Il presente protocollo descrive l'estrazione di lumican dalla membrana amniotica (AM) e le loro condizioni di conservazione come estratto AM (AME) a -20 °C, 4 °C e temperatura ambiente (RT) per 6, 12, 20 e 32 giorni per quantificare le sue proteine e la concentrazione di lumican.
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Articolo metodologico
Estrazione Lumican dalla membrana amniotica e determinazione della sua temperatura di conservazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lumican è un piccolo proteoglicano ricco di leucina nella membrana amniotica umana (AM) che promuove l'epitelizzazione corneale e l'organizzazione delle fibre di collagene, mantenendo la trasparenza corneale. Nel presente lavoro, viene proposto un metodo per l'estrazione di proteine da AM per ottenere lumican. Inoltre, viene valutata la stabilità del lumican nell'estratto AM (AME) conservato a diverse temperature e periodi di tempo. 100 mg di AM sono stati scongelati e deepitelizzati meccanicamente. L'AM deepitelizzato è stato congelato e frantumato fino ad ottenere una polvere fine, che è stata solubilizzata con 2,5 ml di tampone salino con inibitori della proteasi e centrifugata per l'estrazione delle proteine. Il surnatante è stato raccolto e conservato a -20 °C, 4 °C e temperatura ambiente (RT) per 6, 12, 20 e 32 giorni. Successivamente, il lumican è stato quantificato in ogni AME. Questa tecnica consente un protocollo accessibile e acquisibile per l'estrazione lumican da AM. La concentrazione di lumican è stata influenzata dal tempo di conservazione e dalle condizioni di temperatura. Lumican nell'AME di 12 giorni conservato a -20 °C e 4 °C era significativamente più alto rispetto ad altri AME. Questa estrazione lumicana potrebbe essere utile per lo sviluppo di trattamenti e soluzioni farmaceutiche. Sono necessari ulteriori studi per determinare gli usi di AME lumican nella riepitelizzazione e nel processo di guarigione delle ferite.
Introduzione
Uno dei trattamenti più utilizzati per le affezioni corneali è il trapianto di membrana amniotica; Tuttavia, negli ultimi anni, sono emerse nuove proposte per l'utilizzo di vari componenti del tessuto amniotico come trattamenti alternativi e adiuvanti. Tra i componenti più studiati dell'AM ci sono quelli ottenuti dall'estratto di AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM contiene molteplici fattori solubili come proteine antiangiogeniche, interleuchine (....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Review Board (Progetto n. CEI-2020/06/04). L'AM è stato ottenuto dall'Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (da soggetti umani non identificati), che è preparato come descritto da Chávez-García et al.17.
1. Preparazione dell'estratto della membrana amniotica
- Ottenere 100 mg di AM dalla banca amnion.
NOTA: Secondo un rapporto precedente, 50 mg di AM secernono un totale di 10 ng / mL di lumican14. Per ottenere una maggiore concentrazione di lumican, utilizzare 100 mg di AM, e....
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Risultati
I risultati sono riportati come valore medio ± deviazione standard (SD). Sono stati eseguiti i test t dello studente e l'analisi della varianza (ANOVA). Valori P < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando software di statistica (vedi Tabella dei materiali).
La quantità totale di proteine nell'AME è stata influenzata dal tempo e dalle condizioni di conservazione. La concentrazione proteica .......
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Discussione
In questo studio, la presenza di lumican è stata analizzata nell'AME e la sua correlazione diretta con la sua stabilità in diverse condizioni di conservazione. È interessante notare che, quando è stata quantificata la concentrazione totale di proteine in AME, la concentrazione proteica è aumentata dopo la conservazione. L'evidenza suggerisce tre meccanismi che potrebbero modificare la concentrazione proteica nella conservazione congelata: la denaturazione a freddo, la concentrazione congelata di soluti e lo sviluppo parz.......
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Dichiarazioni
Lo studio è stato finanziato dal Programma di sostegno per progetti di ricerca e innovazione tecnologica dell'Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Grant No. PAPIIT IN203821) e dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza, della Tecnologia e dell'Innovazione (Grant No. SECTEI 250/2019).
Ringraziamenti
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 N H2SO4 soluzione di arresto | R& D Sistemi | DY994 | |
| 100 μ micropipetta L | Eppendorf | ||
| 1000 μ L micropipetta | Eppendorf | ||
| 15 mm Piastra di Petri | Symlaboratorios | ||
| 18 G Ago (1,2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | ||
| provetta per microcentrifuga da 2 ml | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 ml | BD Becton Dickinson | ||
| 20 μ L micropipetta | Eppendorf | ||
| 20-200 μ Micropipetta L | Eppendorf | ||
| Provetta per microcentrifuga da 5 mL | Eppendorf | 30119401 | |
| Micropiastra a 96 pozzetti | SARSTEDT | 821581 | |
| Foglio di alluminio | N/A | N/A | |
| Membrana amniotica | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Soluzione salina bilanciata | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Becher | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | ||
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| completo, senza EDTA, Inibitore della proteasi compresse da cocktail | Roche | 11 873 580 001 | Inibitore della proteasi |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| Spettrometro a piastre ELISA | Thermo Labsystems& nbsp; | 35401106 | Prisma GraphPad |
| per congelatore | |||
| GraphPad Software, Inc | versione 9 | analisi statistica e programma grafico | |
| Kit ELISA DuoSet lumican umano | R& D Systems | DY2846-05 | di anticorpi di cattura Lumican umano |
| . | Forma Scientifica | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Microscopio a luce invertita | Olympus | 6A13921 | per confermare la disepitelizzazione Mod.CK2 |
| Cappa a flusso laminare | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Azoto liquido | N/A | N/A | |
| Biocan 20 | |||
| Asciugamani di carta | N/A | N/A | |
| Soluzione salina tamponata con fosfati | R& D Systems | DY006 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine di Lowry modificate Pierce | Thermo Scientific | 23240 | |
| Sigillanti per piastre | R& D Systems | DY992 | |
| Diluente per reagenti | R& D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μ m |
| filtrato centrifuga refrigerata | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Raschietto cellulare poliziotto in gomma | NEST | 710001 | per disepitelizzazione meccanica |
| Coltello bisturi | Braun | BB521 | n. 10 o 21 |
| Streptavidina-HRP 40 volte concentrato | R& D Systems | parte 893975 | |
| tetrametilbenzidina (TMB) per substrato | R& D Systems | DY999 | |
| Pinzetta dentata | Invent Germany | 6b | inox |
| Acqua ultrapura | PISA | ||
| Tampone di lavaggio | R& D Systems | WA126 | 0,05% Tween 20 in PBS, pH 7,2-7,4 |
Riferimenti
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K.
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Ristampe e permessi
