS opplever en lignende langdistanse transportprosess gjennom floem fra skytingen til roten og kan slippes ut i omgivelsene. Dermed kan split-root-teknikken brukes til å evaluere langdistansetransporten av forskjellige kjemikalier.
Introduction
Perfluoralkylsyrer (PFAA) er mye brukt i ulike kommersielle og industrielle produkter på grunn av deres utmerkede fysisk-kjemiske egenskaper, inkludert overflateaktivitet og termisk og kjemisk stabilitet 1,2,3. Perfluoroktansulfonsyre (PFOS) og perfluoroktansyre (PFOA) er de to viktigste PFAA-ene som brukes over hele verden 4,5,6, selv om disse forbindelsene ble oppført i den internasjonale Stockholm-konvensjonen i henholdsvis 2009 og 2019 7,8. På grunn av deres utholdenhet og utbredt bruk har PFOS og PFOA blitt mye oppdaget i ulike miljømatriser. Konsentrasjonene av PFOA og PFOS i overflatevann fra forskjellige verdensomspennende elver og innsjøer er henholdsvis 0,15-52,8 ng / L og 0,09-29,7 ng /L, 9. På grunn av bruk av grunnvann eller gjenvunnet vann til vanning og også bruk av biosolids som gjødsel, er PFOA og PFOS allment tilstede i jorda, mellom 0,01-123 μg / kg og 0,003-162 μg / kg, henholdsvis10, noe som kan introdusere en stor mengde PFAA i planter og utgjøre potensielle farer for menneskers helse. PFAA-konsentrasjonene (C4-C8) i jordbruksjord og korn (hvete og mais) viser en positiv lineær korrelasjon11. Derfor er det viktig å undersøke akkumulering og translokasjon av PFAA i planter.
Translokasjonen av PFAA i planter skjer først fra røttene til det overjordiske vevet, og translokasjonen av PFAA fra røttene til det spiselige vevet regnes som langdistansetransport12,13. Tidligere studier har oppdaget bisfenol A, nonylfenol og naturlige østrogener i grønnsaker og frukt14, noe som innebærer at disse kjemikaliene kan migrere via floem. Derfor er det viktig å avdekke translokasjon av PFAA i planter for å vurdere deres potensielle risiko. Akkumuleringen og translokasjonen av PFAA påvirkes imidlertid av deres biotilgjengelighet i jorda, så det er ikke lett å evaluere translokasjonsevnen til mål-PFAA-er i planter. I tillegg er hydroponiske eksperimenter generelt begrenset av flere faktorer, noe som gjør det vanskeligere å skaffe seg spiselige vev av planter. Vanligvis ble floem samlet direkte fra planter for å observere translokasjon av organiske forbindelser gjennom lange avstander i planter, mens det er vanskelig å skaffe phloems fra planteplanter15. Derfor ble en enkel og effektiv metode, split-root-teknikken, introdusert for å studere translokasjonen av PFAA i planter under relativt kortvarig eksponering. Når det gjelder split-root-undersøkelsen, er røttene i en planteplante delt inn i to deler; den ene delen settes inn i næringsoppløsningen som inneholder mål PFAA (rør A), og den andre plasseres i næringsoppløsningen i fravær av PFAA (rør B). Etter eksponering i flere dager måles PFAA-ene i rør B med LC-MS/MS. Konsentrasjonen av PFAA i rør B avslører translokasjonspotensialet til PFAA gjennom floem i planter16,17,18.
Split-root-eksperimentet har blitt rapportert for å studere langdistansetranslokasjonen av mange forbindelser i planter, som CuO nanopartikler17, steroidøstrogener 18 og organofosfatestere16. Disse studiene ga bevis på at disse forbindelsene kunne overføres via floem til de spiselige delene av planter. Hvorvidt PFAA kan hjelpe til med translokasjon i planter og virkningen av sammensatte egenskaper, må imidlertid undersøkes nærmere. Basert på disse rapportene ble split-root-eksperimentet utført i denne studien for å avsløre langdistansetransporten av PFAAer i hvete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hvetefrø, Triticum aestivum L., ble anskaffet (se tabell over materialer) og brukt til denne studien.
1. Spiring av hveteplanter og hydroponisk kultur
- Velg hvetefrø av samme størrelse og desinfiser dem i 15 minutter med 8% (w / w) hydrogenperoksidoppløsning.
- Skyll de desinfiserte frøene med avionisert vann grundig, og legg dem deretter på fuktig filterpapir i mørket ved romtemperatur for å spire i 5 dager.
- Velg omtrent ni spirede frøplanter av jevn størrelse og overfør dem til plastbeger med 250 ml næringsoppløsning (1/4 styrke av Hoaglands løsning, dets kjemiske sammensetning er vist i tabell 1).
MERK: Av de ni frøene ble tre hver valgt for henholdsvis blank, PFOA og PFOS. - Dyrk plantene i vekstkamrene i 7 dager før eksponering med en syklus på 14 timer ved 22 °C og 10 timer ved 27 °C.
2. Rotdelingseksperimentet
- Utfør dyrking av frøplanten i to 50 ml sentrifugerør (A og B).
MERK: I sentrifugerør A var 50 ml steril 1/4 styrke Hoaglands løsning tilstede, og samme mengde næringsoppløsning var tilstede i sentrifugerør B.- Oppløs de kommersielle PFOA- og PFOS-ene (se Materialtabell) i metanol og fortynn dem med den sterile næringsoppløsningen som stamløsning. Tilsett deretter stamløsningen til rør B ved en PFOA/PFOS-konsentrasjon på 100 μg/L.
- Utfør behandlingene i tre eksemplarer med en tom kontroll for å overvåke bakgrunnsforurensningen. Et skjematisk diagram over eksponeringseksperimentene med delt rot er vist i figur 1.
- Skill hele røttene til hveteplanten ved hjelp av pinsett i to like deler slik at røttene fortsatt er hekta på samme skudd og sett dem forsiktig inn i henholdsvis rør A og B.
- Forsegl de to rørene med aluminiumsfolie og dyrk dem i en inkubator i 7 dager. Oppretthold de samme inkubasjonsbetingelsene som angitt i trinn 1.4.
- Samle hveteplantene etter 7 dagers kultur og skille hveten i tre deler: skudd og røtter dyrket i henholdsvis spiked løsning av PFAA og unspiked løsning, ved bruk av sterilisert saks.
- Frysetørk planteprøvene i et lyofilisator ved -55 ° C i 48 timer.
- Homogeniser og vei roten og skyt prøver. Samle de piggede og ikke-piggede løsningsprøvene.
3. Ekstraksjon av PFOA og PFOS fra plantevev
- Tilsett 2 ml natriumkarbonatbuffer (0,25 mol / L), 1 ml tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,5 mol / L) og 5 ml metyltertert-butyleter (se materialtabell) til et 15 ml polypropylenrør, inkludert homogenisert rot eller skudd.
- Rist røret ved 250 o / min i 20 minutter og sentrifuger ved 2000 x g i 10 minutter ved romtemperatur for å oppnå supernatant organisk fase. Utfør utvinningsprosessen to ganger.
- Bland de oppsamlede ekstraktene, fordamp til tørrhet i en mild nitrogenstrøm (N2), og rekonstituer deretter med 5 ml metanol og hvirvel dem, og hold samme hastighet i ca. 30 s.
- Kondisjoner pesticarbpatronen (se materialtabell) med 5 ml 0,1% NH4OH i metanol, 5 ml vann og 5 ml metanol.
- Tilsett 5 ml ekstrahering av metanoloppløsning gjennom pesticarbpatronen (500 mg/6 ml) for å fjerne pigmentet, eluere sylinderampullen med 5 ml metanol og samle i de samme rørene.
- Fordamp den oppsamlede 10 ml metanoloppløsningen til nesten tørrhet og rekonstituer med 200 μL metanol, etterfulgt av virvel og sentrifugering ved 10 000 x g i 20 minutter ved romtemperatur.
4. Prøvepreparering fra næringsoppløsningen
- Tilstand med 5 ml metanol og 5 ml vann for å aktivere polar enhanced polymer (PEP) ekstraksjonspatronen (60 mg/g, 3 ml) (se tabell over materialer).
- Tilsett henholdsvis 1 ml av den piggede oppløsningen eller 50 ml av de ikke-piggede oppløsningsprøvene (trinn 2.6) gjennom sylinderampullen.
- Eluter mål-PFAA-ene med 10 ml metanol, fordamp ekstraktet med skånsomt N2, og rekonstituer deretter med 200 μL metanol for analyse.
5. Instrumentell analyse
- Bruk en ultra-ytelse væskekromatografi UPLC kombinert med tandem massespektrometri (LC-MS / MS) for kvantifisering av målet PFAA i multireaksjonsmodus (MRM) og negativ elektrosprayionisering (ESI-) (se materialtabell).
- Injiser 10 μL prøver og separer mål-PFAA-ene ved hjelp av en C18 væskekromatografisk kolonne (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, se materialtabell), og bruk 2 mM ammoniumacetat i vann (fase A) og metanol (fase B) som mobilfase for UPLC, med en strømningshastighet på 0,3 ml / min. Hold kolonnetemperaturen på 50 °C.
MERK: Ionovergangene til PFOA og PFOS er henholdsvis 413 til 369 og 499 til 80. Gradient elueringsprogrammet og LC-MS / MS instrumentelle parametere for kvantifisering av mål-PFAAene er oppført i tabell 2. - Behandle dataene med dataanalyseprogramvaren (se Tabell over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Split-root-eksperimentet undersøkte langdistansetransporten av PFAAer i hvete. Som vist i figur 2A, C, kunne både PFOA og PFOS tas opp av hveteroten og overføres til skytingen. PFOS og PFOA ble ikke påvist i hveterot og oppløsning i rør A av blank kontroll. Det ble funnet at PFOS og PFOA ble påvist i hveterøttene dyrket i den upiggede løsningen, med en konsentrasjon på henholdsvis 0,26 ng / g ± 0,02 ng / g og 0,64 ng / g ± 0,05 ng / g tørrvekt (dw) (n = 3), som står for henholdsvis 1,5% og 1,8% av mengden akkumulering i hele hveteplanten. Dette resultatet antyder at PFOS og PFOA kan oppleve langdistansetransport gjennom floem fra skytingen til roten. Det var verdt å merke seg at PFOS og PFOA også ble funnet i den upiggede næringsoppløsningen med en konsentrasjon på henholdsvis 17,8 ng / L ± 0,28 ng / L og 28,5 ng / L ± 5,9 ng / L (n = 3), noe som tyder på at PFOA og PFOS kan passere gjennom roten Casparian strip19,20 og slippes ut i omgivelsene. Resultatene fra det nåværende arbeidet gir solid bevis på at langdistansetransport også er en viktig vei for hvete for å eliminere PFAA.
Figur 1: Skjematisk diagram over split-root-eksperimentene. Hele røttene til hveteplanten ble like delt i to deler og forsiktig satt inn i rør (A) og (B). En hydroponisk plastrotholder med en matchende svamp ble brukt til å koble de to rørene og fikse frøplanten. Den tomme gruppen er satt til løsningen i A; B-rør er alle unspiked. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fordeling av PFOA- og PFOS-konsentrasjoner i split-root-eksperimentet etter 7 dagers eksponering. Den piggede løsningen (løsning som inneholder mål-PFAAer), pigget rot (rot i PFAA-pigget løsning) og skudd av (A) PFOA og (C) PFOS. Unspiked løsning (løsning uten PFAA) og unspiked root (rot i unspiked løsning) av (B) PFOA (D) og PFOS. Feilfeltene angir standardavvikene (n = 3). Forkortelse: dw = tørrvekt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponent | Molekulær vekt | Konk. av lagerløsning (g/L) | Volum av stamløsning per liter ferdig oppløsning (ml) | Element | Endelig konk. av grunnstoffet i næringsoppløsning (ppm) |
| Makronæringsstoffer | |||||
| KNO3 | 101.1 | 101.1 | 1.25 | K | 56 |
| Ca(NR.3)2. 4T2o | 236.16 | 236.16 | 1 | N | 58.75 |
| NH4H2PO4 | 115.08 | 115.08 | 0.5 | Ca | 40 |
| MgSO4. 7T2o | 246.48 | 246.48 | 0.25 | P | 15.5 |
| Mg | 6 | ||||
| S | 8 | ||||
| Jern (EDTA-FeNa) | |||||
| EDTA-FeNa | 367.05 | 7.342 | 0.25 | Fe | 0.28 |
| Mikronæringsstoffer | |||||
| H 3BO3 | 61.83 | 2.86 | B | 0.125 | |
| MnCl2. 4T2o | 197.91 | 1.81 | Mn | 0.125 | |
| ZnSO4. 7T2o | 287.56 | 0.22 | Zn | 0.0125 | |
| CuSO4 | 159.61 | 0.051 | Cu | 0.005 | |
| H2MoO4(85 % MoO3) | 161.97 | 0.017 | Mo | 0.0025 |
Tabell 1: Kjemiske sammensetninger av 1/4 styrke Hoagland næringsoppløsning. Denne næringsoppløsningen representerer den upiggede løsningen i split-root-eksperimentet.
| Kolonne Temperatur | 50 °C | |||||
| Mobil fase | 2 mM ammoniumacetat i vann pH = 9 (A) og metanol (B) | |||||
| Gradient | Tid (min) | Strømningshastighet (ml/min) | A (%) | B (%) | ||
| Initial | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 0.5 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 5 | 0.3 | 15 | 85 | |||
| 5.1 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7.1 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 9 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| Masse parametere | Kapillærspenning: -1,5 kV | |||||
| Desolvasjonstemperatur 500 °C | ||||||
| Desolvasjon gassstrøm: 1000 l / t | ||||||
| Kjeglegassstrøm: 150 l / t | ||||||
| Multiplum | Forbindelser | Foreldre ioner | Produktioner (m/z) | |||
| reaksjon | (m/z) | |||||
| overvåking | ||||||
| (MRM) | PFOA | 413 | 369 | |||
| Overganger | PFOS | 499 | 80 | |||
Tabell 2: LC-MS/MS instrumentelle parametere for kvantifisering av mål-PFAA-ene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å sikre nøyaktigheten av denne metoden, må det tas forsiktig operasjon for å sikre at den piggede løsningen i rør B ikke forurenser den upiggede løsningen i rør A. Den gitte konsentrasjonen av mål-PFAAer i denne studien var relativt høyere enn konsentrasjonen i det virkelige miljøet, noe som sikret å overvåke mål-PFAAer i hvete og unspiked-løsning ved bruk av LC-MS / MS.
Det er begrensninger for denne metoden. Siden bare en hveteplante ble brukt i hver behandlingsgruppe og roten ble delt i to, hvis den opprinnelige konsentrasjonen av den piggede løsningen er relativt lav, kan den mindre biomassen oppnådd fra den endelige behandlingen føre til at konsentrasjonen av PFAA i røttene dyrket i den upiggede løsningen er under deteksjonsgrensen. I tillegg, på grunn av den korte eksponeringstiden, kunne transporten av PFAA fra røttene til de spiselige delene av hvete ikke bestemmes. Split-root-eksperimentet kunne bare analysere floemtransporten av PFAAer med forskjellige egenskaper i planter16.
Denne metoden har stor betydning for å forstå langdistansetransport12,13 av miljøgifter i plantevev. Ifølge resultatene kan PFAA tas opp av røtter og transporteres til skudd hovedsakelig gjennom xylem; Det skal imidlertid bemerkes at de kan overføres fra blader til spiselige vev, samt fra skudd til røtter gjennom floem, noe som er viktig for vurderingen av deres potensielle risiko for translokasjon i planter. Videre gir translokasjonen av PFAA fra det overjordiske vevet til røtter og deretter frigjøring i omgivelsesmiljøet solid bevis for elimineringsveiene til PFAA i planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Natural Science Foundation of China (NSFC 21737003), Chinese Universities Scientific Fund (nr. 2452021103) og Chinese Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021M692651, 2021M702680).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACQUITY UPLC BEH C18 column | Waters, Milford, MA | Liquid chromatographic column | |
| Cleanert PEP cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | Liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Lyophilizer | Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China | FD-1A50 | Freeze-dried sample |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | data analysis software | |
| Methyl tert-butyl ether | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXA0518 | the internal standards |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXB0219 | mixture of PFAA calibration standards |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | a represent PFAAs |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | a represent PFAAs |
| Sodium carbonate buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Tetrabutylammonium hydrogen sulfate | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Wheat seeds | Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) | Triticum aestivum L. |
References
- Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated compounds: Past, present, and future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954-7961 (2011).
- Kannan, K. Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances: Current and future perspectives. Environmental Chemistry. 8 (4), 333-338 (2011).
- Cui, Q., et al. Occurrence and tissue distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids and legacy per/polyfluoroalkyl substances in black-spotted frog (Pelophylax nigromaculatus). Environmental Science & Technology. 52 (3), 982-990 (2018).
- Negri, E., et al. Exposure to PFOA and PFOS and fetal growth: a critical merging of toxicological and epidemiological data. Critical Reviews in Toxicology. 47 (6), 489-515 (2017).
- Chi, Q., Li, Z., Huang, J., Ma, J., Wang, X. Interactions of perfluorooctanoic acid and perfluorooctanesulfonic acid with serum albumins by native mass spectrometry, fluorescence and molecular docking. Chemosphere. 198, 442-449 (2018).
- Zhang, X., Chen, L., Fei, X. C., Ma, Y. S., Gao, H. W. Binding of PFOS to serum albumin and DNA: insight into the molecular toxicity of perfluorochemicals. Bmc Molecular Biology. 10, 16 (2009).
- Stockholm Convention. PFASs listed under the Stockholm Convention. , Switzerland. Available from: http://chm.pops.int/Implementation/IndustrialPOPs/PFOS/Overview/tabid/5221/Default.aspx (2009).
- Stockholm Convention. Chemicals proposed for listing under the Convention. , Switzerland. Available from: http://chm.pops.int/TheConvention/ThePOPs/ChemicalsProposedforListing/tabid/2510/Default.aspx (2019).
- Pan, Y. T., et al. Worldwide distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids in surface water. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7621-7629 (2018).
- Knight, E. R., et al. An investigation into the long-term binding and uptake of PFOS, PFOA and PFHxS in soil - plant systems. Journal of Hazardous Materials. 404, 124065 (2021).
- Liu, Z. Y., et al. Crop bioaccumulation and human exposure of perfluoroalkyl acids through multi-media transport from a mega fluorochemical industrial park, China. Environment International. 106, 37-47 (2017).
- Mei, W. P., et al. Per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) in the soil-plant system: Sorption, root uptake, and translocation. Environment International. 156, 106642 (2021).
- Wang, W., Rhodes, G., Ge, J., Yu, X., Li, H. Uptake and accumulation of per- and polyfluoroalkyl substances in plants. Chemosphere. 261, 127584 (2020).
- Lu, J., Wu, J., Stoffella, P. J., Wilson, P. C. Analysis of bisphenol A, nonylphenol, and natural estrogens in vegetables and fruits using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (1), 84-89 (2013).
- Herschbach, C., Gessler, A., Rennenberg, H. Long Distance Transport and Plant Internal Cycling of N- and S-Compounds. Progress in Botany 73. Luttge, U., Beyschlag, W., Budel, B., Francis, D. , Springer. Berlin, Heidelberg. 161-188 (2012).
- Liu, Q., et al. Uptake kinetics, accumulation, and long-distance transport of organophosphate esters in plants: Impacts of chemical and plant properties. Environmental Science & Technology. 53 (9), 4940-4947 (2019).
- Wang, Z. Y., et al. Xylem- and phloem-based transport of CuO nanoparticles in maize (Zea mays L.). Environmental Science & Technology. 46 (8), 4434-4441 (2012).
- Chen, X., et al. Uptake, accumulation, and translocation mechanisms of steroid estrogens in plants. Science of the Total Environment. 753, 141979 (2021).
- Felizeter, S., McLachlan, M. S., de Voogt, P. Uptake of perfluorinated alkyl acids by hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa). Environmental Science & Technology. 46 (21), 11735-11743 (2012).
- Zhou, J., et al. Insights into uptake, translocation, and transformation mechanisms of perfluorophosphinates and perfluorophosphonates in wheat (Triticum aestivum L.). Environmental Science & Technology. 54 (1), 276-285 (2020).
