Mevcut protokol, lumikanın amniyotik membrandan () ekstraksiyonunu ve depolama koşullarını, proteinlerini ve lumikan konsantrasyonunu ölçmek için -20 ° C, 4 ° C’de ekstraktı (AME) ve 6, 12, 20 ve 32 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) olarak tanımlamaktadır.
Lumikan, insan amniyotik membranında () kornea epitelizasyonunu ve kollajen liflerinin organizasyonunu teşvik eden, kornea saydamlığını koruyan küçük bir lösin bakımından zengin proteoglikandır. Bu çalışmada, lumikan elde etmek için’den protein ekstraksiyonu için bir yöntem önerilmiştir. Ek olarak, farklı sıcaklık ve zaman periyotlarında depolanan ekstraktındaki (AME) lumikanın stabilitesi değerlendirilir. 100 mg çözüldü ve mekanik olarak epitelden arındırıldı. Deepitelize edilmiş, proteaz inhibitörleri ile 2.5 mL salin tamponu ile çözündürülen ve protein ekstraksiyonu için santrifüj edilen ince bir toz elde edilene kadar donduruldu ve ezildi. Süpernatant toplandı ve 6, 12, 20 ve 32 gün boyunca -20 ° C, 4 ° C ve oda sıcaklığında (RT) saklandı. Daha sonra, lumican her AME’de nicelleştirildi. Bu teknik,’den lumikan ekstraksiyonu için erişilebilir ve edinilebilir bir protokol sağlar. Lumikan konsantrasyonu depolama süresi ve sıcaklık koşullarından etkilendi. -20 ° C ve 4 ° C’de depolanan 12 günlük AME’deki Lumikan, diğer AME’lerden önemli ölçüde daha yüksekti. Bu lumican ekstraksiyonu, tedaviler ve farmasötik çözeltiler geliştirmek için yararlı olabilir. AME lumikan’ın reepitelizasyon ve yara iyileşme sürecindeki kullanımlarını belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Kornea etkileri için en çok kullanılan tedavilerden biri amniyotik membran transplantasyonudur; ancak son yıllarda amniyotik dokunun çeşitli bileşenlerinin alternatif ve adjuvan tedaviler olarak kullanılması için yeni öneriler ortaya çıkmıştır. ‘nin en çok çalışılan bileşenleri arasında ekstraktından (AME) elde edilenler 1,2,3,4,5,6,7’dir. , antianjiyojenik proteinler, interlökinler (IL), metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP’ler), nötrofil hücre dışı tuzaklarını inhibe eden TSG-6’nın aracılık ettiği anti-enflamatuar proteinler, büyüme faktörleri: epidermal büyüme faktörü (EGF), dönüştürücü büyüme faktörü (TGF) (alfa ve beta), keratinosit büyüme faktörü (KGF), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve kollajen fibrillogenezidüzenleyerek kornea saydamlığını koruyan lumikan gibi çoklu çözünür faktörler içerir 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumikan, kornea stroma matriksindeki interstisyel kollajenazın ana hücre dışı bileşenlerinden biri olan, kollajen liflerinin organize edilmesinden ve kornea saydamlığının korunmasından sorumlu olan küçük lösin bakımından zengin bir proteoglikan (SLRP) 4,10,11’dir. Proteoglikanlar, hücre dışı matriksteki (ECM) moleküllerdir ve hücre içi sinyalizasyonun gerçekleştirilmesinde ve hücre içi homeostazın korunmasında ana moleküllerdir12. ECM proteinlerinin yara iyileşmesi sırasında proliferasyon, farklılaşma ve göçün hücresel süreçlerini yönlendirdiği bildirilmiştir11.
Kanıtlar, lumikanın kornea reepitelizasyonu sürecine olası katılımını göstermektedir. Saika ve ark., bir çalışmada, kornea yaralanmasından sonra, kornea keratositlerinde lumikanın ilk 8 saat ile yaralanmadan sonraki 3 gün arasında tespit edilebileceğini göstermiştir. İkinci ve üçüncü günde en yüksek lumikan konsantrasyonunu sunan bu proteoglikan daha sonra yedinci gün13’te tespit edilemez. Bu veriler, lumikanın kornea reepitelizasyon sürecinin aktivasyonuna katılımını göstermektedir. Öte yandan, başka bir çalışmada, lumikan yokluğunun yeniden epitelizasyonu geciktirdiği; İlginçtir ki, lumikan eklenmesi yeniden epitelizasyon sürecini hızlandırabilir 4,11,13. Benzer şekilde, yakın tarihli bir çalışma, lumikanın kornea limbus fibroblastlarının14’ünün enflamatuar fonksiyonlarını modüle edebildiğini bildirmiştir, bu da lumikanın enflamatuar, antifibrotik ve yeniden epitelleştirici yanıtın bir modülatörü olarak rol oynadığını düşündürmektedir. Benzer şekilde, lumikan, Fas-FasL gibi sinyal molekülleriyle etkileşime girerek kornea tepkisini modüle edebilir. Ayrıca, nakavt bir Lum–/- fare modelinde lumikanın bulunmaması, lumikan sinyalinin eksikliğinin yeterli kornea onarımını engellediğini göstermiştir15.
Öncelikle, bu yöntem lumikanı’den çıkarmanın uygulanabilir ve ulaşılabilir bir yolunu göstermeyi amaçlamaktadır. Bu avantajlı lumikan ekstraksiyonu yöntemiyle, benzer konsantrasyonlarda protein elde etmek, işlem süresini azaltmak ve önceki çalışmalara kıyasla araştırmacılar için daha uygun hale getirmek mümkündür16. Ayrıca, bu AME lumikanı kornea onarımı ve yeniden epitelizasyon işlemleri için bir adjuvan olarak kullanılabilir.
Bu çalışmada, AME’de lumikanın varlığı ve farklı depolama koşulları altındaki stabilitesi ile doğrudan ilişkisi analiz edilmiştir. İlginç bir şekilde, AME’deki toplam protein konsantrasyonu ölçüldüğünde, protein konsantrasyonu depolamadan sonra artmıştır. Kanıtlar, dondurulmuş depodaki protein konsantrasyonunu değiştirebilecek üç mekanizma önermektedir: soğuk denatürasyon, çözünenlerin dondurulmuş konsantrasyonu ve protein yapısının buzla indüklenen kısmi açılması<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
100 μL micropipette | Eppendorf | ||
1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
20 μL micropipette | Eppendorf | ||
20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
Aluminum foil | N/A | N/A | |
Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
Beaker | N/A | N/A | |
BioRender | BioRender | figures design | |
Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
Freezer | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
Mortar | N/A | N/A | |
Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
Paper towels | N/A | N/A | |
Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
Ultrapure water | PISA | ||
Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |