Summary
En optimeret protokol præsenteres, der muliggør udtømning af cytoplasmatiske mikrotubulusorganiseringscentre i museoocytter under metafase I ved hjælp af en nær-infrarød femtosekundlaser.
Abstract
Troskaben af oocytmeiose er afgørende for at generere udviklingsmæssigt kompetente euploide æg. Hos pattedyr gennemgår oocyten en langvarig anholdelse ved profase I af den første meiotiske division. Efter puberteten og ved meiotisk genoptagelse adskilles kernemembranen (nuklear kuvertnedbrydning), og spindlen samles hovedsageligt i oocytcentret. Indledende central spindelpositionering er afgørende for at beskytte mod unormale kinetochore-mikrotubuli (MT) vedhæftede filer og aneuploidi. Den centralt placerede spindel vandrer på en tidsfølsom måde mod cortex, og dette er en nødvendig proces for at ekstrudere en lille polær krop. I mitotiske celler er spindelpositionering afhængig af interaktionen mellem centrosommedierede astrale MT'er og cellebarken. Tværtimod mangler museoocytter klassiske centrosomer og indeholder i stedet adskillige acentriolære MT-organiseringscentre (MTOC'er). På metafase I-stadiet har museoocytter to forskellige sæt MTOC'er: (1) MTOC'er, der er grupperet og sorteret for at samle spindelpoler (polære MTOC'er), og (2) metafase cytoplasmatiske MTOC'er (mcMTOC'er), der forbliver i cytoplasmaet og ikke bidrager direkte til spindeldannelse, men spiller en afgørende rolle i reguleringen af spindelpositionering og rettidig spindelmigration. Her beskrives en multifoton laserablationsmetode til selektivt at nedbryde endogent mærkede mcMTOC'er i oocytter indsamlet fra Cep192-eGfp-reportermus . Denne metode bidrager til forståelsen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for spindelpositionering og migration i pattedyrs oocytter.
Introduction
Haploide kønsceller (sæd og oocyt) produceres gennem meiose, hvilket indebærer en runde DNA-replikation efterfulgt af to på hinanden følgende divisioner, der er nødvendige for reduktion af kromosomtal inden befrugtning. Hos pattedyr, i det tidlige fosterliv, gennemgår oocyten en langvarig anholdelse (indtil puberteten) på diplotenstadiet af profase I i den første meiotiske division, et stadium kaldet germinal vesikel (GV) -stadiet. Efter meiotisk genoptagelse gennemgår GV-oocytten nuklear kuvertnedbrydning (NEBD), og spindlen samles hovedsageligt ved oocytcentret 1,2,3. Senere, drevet af F-actin, migrerer spindlen rettidigt fra oocytcentret til cortex for at sikre meget asymmetrisk opdeling, hvilket resulterer i et æg med et lille polært legeme (PB)4,5,6.
I mitotiske celler består centrosomerne af et par centrioler omgivet af pericentriolære materialekomponenter (PMC), såsom pericentrin, γ-tubulin, Cep152 og Cep1927. Disse centrioleholdige centrosomer bidrager til troskaben af bipolar spindeldannelse8. Imidlertid går centrioler tabt under tidlig oogenese i forskellige arter, herunder gnavere9. Derfor vedtager museoocytter en centrioleuafhængig spindelsamlingsvej ved hjælp af adskillige acentriolære mikrotubulus (MT) organiseringscentre (MTOC'er)9,10. Ved meiotisk genoptagelse gennemgår de perinukleære MTOC'er tre forskellige trin med genkondensering, strækning og fragmentering i et stort antal mindre MTOC'er11,12. De fragmenterede MTOC'er grupperes derefter og sorteres for at organisere en bipolar spindel10,13,14. En anden pool af MTOC'er er placeret i cytoplasmaet under NEBD. Nogle af disse cytoplasmatiske MTOC'er migrerer og danner spindelstænger (polære MTOC'er, pMTOC'er)10,11. For nylig blev en anden delmængde af cytoplasmatiske MTOC'er opdaget, kaldet metafase cytoplasmatiske MTOC'er (mcMTOC'er), der ikke bidrager til spindelpoldannelse, men forbliver i oocytcytoplasmaet under metafase I (Met I)15. Udtømning af mcMTOC'er ved multifotonlaserablation eller unormalt forøgelse af deres antal ved autofagihæmning forstyrrer spindelpositionering og migration og øger forekomsten af aneuploidi i metafase II oocytter15.
Interessant nok adskiller mcMTOC'er sig fra pMTOC'er i mange aspekter15. For eksempel, i modsætning til pMTOC'er, der hovedsageligt stammer fra perinukleære MTOC'er, stammer mcMTOC'er fra oocytbarken. Når spindlen stadig er i oocytcentret, lokaliseres mcMTOC'erne asymmetrisk modsat den side, som spindlen migrerer til for PB-ekstrudering15. Astrale mt'er kan ikke nå cortex i den relativt store oocytcelle. Derfor nukleerer disse mcMTOC'er MT'er for at forankre spindlen (via astrale lignende MTOC'er) til cortex. Disse resultater tyder på en model, hvor den mcMTOC-nukleerede MT-kraft modvirker den F-actin-medierede kraft, der driver spindelmigration mod cortex. Balancen mellem disse to modsatrettede kræfter er afgørende for at regulere den centrale spindelpositionering og rettidig spindelmigration15.
Til dato lokaliserer alle de undersøgte PMC-proteiner (pericentrin, g-tubulin, Cep192 og Aurora kinase A) til begge MTOC-puljer: mcMTOC'er og pMTOC'er15. Derfor er der ingen kemisk eller genetisk tilgang til selektivt at forstyrre mcMTOC'er uden forstyrrende pMTOC'er. Disse begrænsninger kan omgås ved selektivt at målrette mcMTOC'erne med laserablation. Blandt de laserbaserede teknologier, der er udviklet til mikroablation, viser pulserende multifoton femtosekundlasere stort potentiale på grund af deres præcisionspåvirkning begrænset til brændplanet, den høje penetrationsdybde af nær-infrarødt lys og den reducerede fototoksicitet og termiske skade på cellen16,17,18. Dette arbejde beskriver en selektiv tilgang til at ablate mcMTOC'er i museoocytter ved hjælp af en multifotonlaser koblet til et omvendt mikroskop.
Protocol
Alle de metoder, der er beskrevet her, blev godkendt af University of Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Cep192-eGFP reporter hunmus i alderen 6-8 uger blev brugt i denne undersøgelse. For at generere Cep192-eGFP-reportermus blev CRISPR/Cas9-medieret homologi-rettet reparation brugt til at integrere EGFP-reportergenet i CF-1-musegenomet. EGFP-reporteren blev smeltet sammen ved C-terminalen på Cep192 (en integreret del af MTOC'er)15. For at opretholde musekolonien blev homozygote Cep192-eGfp reportermus brugt. Alle dyrene blev holdt i bure (op til fire dyr/bur) ved 21 °C og 55% fugtighed, med en 12 timers lys/mørk cyklus og ad libitum adgang til mad og vand.
1. Samling af mus oocyt
- Tilbered kulturmediet (Chatot, Ziomek og Bavister, CZB19, se materialetabellen), og inkuber det ved 37 °C og 5% CO2 natten over.
BEMÆRK: CZB-mediet kan opbevares ved 4 °C i 1 måned (se supplerende fil 1 for mediesammensætningen). - Suppler CZB-mediet med glutamin (1 mM) og milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (se Materialetabel), og læg det i inkubatoren.
BEMÆRK: Milrinone er en phosphodiesterasehæmmer, der opretholder oocytterne arresteret ved profase I og forhindrer meiotisk genoptagelse20. - Opsamlingsmediet (bicarbonatfrit minimalt essentielt medium, MEM) indeholdende 3 mg/ml polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (supplerende fil 1) og milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, se materialetabellen).
- Forbered samlings- og kulturretterne, lav fire mikrodråber (100 μL) opsamlingsmedium (MEM / PVP + M) og to mikrodråber (100 μL) kultur (CZB + M) medium i henholdsvis 60 mm og 35 mm petriskåle og dæk dem med mineralolie (se materialetabel). Hold opsamlingsskålen på rutsjebanen varmere, og sæt kulturskålen i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- Intraperitonealt 5 IE af drægtige hoppers serumgonadotropin (PMSG, se materialetabellen) injiceres i seksuelt modne (6-8 uger gamle) Cep192-eGFP-reporterhunmus 44-48 timer før oocytopsamling.
- Ofr musene ved cervikal dislokation, identificer og fjern æggestokkene21, og overfør dem til et urglas, der indeholder forvarmet opsamlingsmedium (MEM / PVP + M) ved 37 ° C.
- Fastgør æggestokken ved at røre en 1 ml sprøjte til bunden af urglasset og punktere den flere gange (~ 40 gange pr. æggestok) ved hjælp af synåle bundtet sammen for at frigive oocytterne i mediet.
- Ved hjælp af en plastoverførselspipet overføres alt medium, der indeholder cumulus-oocytkomplekserne (COC'er), fra trin 1,7 til en tom 100 mm petriskål af plast.
- Under et stereomikroskop samles COC'erne ved hjælp af en Pasteur-glaspipet, og overfør dem til opsamlingsskålen, der indeholder MEM/PVP + M.
- Ved hjælp af en smal Pasteur-glaspipet (ca. 100 μm i diameter) denudes oocytterne mekanisk ved blid gentagen pipettering, efterfulgt af overførsel og vask af dem i fire mikrodråber (100 μL) MEM/PVP + M (opsamlingsskålen) inden deres overførsel til CZB + M-kulturskålen.
- De denuderede oocytter inkuberes i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2 i luften.
2. Oocytmikroinjektion
- Læg en 250 μL dråbe MEM/PVP + M i et 100 mm petriskålslåg af plast, og dæk det med mineralolie.
BEMÆRK: Petriskålens låg har en nedre kant, der giver mere plads til justering af mikromanipulatoren. - Tænd for mikroinjektionssystemet (se materialetabellen).
- Mikroinjektionsskålen anbringes på mikroskopets opvarmningstrin (37 °C).
- Injektionsnålen fyldes med 0,5 μL mCh-Cep192cRNA ved hjælp af mikroloaderpipettespidser (se Materialetabel), og fastgør kanylen til mikromanipulatoren.
- De denuderede oocytter (trin 1.11) overføres til mikrodråben på 250 μL (trin 2.1).
- Under en 20x eller 40x objektiv linse justeres injektionens position og fokus og holder nåle i henhold til oocytpositionen (figur 1).
- Opsæt mikroinjektionsenheden, og indstil injektionstrykket (p i), kompensationstrykket (pc) og injektionstiden (ti) for at kunne injicere 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA (for eksogent at mærke MTOC'erne).
- Indsprøjt forsigtigt oocytterne uden at røre kernen.
- Når alle oocytterne er injiceret, vaskes de i tre mikrodråber CZB + M, overføres til kulturskålen (CZB + M) og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C for at tillade mCh-Cep192-udtryk.
3. Oocytmodning
- Modningsmediet fremstilles ved at tilsætte glutamin (1 mM) til CZB-medium præ-ligevægtet i en inkubator med 5 % CO2 i luft ved 37 °C i mindst 3 timer.
- Lav to mikrodråber (100 μL) af modningsmediet i en 35 mm petriskål, og dæk dem med mineralolie (modningsskål).
- Vask profase I-arresterede oocytter mindst tre gange i 100 μL milrionfrie CZB-mikrodråber for fuldstændigt at fjerne milrinon og tillade meiotisk genoptagelse.
- Oocytterne overføres til modningsskålen, og dem inkuberes i 5 timer (prometafase I-trin) i en befugtet inkubator med 5 % CO2 i luft ved 37 °C.
4. Oocytpræparat til ablation og billeddannelse
- Prometafase I-oocytterne (trin 3.4) overføres til en glasbundskulturskål indeholdende 100 μL modningsmedium (trin 3.1) dækket med mineralolie.
5. Mikroskop forberedelse til ablation
- Mindst 30 minutter før ablation skal du tænde temperaturregulatoren for trininkubatoren (se Materialetabel) og indstille den til 37 °C.
- Tænd CO 2 -controlleren, og indstil den til 5% CO2.
- Vælg et 40x olienedsænkningsapokromatisk mål, og påfør en lille dråbe af nedsænkningsolien.
- Monter glasbundskulturskålen med oocytterne på en trin-top inkubator, og dæk inkubatoren med et gaslåg.
- I billedoptagelsessoftwaren (se materialetabellen) skal du vælge en indstilling, der gør det muligt at gemme flere fasepositioner (f.eks. "Definer mærke og find eksperiment"). Brug transmitteret lys brightfield belysning, centrer dig om de enkelte oocytter og gem deres positioner.
- I billedoptagelsessoftwaren skal du vælge XYZ-scanningstilstand , indstille billedformatet til 256 x 256 pixels, indstille zoomfaktoren til 2,5x - 3,0x og vælge en scanningsfrekvens på 600 Hz. Dette svarer til en pixelopholdstid på ca. 1,6 μs.
- Indstil en 488 nm excitationslaserlinje ved ca. 10% af lasereffekten (hvilket svarer til 4,0 μW på prøveniveau) (se Materialetabel), og brug en spektralbåndbredde på 500-550 nm til at observere GFP-signalet fra MTOC'erne. Til samtidig observation af fluorescens fra den mCherry-mærkede Cep192 indstilles en 585 nm excitationslaserlinje ved ca. 8% af lasereffekten (hvilket svarer til 10,7 μW på prøveniveau) og brug en anden detektor indstillet til en spektralbåndbredde på 595-645 nm.
BEMÆRK: Det er nyttigt at bruge konfokalmikroskopets transmitterede lysdetektor (TLD) til samtidig detektering af oocytgrænser. - Brug en live scanningstilstand og den manuelle styring af z-drevet til at screene oocytten for MTOC'er.
- Når en mcMTOC er registreret, skal du tegne et firkantet område af interesse (ROI) omkring det.
6. Ablation af mcMTOC'er
- Indstil en femtosekund laser til en bølgelængde på 740 nm.
BEMÆRK: Laserbølgelængden kan ændres i henhold til mikroskopet og laserforholdene. - Brug multifotonmikroskopets elektrooptiske modulator (se Materialetabel) til at indstille lasereffekten til 70%-80%, svarende til 60-70 mW effekt ved prøveplanet.
BEMÆRK: Hvis laseren er udstyret med en femtosekundpulskompensator, skal du bruge den til at korrigere for gruppeforsinkelsesdispersion (GDD). GDD-korrektion reducerer mængden af laserkraft, der kræves til effektiv mcMTOC-ablation, og minimerer fotoskader på oocyten. GDD-kontrollen er normalt integreret med billedoptagelsessoftwaren til kommercielle multifotonmikroskoper. - Brug det samme billedformat, zoomfaktor og scanningsfrekvens som i trin 5.6. Indstil linje- og rammegennemsnitsparametrene til 1.
- Klik på knappen Scan i softwaren for at udføre ablationen af mcMTOC ved at udføre en enkelt laserscanning af det valgte investeringsafkast.
- Brug kanalindstillingerne fra trin 5.7 til at gennemgå resultaterne af ablationen ved at sammenligne billederne af de GFP-mærkede strukturer taget før og efter multifotonlasereksponeringen. Hvis ablationen lykkes, falder intensiteten af GFP-fluorescensen i den målrettede mcMTOC til de niveauer, der observeres i baggrunden.
- Hvis der er nogle fragmenter af en GFP-mærkningsstruktur tilbage, gentages trin 6.4 en eller flere gange ved at fokusere på forskellige z-planer i mcMTOC.
- Brug kanalindstillingerne fra trin 5.7 til at kontrollere ablationseffektiviteten ved fuldstændigt tab af mcMTOC-tilknyttede mCherry-signaler (mCh-Cep192).
- Gentag trin 5.8 til trin 6.7, indtil alle MTOC'er for en oocyt (ved forskellige fokusplaner) er ablated.
BEMÆRK: Denne protokol bruger mCh-Cep192 mikroinjektion som en strategi til at bekræfte mcMTOC-udtømning efter multifotonlasereksponering og udelukke muligheden for, at tabet af GFP-fluorescens er forårsaget af GFP-fotoblegning. Imidlertid er mikroinjektionen af denne sonde valgfri og ikke nødvendig til ablationsproceduren.
Representative Results
Multifoton laserablation giver en effektiv metode til selektivt at ablate intracellulære strukturer. Den nuværende undersøgelse anvendte multifotonlaserablation til selektivt at nedbryde mcMTOC'er i museoocytter. Laserablation udtømte mcMTOC'erne effektivt, som det fremgår af reduktionen i den endogene GFP-fluorescens i de målrettede mcMTOC'er til et niveau, der kan sammenlignes med baggrunden. Eksogene mCh-Cep192 i de målrettede mcMTOC'er blev også afskaffet efter laserablation. Laserablationen af mcMTOC'er skal udføres på forskellige fokalplaner i oocytten (hvor mcMTOC'er er placeret, figur 2) for at sikre, at alle mcMTOC'er i oocytten er udtømt (figur 3).
Figur 1: Oocytmikroinjektion. Mikroinjektion af en profase I-arresteret museoocyt med mCh-Cep192 cRNA. Skala bar: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udtømning af mcMTOC'er i museoocytter. Repræsentative billeder af enkelte brændplaner. De hvide firkanter angiver en mcMTOC før og efter multifoton laserablation. Skala bar: 40 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Udtømning af mcMTOC'er ved forskellige fokusplaner i en museoocyt. Repræsentative maksimale projektionsbilleder af en mcMTOC-ablated museoocyt. Skala bar: 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Sammensætninger af Chatot, Ziomek og Bavister (CZB) og bicarbonatfrit minimalt essentielt medium (MEM/PVP). Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Der findes forskellige metoder til at forstyrre de cytoskeletrelaterede strukturer i celler22,23,24,25. Det er imidlertid udfordrende at finde effektive teknikker til selektivt at forstyrre den målrettede struktur uden at gå på kompromis med cellens levedygtighed. Multifoton laserablationsmetoden, der præsenteres her, er en effektiv strategi til at inducere en selektiv mekanisk forstyrrelse til mcMTOC'er i oocyten uden at ændre oocytens levedygtighed.
Laserablation er blevet brugt i vid udstrækning til at forstå de molekylære mekanismer, der styrer kromosomadskillelse under mitose og meiose22,23,26,27. På grund af den relativt store størrelse (>80 mm i diameter) af pattedyrs oocytter sammenlignet med somatiske celler28 udgør ablationen af deres intracellulære strukturer en udfordring. Desuden er det gennemsnitlige mcMTOC-volumen i metafase I-oocytter ~ 20 μm15, hvilket repræsenterer en yderligere udfordring. En effektiv metode, der giver dybere vævsindtrængning, skal vedtages for at overvinde disse udfordringer. Den største fordel ved at bruge multifotonlaseren til ablation er dens evne til at nå dybere ind i cellen og samtidig minimere off-target-effekter29.
For at verificere laserablationsmetodens effektivitet og effektivitet til at nedbryde den målrettede struktur anbefales det at anvende et fluorescerende mærket protein til at identificere den målrettede struktur over tid (før og efter ablation)23. Det er vigtigt at bemærke, at laserablation udtømmer hele mcMTOC som struktur, og selvom mindre mcMTOC'er kun kræver en enkelt lasereksponering for at blive udtømt, kan større mcMTOC'er kræve mere end en lasereksponering ved forskellige fokusplaner. Det anbefales også at fiksere og immunmærke en delmængde af kontrol og mcMTOC-ablated oocytter med en MTOC-markør (såsom γ-tubulin, pericentrin eller Cep192) for at bekræfte effektiviteten af mcMTOC-ablationen yderligere. I kontroloocytter vil områder af cytoplasmaet lige ved siden af, men ikke overlappende med mcMTOC'er, blive udsat for laseren.
Dette eksperiment kræver flere mcMTOC-ablationer, mens de bevæger sig mellem forskellige fokalplaner i oocytterne. Derfor anbefales det stærkt at øve denne teknik flere gange, før eksperimentet udføres for at minimere eksperimenttiden og derved øge oocytlevedygtigheden. Desuden er det vigtigt at bruge den minimale lasereffekt, der er tilstrækkelig til at nedbryde mcMTOC'erne uden at påvirke oocytlevedygtigheden.
Denne teknik har nogle begrænsninger. For det første er multifoton konfokale mikroskoper relativt dyrere end almindelige konfokale mikroskoper. For det andet er det mere tidskrævende at forstyrre alle mcMTOC'er på forskellige fokusplaner end kemiske eller genetiske forstyrrelser. For det tredje kræver denne protokol tekniske færdigheder til at ablate alle mcMTOC'er på kortest mulig tid. Men når den først er mestret, giver brugen af multifotonlaseren en fremragende strategi til at forstyrre flere intracellulære strukturer i museoocytter, herunder mcMTOC'er, hvilket bidrager til forståelsen af molekylære mekanismer, der regulerer spindelpositionering og dens rettidige migration i pattedyrs oocytter.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Balboula-laboratoriet for deres værdifulde hjælp og diskussioner. Forfatterne takker Melina Schuh for venligt at dele mCherry-Cep192-konstruktionen. Denne undersøgelse blev støttet af R35GM142537 (NIGMS, NIH) til AZB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle - MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 - 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
References
- Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
- Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
- Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
- Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
- Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
- Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
- Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
- Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
- Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
- Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
- Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
- Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
- Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
- Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
- Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
