एमनियोटिक झिल्ली से लुमिकन निष्कर्षण और इसके भंडारण तापमान का निर्धारण
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एमनियोटिक झिल्ली (एएम) से लुमिकन के निष्कर्षण और इसके प्रोटीन और लुमिकन एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए 6, 12, 20 और 32 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पर एएम एक्सट्रैक्ट (एएमई) और कमरे के तापमान (आरटी) के रूप में उनकी भंडारण स्थितियों का वर्णन करता है।
Abstract
लुमिकन मानव एमनियोटिक झिल्ली (एएम) में एक छोटा ल्यूसीन युक्त प्रोटिओग्लाइकन है जो कॉर्नियल एपिथेलियलाइजेशन और कोलेजन फाइबर के संगठन को बढ़ावा देता है, कॉर्नियल पारदर्शिता बनाए रखता है। वर्तमान कार्य में, लुमिकन प्राप्त करने के लिए एएम से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक विधि प्रस्तावित है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न तापमानों और समय अवधि पर संग्रहीत एएम एक्सट्रैक्ट (एएमई) में लुमिकन की स्थिरता का मूल्यांकन किया जाता है। 100 मिलीग्राम एएम को पिघलाया गया और यांत्रिक डी-एपिथेलियलाइज्ड किया गया। डी-एपिथेलियलाइज्ड एएम को जमे हुए और कुचल दिया गया था जब तक कि एक महीन पाउडर प्राप्त नहीं किया गया था, जिसे प्रोटीज इनहिबिटर के साथ 2.5 एमएल खारा बफर के साथ घुलनशील किया गया था और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरने वाला 6, 12, 20 और 32 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान (आरटी) पर एकत्र और संग्रहीत किया गया था। बाद में, प्रत्येक एएमई में लुमिकन की मात्रा निर्धारित की गई थी। यह तकनीक एएम से लुमिकन निष्कर्षण के लिए एक सुलभ और स्वीकार्य प्रोटोकॉल की अनुमति देती है। लुमिकन एकाग्रता भंडारण समय और तापमान की स्थिति से प्रभावित थी। -20 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 12 दिनों के एएमई में लुमिकन अन्य एएमई की तुलना में काफी अधिक था। यह लुमिकन निष्कर्षण उपचार और दवा समाधान विकसित करने के लिए उपयोगी हो सकता है। पुन: उपकलाकरण और घाव भरने की प्रक्रिया में एएमई लुमिकन के उपयोग को निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।
Introduction
कॉर्नियल स्नेह के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले उपचारों में से एक एमनियोटिक झिल्ली प्रत्यारोपण है; हालांकि, हाल के वर्षों में, वैकल्पिक और सहायक उपचार के रूप में एमनियोटिक ऊतक के विभिन्न घटकों का उपयोग करने के लिए नए प्रस्ताव सामने आए हैं। एएम के सबसे अधिक अध्ययन किए गए घटकों में एएम एक्सट्रैक्ट (एएमई) 1,2,3,4,5,6,7 से प्राप्त किए गए हैं। एएम में कई घुलनशील कारक होते हैं जैसे एंटीएंजियोजेनिक प्रोटीन, इंटरल्यूकिन (आईएल), मेटालोप्रोटीनेस (टीआईएमपी) के ऊतक अवरोधक, टीएसजी -6 द्वारा मध्यस्थ विरोधी भड़काऊ प्रोटीन जो न्यूट्रोफिल बाह्य जाल को रोकते हैं, विकास कारक: एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर (टीजीएफ) (अल्फा और बीटा), केराटिनोसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ), हेपेटोसाइट ग्रोथ फैक्टर (एचजीएफ), और लुमिकन, जो कोलेजन फाइब्रिलोजेनेसिस1 को विनियमित करके कॉर्नियल पारदर्शिता बनाए रखता है। 2,3,4,5,6,7,8,9.
लुमिकन एक छोटा ल्यूसीन युक्त प्रोटीओग्लाइकन (एसएलआरपी) है, जो कॉर्नियल स्ट्रोमा मैट्रिक्स में अंतरालीय कोलेजनेज के मुख्य बाह्य घटकों में से एक है, जो कोलेजन फाइबर को व्यवस्थित करने और कॉर्नियल पारदर्शिता 4,10,11 को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार है। प्रोटिओग्लाइकेन्स बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में अणु हैं, जो सेल सिग्नलिंग करने और इंट्रासेल्युलर होमियोस्टेसिस12 को बनाए रखने में मुख्य हैं। घाव भरने के दौरान प्रसार, भेदभाव और प्रवासन की सेलुलर प्रक्रियाओं को चलाने के लिए ईसीएम प्रोटीन की सूचना दी गईहै।
साक्ष्य कॉर्नियल पुन: उपकलाकरण की प्रक्रिया में लुमिकन की संभावित भागीदारी को इंगित करता है। एक अध्ययन में, सैका एट अल ने दिखाया कि कॉर्नियल चोट के बाद, चोट के बाद पहले 8 घंटे और 3 दिनों के बीच कॉर्नियल केराटोसाइट्स में लुमिकन का पता लगाया जा सकता है। दूसरे और तीसरे दिन लुमिकन की उच्चतम सांद्रता प्रस्तुत करते हुए, यह प्रोटीओग्लाइकन बाद में सातवें दिन13 पर अज्ञात है। ये डेटा कॉर्नियल री-एपिथेलियलाइजेशन प्रक्रिया के सक्रियण में लुमिकन की भागीदारी का सुझाव देते हैं। दूसरी ओर, एक अन्य अध्ययन में, यह बताया गया था कि लुमिकन की अनुपस्थिति पुन: उपकलाकरण में देरी करती है; दिलचस्प बात यह है कि लुमिकन को जोड़ने से पुन: उपकलाकरण प्रक्रिया 4,11,13 में तेजी आ सकती है। इसी तरह, एक हालिया अध्ययन ने बताया है कि लुमिकन कॉर्नियल लिम्बस फाइब्रोब्लास्ट 14 के भड़काऊ कार्यों कोसंशोधित कर सकता है, जो भड़काऊ, एंटीफिब्रोटिक और पुन: उपकला प्रतिक्रिया के मॉड्यूलेटर के रूप में लुमिकन के लिए एक भूमिका का सुझाव देता है। इसी तरह, लुमिकन एफएएस-एफएएसएल जैसे सिग्नलिंग अणुओं के साथ बातचीत करके कॉर्नियल प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकता है। इसके अलावा, नॉकआउट लुम-/- माउस मॉडल में लुमिकन की अनुपस्थिति से पता चला है कि लुमिकन सिग्नलिंग की कमी पर्याप्त कॉर्नियल मरम्मत को रोकतीहै।
मुख्य रूप से, इस विधि का उद्देश्य एएम से लुमिकन निकालने के लिए एक व्यवहार्य और सुलभ तरीका प्रदर्शित करना है। लुमिकन निष्कर्षण की इस लाभप्रद विधि के साथ, प्रोटीन की समान सांद्रता प्राप्त करना संभव है, प्रसंस्करण समय को कम करना और पिछलेअध्ययनों की तुलना में जांचकर्ताओं के लिए इसे अधिक सुविधाजनक बनाना। इसके अलावा, इस एएमई लुमिकन का उपयोग कॉर्नियल मरम्मत और पुन: उपकलाकरण प्रक्रियाओं के लिए एक सहायक के रूप में किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, एएमई में लुमिकन की उपस्थिति और विभिन्न भंडारण स्थितियों के तहत इसकी स्थिरता के साथ इसका सीधा संबंध का विश्लेषण किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि जब एएमई में कुल प्रोटीन एकाग्रता की मात्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
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