Summary
Ett optimerat protokoll presenteras som möjliggör utarmning av cytoplasmatiska mikrotubuliorganiserande centra i musoocyter under metafas I med hjälp av en nära infraröd femtosekundlaser.
Abstract
Troheten hos oocytmeios är avgörande för att generera utvecklingskompetenta euploida ägg. Hos däggdjur genomgår äggcellen en lång arrestering vid profas I av den första meiotiska uppdelningen. Efter puberteten och vid meiotisk återupptagning demonteras kärnmembranet (kärnhöljets nedbrytning) och spindeln monteras huvudsakligen vid oocytcentret. Initial central spindelpositionering är avgörande för att skydda mot onormala kinetokore-mikrotubuli (MT) -fästen och aneuploidi. Den centralt placerade spindeln migrerar på ett tidskänsligt sätt mot cortex, och detta är en nödvändig process för att extrudera en liten polär kropp. I mitotiska celler är spindelpositionering beroende av interaktionen mellan centrosommedierade astrala MT och cellcortexen. Tvärtom saknar musoocyter klassiska centrosomer och innehåller istället många acentriolära MT-organiseringscentra (MTOC). I metafas I-stadiet har musoocyter två olika uppsättningar MTOC: er: (1) MTOC som är grupperade och sorterade för att montera spindelpoler (polära MTOC) och (2) metafas cytoplasmatiska MTOC (mcMTOC) som förblir i cytoplasman och inte bidrar direkt till spindelbildning men spelar en avgörande roll för att reglera spindelpositionering och snabb spindelmigration. Här beskrivs en multifotonlaserablationsmetod för att selektivt tömma endogent märkta mcMTOC i oocyter som samlats in från Cep192-eGfp-reportermöss . Denna metod bidrar till förståelsen av de molekylära mekanismer som ligger till grund för spindelpositionering och migration i däggdjurs oocyter.
Introduction
Haploida könsceller (spermier och äggceller) produceras genom meios, vilket innebär en omgång DNA-replikation följt av två på varandra följande uppdelningar som är nödvändiga för kromosomantalsminskning före befruktning. Hos däggdjur, under tidigt fosterliv, genomgår oocyten en lång arrestering (fram till puberteten) vid diplotenstadiet av profas I i den första meiotiska uppdelningen, ett stadium som kallas germinal vesikel (GV) -stadiet. Efter meiotisk återupptagande genomgår GV-oocyten kärnhöljesnedbrytning (NEBD) och spindeln monteras huvudsakligen vid oocytcentret 1,2,3. Senare, driven av F-aktin, migrerar spindeln i rätt tid från oocytcentret till cortex för att säkerställa mycket asymmetrisk uppdelning, vilket resulterar i ett ägg med en liten polär kropp (PB) 4,5,6.
I mitotiska celler består centrosomerna av ett par centrioler omgivna av peri-centriolära materialkomponenter (PMC), såsom pericentrin, γ-tubulin, Cep152 och Cep1927. Dessa centriolhaltiga centrosomer bidrar till troheten hos bipolär spindelbildning8. Centrioler förloras emellertid under tidig oogenes hos olika arter, inklusive gnagare9. Därför antar musoocyter en centrioloberoende spindelmonteringsväg med hjälp av många acentriolära mikrotubuli (MT) organiseringscentra (MTOC)9,10. Vid meiotisk återupptagning genomgår de perinukleära MTOC: erna tre distinkta steg av återkondensation, sträckning och fragmentering i ett stort antal mindre MTOC11,12. De fragmenterade MTOC:erna grupperas sedan och sorteras för att organisera en bipolär spindel10,13,14. En annan pool av MTOC finns i cytoplasman under NEBD. Några av dessa cytoplasmatiska MTOC migrerar och bildar spindelpoler (polära MTOC, pMTOC)10,11. Nyligen upptäcktes en annan delmängd av cytoplasmatiska MTOC, kallade metafascytoplasmatiska MTOC (mcMTOC), som inte bidrar till spindelpolbildning men förblir i oocytcytoplasman under metafas I (Met I)15. Utarmning av mcMTOC genom laserablation med flera fotoner eller onormalt ökande antal genom autofagihämning stör spindelpositionering och migration och ökar förekomsten av aneuploidi i metafas II-oocyter15.
Intressant nog skiljer sig mcMTOC från pMTOC i många aspekter15. Till exempel, i motsats till pMTOC, som huvudsakligen härrör från perinukleära MTOC, härstammar mcMTOC från oocytcortexen. När spindeln fortfarande är i oocytcentret är mcMTOC: erna lokaliserade asymmetriskt motsatta den sida till vilken spindeln migrerar för PB-extrudering15. Astralliknande MT kan inte nå cortex i den relativt stora äggcellen. Därför kärnar dessa mcMTOCs MTs för att förankra spindeln (via astralliknande MTOC) till cortex. Dessa fynd tyder på en modell där den mcMTOC-kärnbildade MT-kraften motverkar den F-aktinmedierade kraften som driver spindelmigration mot cortex. Balansen mellan dessa två motsatta krafter är avgörande för att reglera den centrala spindelpositioneringen och snabb spindelmigration15.
Hittills lokaliseras alla undersökta PMC-proteiner (pericentrin, g-tubulin, Cep192 och Aurora-kinas A) till båda MTOC-poolerna: mcMTOC och pMTOCs15. Därför finns det inget kemiskt eller genetiskt tillvägagångssätt för att selektivt störa mcMTOC utan störande pMTOC. Dessa begränsningar kan kringgås genom att selektivt rikta in sig på mcMTOC med laserablation. Bland de laserbaserade tekniker som utvecklats för mikroablation visar pulserade femtosekundlasrar med flera foton stor potential på grund av deras precisionspåverkan begränsad till fokalplanet, det höga penetrationsdjupet för nära infrarött ljus och den minskade fototoxiciteten och termiska skadorna på cellen16,17,18. Detta arbete beskriver ett selektivt tillvägagångssätt för att ablatera mcMTOC i musoocyter med hjälp av en multifotonlaser kopplad till ett inverterat mikroskop.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här godkändes av University of Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. nummer 9695). Cep192-eGFP reporter honmöss i åldern 6-8 veckor gamla användes i den aktuella studien. För att generera Cep192-eGFP-reportermöss användes CRISPR/Cas9-medierad homologistyrd reparation för att integrera EGFP-reportergenen i CF-1-musgenomet. EGFP-reportern smältes samman vid C-änden av Cep192 (en integrerad komponent i MTOC)15. För att upprätthålla muskolonin användes homozygota Cep192-eGfp-reportermöss . Alla djur hölls i burar (upp till fyra djur/burar) vid 21 °C och 55 % luftfuktighet, med en ljus/mörk cykel på 12 timmar och ad libitum tillgång till mat och vatten.
1. Mus oocytsamling
- Förbered odlingsmediet (Chatot, Ziomek och Bavister, CZB19, se materialtabellen) och inkubera det vid 37 °C och 5%CO2 över natten.
OBS: CZB-mediet kan förvaras vid 4 °C i 1 månad (se tilläggsfil 1 för mediekompositionen). - Komplettera CZB-mediet med glutamin (1 mM) och milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (se materialtabell) och placera det i inkubatorn.
OBS: Milrinone är en fosfodiesterashämmare som upprätthåller oocyterna som arresteras vid profas I och förhindrar meiotisk återupptagande20. - Bered uppsamlingsmediet (bikarbonatfritt minimalt essentiellt medium, MEM) som innehåller 3 mg/ml polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (tilläggsfil 1) och milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, se materialförteckningen).
- Förbered samlings- och odlingsrätterna, gör fyra mikrodroppar (100 μl) uppsamlingsmedium (MEM / PVP + M) och två mikrodroppar (100 μL) av kultur (CZB + M) medium i 60 mm respektive 35 mm petriskålar och täck dem med mineralolja (se materialtabell). Håll uppsamlingsskålen på bilden varmare och lägg odlingsskålen i inkubatorn vid 37 °C och 5%CO2.
- Injicera intraperitonealt 5 IE av dräktiga stos serumgonadotropin (PMSG, se materialförteckningen) i sexuellt mogna (6-8 veckor gamla) Cep192-eGFP reporter honmöss 44-48 h före äggcellsinsamling.
- Offra mössen genom cervikal dislokation, identifiera och avlägsna äggstockarna21 och överför dem till ett klockglas som innehåller förvärmt uppsamlingsmedium (MEM/PVP + M) vid 37 °C.
- Fixa äggstocken genom att röra en 1 ml spruta till botten av klockglaset och punktera den flera gånger (~ 40 gånger per äggstock) med hjälp av synålar buntade ihop för att frigöra oocyterna i mediet.
- Använd en plastöverföringspipett och överför allt medium som innehåller cumulus-oocytkomplexen (COC) från steg 1.7 till en tom 100 mm petriskål av plast.
- Under ett stereomikroskop samlar du COC: erna med en Pasteur-glaspipett och överför dem till uppsamlingsskålen som innehåller MEM / PVP + M.
- Använd en smal Pasteur-glaspipett (cirka 100 μm i diameter), denuderas oocyterna mekaniskt genom mild repetitiv pipettering, följt av överföring och tvättning av dem i fyra mikrodroppar av (100 μL) MEM / PVP + M (uppsamlingsskålen) innan de överförs till CZB + M-odlingsskålen.
- Inkubera de denuderade oocyterna i 1 timme vid 37 °C med 5 % CO2i luften .
2. Oocyt mikroinjektion
- Lägg en droppe MEM/PVP + M på 250 μl i ett 100 mm petriskålslock av plast och täck det med mineralolja.
OBS: Petriskålslocket har en nedre kant som ger mer utrymme för justering av mikromanipulatorn. - Slå på mikroinjektionssystemet (se materialförteckningen).
- Placera mikroinjektionsskålen på mikroskopets uppvärmningssteg (37 °C).
- Ladda injektionsnålen med 0,5 μL mCh-Cep192cRNA med hjälp av mikroladdarpipettspetsar (se materialförteckning) och säkra injektionsnålen på mikromanipulatorn.
- Överför de denuderade oocyterna (steg 1.11) till 250 μl mikrodroppen (steg 2.1).
- Under en 20x eller 40x objektivlins, justera injektionens position och fokus och hållnålar enligt oocytpositionen (figur 1).
- Ställ in mikroinjektionsenheten och ställ in injektionstrycket (p i), kompensationstrycket (pc) och injektionstiden (ti) för att kunna injicera 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA (för att exogent märka MTOCs).
- Injicera försiktigt oocyterna utan att röra kärnan.
- När alla oocyter har injicerats, tvätta dem i tre mikrodroppar CZB + M, överför dem till odlingsskålen (CZB + M) och inkubera dem i 3 timmar vid 37 ° C för att tillåta mCh-Cep192-uttryck.
3. Oocytmognad
- Bered mognadsmediet genom att tillsätta glutamin (1 mM) till CZB-medium som är förbalanserat i en inkubator med 5 %CO2 i luft vid 37 °C i minst 3 timmar.
- Gör två mikrodroppar (100 μl) av mognadsmediet i en 35 mm petriskål och täck dem med mineralolja (mognadsskål).
- Tvätta profas I-arresterade oocyter minst tre gånger i 100 μL milrinonfria CZB-mikrodroppar för att helt avlägsna milrinonen och tillåta meiotisk återupptagning.
- Överför oocyterna till mognadsskålen och inkubera dem i 5 timmar (prometafas I-steg) i en fuktad inkubator med 5%CO2 i luft vid 37 °C.
4. Oocytpreparat för ablation och avbildning
- Överför prometafas I-oocyterna (steg 3.4) till en odlingsskål med glasbotten som innehåller 100 μl mognadsmedium (steg 3.1) täckt med mineralolja.
5. Mikroskopberedning för ablation
- Minst 30 minuter före ablation, slå på temperaturregulatorn för steginkubatorn (se materialtabell) och ställ in den på 37 °C.
- Slå på CO 2-styrenheten och ställ in den på 5% CO2.
- Välj ett 40x apokromatiskt mål för oljedoppning och applicera en liten droppe av nedsänkningsoljan.
- Montera glasbottenodlingsskålen med oocyterna på en sceninkubator och täck inkubatorn med ett gaslock.
- I programvaran för bildförvärv (se materialförteckningen) väljer du ett alternativ som gör det möjligt att spara flera stegpositioner (t.ex. "Definiera märke och hitta experiment"). Använd överförd ljusfältbelysning, centrera på de enskilda oocyterna och spara deras positioner.
- I bildförvärvsprogrammet väljer du XYZ-skanningsläget , ställer in bildformatet till 256 x 256 pixlar, ställer in zoomfaktorn till 2,5x - 3,0x och väljer en skanningsfrekvens på 600 Hz. Detta motsvarar en pixeluppehållstid på cirka 1,6 μs.
- Ställ in en 488 nm excitationslaserlinje på cirka 10% av lasereffekten (vilket motsvarar 4,0 μW på provnivå) (se materialtabell) och använd en spektral bandbredd på 500-550 nm för att observera GFP-signalen från MTOCs. För samtidig observation av fluorescens från den mCherry-märkta Cep192, ställ in en 585 nm excitationslaserlinje på cirka 8% av lasereffekten (vilket motsvarar 10,7 μW på provnivå) och använd en annan detektor inställd på en spektral bandbredd på 595-645 nm.
OBS: Det är bra att använda konfokalmikroskopets överförda ljusdetektor (TLD) för att samtidigt detektera oocytgränser. - Använd ett live-skanningsläge och manuell kontroll av z-enheten, screena oocyten för MTOC.
- När en mcMTOC har upptäckts ritar du en kvadratisk region av intresse (ROI) runt den.
6. Ablation av mcMTOC
- Ställ in en femtosekundlaser på en våglängd på 740 nm.
OBS: Laservåglängden kan ändras enligt mikroskopet och laserförhållandena. - Använd den elektrooptiska modulatorn för multifotonmikroskopet (se materialtabell) för att ställa in lasereffekten till 70% -80%, vilket motsvarar 60-70 mW effekt vid provplanet.
OBS: Om lasern är utrustad med en femtosekundpulskompensator, använd den för att korrigera för gruppfördröjningsdispersion (GDD). GDD-korrigering minskar mängden laserkraft som krävs för effektiv mcMTOC-ablation och minimerar fotoskador på äggcellen. GDD-kontrollen är vanligtvis integrerad med bildförvärvsprogramvaran för kommersiella multifotonmikroskop. - Använd samma bildformat, zoomfaktor och skanningsfrekvens som i steg 5.6. Ställ in linje- och rammedelvärdesparametrarna till 1.
- Klicka på knappen Skanna i programvaran för att utföra ablationen av mcMTOC genom att utföra en enda laserskanning av den valda avkastningen.
- Använd kanalinställningarna från steg 5.7 för att granska resultaten av ablationen genom att jämföra bilderna av de GFP-märkta strukturerna som tagits före och efter laserexponeringen med flera fotoner. Om ablationen lyckas minskar intensiteten hos GFP-fluorescensen i den riktade mcMTOC till de nivåer som observerats i bakgrunden.
- Om några fragment av en GFP-märkningsstruktur kvarstår, upprepa steg 6.4 en eller flera gånger genom att fokusera på olika z-plan i mcMTOC.
- Använd kanalinställningarna från steg 5.7 för att verifiera ablationseffektiviteten genom fullständig förlust av mcMTOC-associerade mCherry-signaler (mCh-Cep192).
- Upprepa steg 5.8 till steg 6.7 tills alla MTOC för en oocyt (vid olika fokalplan) är ablerade.
OBS: Detta protokoll använder mCh-Cep192 mikroinjektion som en strategi för att bekräfta mcMTOC-utarmning efter laserexponering med flera fotoner och utesluta möjligheten att förlusten av GFP-fluorescens orsakas av GFP-fotoblekning. Mikroinjektionen av denna sond är emellertid valfri och krävs inte för ablationsproceduren.
Representative Results
Multifotonlaserablation ger en effektiv metod för att selektivt ablatera intracellulära strukturer. Den aktuella studien använde laserablation med flera fotoner för att selektivt tömma mcMTOC i musoocyter. Laserablation utarmade mcMTOC effektivt, vilket framgår av minskningen av den endogena GFP-fluorescensen i de riktade mcMTOC: erna till en nivå som är jämförbar med bakgrunden. Exogena mCh-Cep192 i de riktade mcMTOCs avskaffades också efter laserablation. Laserablationen av mcMTOC bör utföras vid olika fokalplan i oocyten (där mcMTOC finns, figur 2) för att säkerställa att alla mcMTOC i oocyten är utarmade (figur 3).
Figur 1: Oocytmikroinjektion. Mikroinjektion av en profas I-arresterad musoocyt med mCh-Cep192 cRNA. Skalstreck: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utarmning av mcMTOC i musoocyter. Representativa bilder av enstaka fokalplan. De vita rutorna indikerar en mcMTOC före och efter laserablation med flera fotoner. Skalstreck: 40 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Utarmning av mcMTOC vid olika fokalplan i en musoocyt. Representativa maximala projektionsbilder av en mcMTOC-ablated musoocyt. Skalstreck: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Kompositioner av Chatot, Ziomek och Bavister (CZB) och bikarbonatfritt minimalt essentiellt medium (MEM/PVP). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det finns olika metoder för att störa de cytoskelettrelaterade strukturerna i cellerna22,23,24,25. Att hitta effektiva tekniker för att selektivt störa den riktade strukturen utan att kompromissa med cellens livskraft är dock utmanande. Multifotonlaserablationsmetoden som presenteras här är en effektiv strategi för att inducera en selektiv mekanisk störning till mcMTOC i äggcellen utan att ändra oocytens livskraft.
Laserablation har använts i stor utsträckning för att förstå de molekylära mekanismerna som styr kromosomsegregering under mitos och meios22,23,26,27. På grund av den relativt stora storleken (>80 mm i diameter) av däggdjurs oocyter jämfört med somatiska celler28, representerar ablationen av deras intracellulära strukturer en utmaning. Dessutom är den genomsnittliga mcMTOC-volymen i metafas I-oocyter ~ 20 μm15, vilket representerar en ytterligare utmaning. En effektiv metod som erbjuder djupare vävnadspenetration måste antas för att övervinna dessa utmaningar. Den största fördelen med att använda multifotonlasern för ablation är dess förmåga att nå djupare in i cellen samtidigt som effekterna utanför målet minimeras29.
För att verifiera effekten och effektiviteten hos laserablationsmetoden för att tömma den riktade strukturen rekommenderas att man använder ett fluorescerande märkt protein för att identifiera den riktade strukturen över tid (före och efter ablation)23. Det är viktigt att notera att laserablation utarmar hela mcMTOC som en struktur, och även om mindre mcMTOC endast kräver att en enda laserexponering utarmas, kan större mcMTOC kräva mer än en laserexponering vid olika fokalplan. Det rekommenderas också att fixera och immunmärka en delmängd av kontroll- och mcMTOC-ablerade oocyter med en MTOC-markör (såsom γ-tubulin, pericentrisk eller Cep192) för att bekräfta effektiviteten hos mcMTOC-ablationen ytterligare. I kontrolloocyter kommer områden av cytoplasman precis intill men inte överlappande med mcMTOC att exponeras för lasern.
Detta experiment kräver flera mcMTOC-ablationer medan de rör sig mellan olika fokalplan i oocyterna. Därför rekommenderas det starkt att öva denna teknik flera gånger innan experimentet utförs för att minimera experimenttiden och därigenom öka oocytens livskraft. Dessutom är det viktigt att använda den minsta lasereffekten som är tillräcklig för att tömma mcMTOC utan att påverka oocytens livskraft.
Denna teknik har vissa begränsningar. För det första är konfokalmikroskop med flera foton relativt dyrare än vanliga konfokalmikroskop. För det andra är det mer tidskrävande att störa alla mcMTOC vid olika fokalplan än kemiska eller genetiska störningar. För det tredje kräver detta protokoll tekniska färdigheter för att ablatera alla mcMTOC på kortast möjliga tid. Men när den väl behärskas ger användningen av multifotonlasern en utmärkt strategi för att störa flera intracellulära strukturer i musoocyter, inklusive mcMTOC, vilket bidrar till förståelsen av molekylära mekanismer som reglerar spindelpositionering och dess snabba migration i däggdjurs oocyter.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla medlemmar i Balboula-laboratoriet för deras värdefulla hjälp och diskussioner. Författarna tackar Melina Schuh för att hon vänligt delade mCherry-Cep192-konstruktionen. Denna studie stöddes av R35GM142537 (NIGMS, NIH) till AZB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle - MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 - 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
References
- Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
- Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
- Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
- Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
- Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
- Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
- Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
- Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
- Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
- Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
- Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
- Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
- Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
- Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
- Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
