Summary
המפרק המורכב של הקרסול (ASCJ) הוא ליבת כף הרגל וממלא תפקיד מפתח בבקרת שיווי המשקל בפעילויות יומיומיות. פציעות ספורט מובילות לעיתים קרובות לחוסר יציבות במפרק זה. כאן, אנו מתארים מודל עכברי של חוסר יציבות הנגרמת על ידי טראנסקציה של הרצועה של ASCJ.
Abstract
נקעים בקרסול הם אולי פציעות הספורט הנפוצות ביותר בחיי היומיום, ולעתים קרובות גורמות לחוסר יציבות של המפרק המורכב של הקרסול (ASCJ), ויכולות בסופו של דבר להוביל לדלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA) בטווח הארוך. עם זאת, בשל מורכבות מנגנון הפגיעה והביטויים הקליניים, כגון אקכימוזיס, המטומה או רגישות בכף הרגל הצידית, אין הסכמה קלינית על אבחון וטיפול באי יציבות ASCJ. מאחר שמבנה השלד והשרירים של העצמות והרצועות של כף הרגל האחורית של העכבר דומה לזה של בני אדם, מודל חייתי של חוסר יציבות ASCJ בעכברים נקבע על ידי טרנסקציה של רצועות סביב ASCJ. המודל אומת היטב באמצעות סדרה של מבחנים התנהגותיים וניתוחים היסטולוגיים, כולל בדיקת קרן איזון, ניתוח טביעת רגל (הערכה של רמת פעילות גופנית ויכולת שיווי משקל בעכברים), הערכת נוסיספציה תרמית (הערכה של תפקוד חושי כף הרגל בעכברים), סריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) וצביעת חתך של הסחוס המפרקי (הערכה של נזק לסחוס מפרקי וניוון בעכברים). ההקמה המוצלחת של מודל עכברי של חוסר יציבות ASCJ תספק התייחסות חשובה למחקר קליני על מנגנון הפציעה ותוביל לאפשרויות טיפול טובות יותר לנקע בקרסול.
Introduction
נקעים בקרסול הם אחת מפציעות הספורט הנפוצות ביותר בעולם. ההערכה היא כי 10,000 אנשים נפצעים מדי יום בארה"ב1, מתוכם פציעות הקשורות לספורט מהוות 15%-45%2. העלויות הרפואיות הכרוכות בטיפול בנקעים בקרסול בארצות הברית מסתכמות ב -4.2 מיליארד דולר בשנה 3,4,5. אי יציבות כרונית בכף הרגל היא בעיה נפוצה בעקבות נקעים בקרסול ומופיעה בכ-74% מנקעי הקרסול6, כולל חוסר יציבות בקרסול או תת קרקעי. עם זאת, בשל התסמינים והסימנים הקליניים הדומים, קשה לצוות הרפואי להבחין האם אי יציבות כרונית בקרסול מלווה גם באי יציבות כרונית של המפרק התת-קרקעי במרפאה, וכתוצאה מכך ניתן להחמיץ בקלות אי יציבות תת-קרקעית כרונית. לכן, השכיחות האמיתית של חוסר יציבות כרונית של מפרק תת-קרקעי בקרסול (ASCJ) (סוג מסוים של חוסר יציבות כרונית בכף הרגל הכוללת הן חוסר יציבות כרונית בקרסול והן אי יציבות תת-קרקעית כרונית) עשויה להיות גבוהה יותר מהדיווח 7,8,9. אם לא מטפלים בכך, חוסר יציבות כרוני של המפרק התת-קרקעי עלול לגרום לנקעים חוזרים ונשנים בקרסול, מה שמוביל למעגל קסמים של נקעים בקרסול ולחוסר יציבות כרוני של מורכבות הקרסול. אי יציבות כרונית ארוכת טווח של הקרסול-סובטלרי עלולה להוביל לניוון של ASCJ ולדלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית, אשר יכולה להשפיע על המפרקים הסמוכים במקרים חמורים10. במחלות אלה, הטיפול הקליני הנוכחי הוא שמרני בעיקרו, בנוסף לשיטות טיפול כירורגיות כגון תיקון רצועות ושחזור רצועות11,12.
ASCJ הוא מבנה הליבה של כף הרגל ושומר על איזון הגוף במהלך תנועה13. מחקר מקיף נערך על מבנה מפרק הקרסול והמפרק התת קרקעי בנפרד14,15,16,17. עם זאת, מחקר על כל מפרק הקרסול-subtalar הוא נדיר. כרבע מהמקרים של פגיעה בקרסול קשורים לפגיעה במפרק תת-קרקעי18. בשל מנגנון הפציעה המורכב של חוסר יציבות ASCJ, אין הסכמה על אבחון וטיפול בו במסגרת הקלינית. בהתחשב במצב הנוכחי של פציעות קרסול במרפאה, יש צורך בשיטה מדעית יותר כדי לחקור את הקרסול ואת המפרק subtalar בכללותו, ובכך לספק הבנה חדשה לחקר מחלות כף הרגל.
מכיוון שהמבנה האנטומי של כף הרגל האחורית של העכבר ברמת השלד והשרירים דומה לזה של כף הרגל האנושית 19, במספר מחקרים כבר יושמו מודלים של עכברים לחקר כף הרגל/קרסול10,19. Chang et al.19 פיתחו בהצלחה שלושה מודלים עכבריים שונים של דלקת מפרקים ניוונית בקרסול. בהשראת הביסוס המוצלח של אי יציבות הקרסול במודל העכבר, ביססנו מודל עכברי לאי-יציבות מורכבת תת-קרקעית של הקרסול, והנחנו כי הטרנסקציה של הרצועות החלקיות בכף הרגל האחורית של העכבר תגרום לאי יציבות מכנית של ASCJ, מה שיוביל לדלקת מפרקים ניוונית פוסט-טראומטית (PTOA) של ASCJ. מודל בעלי החיים של חוסר יציבות ASCJ יכול לשמש לטיפול הן באי יציבות הקרסול והן באי יציבות תת-קרקעית, אשר תואמת יותר את המצב הקליני בפועל מאשר מודל אי יציבות הקרסול הפשוטהמשמש כיום 7,8,9,19. כדי לבחון השערה זו, תוכננו שני מודלים עכבריים של חוסר יציבות הנגרמת על ידי מעבר רצועה של ASCJ. התוצאות עבור התפקוד החושי-מוטורי - בדיקת קרן האיזון, ניתוח טביעת הרגל והערכת נוסיספטציה תרמית - שימשו להערכת היתכנות המודל, וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) וצביעה היסטולוגית שימשו להערכת הנזק וההתנוונות של הסחוס המפרקי של העכבר. ההקמה המוצלחת של מודל עכברי של חוסר יציבות ASCJ לא רק מספקת הבנה חדשה לחקר מחלות כף הרגל, אלא גם מספקת התייחסות רבת ערך למחקר קליני על המנגנונים הקשורים לפציעה, מספקת אפשרויות טיפול טובות יותר לנקעים בקרסול, ומועילה למחקרים נוספים על המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סוצ'ו.
1. הליכים כירורגיים
- חלקו עכברים זכרים C57BL/6 בני 6 שבועות בני 6 שבועות לשלוש קבוצות: הרצועה הצווארית הרוחבית וקבוצת הרצועה הטאלופיבולרית הקדמית, קבוצת הרצועה הצווארית הרוחבית ורצועת הדלטואיד, וקבוצת ניתוחי הדמה. ודא שכל העכברים גודלו בסביבה העומדת בתקנים ספציפיים ללא פתוגן (SPF).
- התאקלמו את העכברים בסביבת הגידול החדשה (מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, וטמפרטורה ולחות קבועות של 18-22 מעלות צלזיוס ו-40%-70%, בהתאמה) במשך שבועיים לפני הניסוי. העבירו את העכברים לאימון קרן איזון והליכה, מעבר מקצה אחד של קרן שיווי משקל או צינור בצורת U לקצה השני ללא הפסקה, שבוע לפני הניסוי.
- בגיל 8 שבועות, מרדימים את העכבר באמצעות שאיפת איזופלורן על ידי הרטבת כדור צמר גפן עם 2 מ"ל של איזופלורן והכנסתו למיכל אטום לתנודתיות מלאה. עקוב אחר פעילות העכבר והמשך בשאיפה עד שפעילות העכבר פחתה באופן משמעותי. קבע את עומק ההרדמה על ידי צביטת אצבעות הרגליים של העכברים כדי לבחון את תגובותיהם. שאפו איזופלורן מאדה (2%) דרך מסכת פנים כדי לשמור על הרדמה בעכברים במהלך הניתוחים הבאים. השתמש משחת עיניים וטרינרית במהלך ההרדמה כדי למנוע את העיניים להתייבש.
- לאחר ההרדמה, להסיר את השיער על מפרק הקרסול של הגפיים האחוריות הימניות של העכבר עם מכונת גילוח, ולחטא את העור החשוף שלוש פעמים עם סיבובים לסירוגין של כדורי צמר גפן יוד וכדורי צמר גפן אלכוהול. מתן 5 מ"ג / ק"ג קרפרופן על ידי הזרקה תת עורית. העבירו את העכבר לחדר הניתוח של בעלי החיים באמצעות כרית כירורגית סטרילית.
- עבור קבוצת הרצועה הצווארית הרוחבית והרצועה הטאלופיבולרית הקדמית (CL + ATFL), יש לבצע חתך אורכי אלכסוני של 7 מ"מ כלפי מטה עם אזמל על העור מעל מפרק הקרסול הימני, ולבצע בדיקה עם מלקחיים ישרים מיקרוסקופיים לפני מפרק הקרסול.
- יש לוודא את חשיפת ה-ATFL בגבול התחתון של גוף הטלוס והפיבולה לאחר החיטוט ולחתוך אותו בעדינות בעזרת אזמל. הפרידו בין הגידים הפיבולריים הארוכים והקצרים לבין הגידים הארוכים של extensor digitorum longus, חשפו את ה-CL וחתכו אותו בעזרת אזמל.
- עבור קבוצת הרצועה הרוחבית CL + deltoid (DL), בצע חתך אנכי של 8 מ"מ על העור המדיאלי של מפרק הקרסול הימני והפריד בבוטות את ה- DL מה- malleolus המדיאלי כדי לחתוך אותו לבסוף. לאחר מכן, חתכו את ה-CL כמתואר בשלב 1.5.
- עבור קבוצת דמה (קבוצת ניתוחי דמה), בצע ניתוח דמה במפרק קרסול ימין אך אל תחתוך רצועות.
- שוטפים את החתך במי מלח רגילים סטריליים ותופרים אותו בחוט ניילון כירורגי 5-0. לבסוף, לחטא את החתך תפור עם כדור צמר גפן יוד.
- שמור על העכבר תחת השגחה עד שהוא יכול לשמור על עצם החזה, והשגיח עד שהוא בהכרה מלאה. יש לחטא את החתך בקרסול פעמיים ביום עם כדור צמר גפן יוד ולתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת עורית), פעם ביום למשך שבוע. מאחור לבד לאחר הניתוח, ולשים לב היטב למצב שלאחר הניתוח של העכבר.
- שבועיים לאחר הניתוח וכאשר הנפיחות במפרק הקרסול פחתה, יש להתחיל לאמן את העכברים במכונת העייפות הסיבובית של העכבר במשך שעה אחת בכל יום.
2. מבחן קרן איזון
- מהדקים קורת עץ עגולה באורך 1 מ' וקוטר 20 מ"מ, נטויה ב-15° בקצה אחד, עם תפס חצובה לצילום, ומניחים את הקצה השני על משטח עבודה המחובר לקסטה סגורה.
- בצע אימון קרן שיווי משקל שבוע לפני הניתוח כדי להבטיח שהעכברים ינועו בצורה חלקה מקצה אחד של הקרן לקצה השני. חשבו על עכבר שעבר את המבחן כאשר הוא עובר דרך הקרן פעמיים ב-60 שניות מבלי להשהות.
- בצע שני ניסויים רצופים עבור כל עכבר ורסס את קרן האיזון עם 75% אלכוהול לאחר כל ניסוי כדי למנוע את שאריות הריח של העכבר הקודם מלהשפיע על העכבר הבא.
- יש לבצע את בדיקת קרן האיזון לפני הניתוח, 3 ימים, שבוע, 4 שבועות, 8 שבועות ו-12 שבועות לאחר הניתוח. רשום את הזמן הממוצע של כל עכבר העובר את קרן שיווי המשקל פעמיים ברציפות ואת מספר הפעמים שרגל ימין האחורית מחליקה מהקרן כמשתנים תלויים.
3. ניתוח טביעת רגל
- מניחים על שולחן הניסוי תעלת פלסטיק בצורת U באורך של 50 ס"מ, רוחב של 10 ס"מ וגובה של 10 ס"מ ומחברים קצה אחד של תעלת הפלסטיק לקסטה סגורה.
- הניחו נייר פיגמנט רגיל שטוח בתעלה, ולאחר מכן החזיקו את העכבר בשתי ידיו וצבעו את רגליו הקדמיות והאחוריות באופן שווה בפיגמנט אדום וירוק שאינו רעיל.
- הניחו את העכבר הצבוע בעדינות בקצה אחד של הערוץ ותנו לו לעבור לקצה השני של הקלטת. הוציאו את הנייר הפיגמנטי עם טביעות הרגליים החוצה, סמנו אותו והניחו אותו על מדף לייבוש במקום מאוורר ומוצל.
- לאחר שכל עכבר עובר, רססו את תעלת הפלסטיק בצורת U ב-75% אלכוהול כדי למנוע משאריות הריח של העכבר הקודם להשפיע על העכבר הבא.
- בחר שלוש טביעות רגל רצופות של עכבר ברור על כל נייר, והשתמש בסרגל כדי למדוד את אורך הצעד של טביעת הרגל של כף רגלו הימנית של העכבר, וכן את רוחב הצעד בין טביעת הרגל השמאלית והימנית.
4. הערכת nociception תרמית
- במהלך הניסוי, השתמש במבחן הפלנטרי כדי לרשום את זמן התגובה התרמית של רגל העכבר ואת זמן התגובה של העכבר במהלך פעילות ומנוחה, בהתאמה. הקלט את נתוני המדידה תוך שניות.
- הניחו את העכבר במכשיר המדידה, יישרו את המכשיר עם רגלו הימנית והתחילו לחמם את המכשיר כשהטמפרטורה עולה לאט. שימו לב לתגובת העכבר. כאשר הטמפרטורה עולה מעל הסיבולת, העכבר ימשוך במהירות או ילקק את רגלו הימנית. הקלט את השעה באמצעות המכשיר והגדר את השעה כזמן התגובה במהלך הפעילות.
- כדי למדוד את זמן התגובה במנוחה, אפשר לעכבר לשבת במשך 30 דקות על שולחן המנוחה ללא חימום, ולאחר מכן קבל את נתוני הזמן כפי שמוסבר בשלב 4.2. השתמש בנתונים זמניים שנרכשו אלה לניתוח הבא.
5. סריקת Micro-CT
- הרדימו עכברים בני 12 שבועות עם פחמן דו חמצני לאחר הניתוח, קלפו את עור קרסוליהם הימניים, ולאחר מכן חתכו את השוקה האמצעית ואת הפיבולה שלהם במספריים כירורגיים כדי לקבל דגימות קרסול שלמות. הניחו את הדגימות בצינורות צנטריפוגות מסומנים של 15 מ"ל המכילים 10% פורמלין נייטרלי למשך 48 שעות.
- לאחר הקיבוע, הניחו את הדגימות באצוות (ארבע דגימות בכל אצווה) במיכל ספוג מיוחד לסריקת מיקרו-CT. הגדר את פרמטרי המכונה כדלקמן: מתח = 50 קילו וולט, זרם = 200 mA, מסנן = 0.5 מ"מ ורזולוציה = 9 מיקרומטר. הפעל את סורק המיקרו-CT.
- לאחר הסריקה, השתמש בתוכנת השחזור כדי לתחום את טווח התמונה, ובחר מיקום זווית מסוים לאחר התאמת ציר XYZ של התמונה המסומנת באמצעות תוכנה מסחרית לניתוח נתונים, כמתואר ב- Liu et al.10.
- השתמש בתוכנת ניתוח מיקרו-CT כדי לבחור אזורי עניין רציפים של 10 שכבות בתמונות המחודשות שהותאמו על ידי צירי XYZ, ולנתח כמותית את המפרקים הדרושים כדי לקבוע את מקטע נפח העצם (BV/TV), כמתואר ב- Liu et al.10.
- לבסוף, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה רפואית תלת מימדית כדי לבצע עיבוד תמונה תלת מימדי CT של מפרקי קרסול העכבר, כמתואר ב- Liu et al.10. לאחר השחזור, לבחון את השחיקה ואת היווצרות של אוסטאופיטים ב ASCJ.
6. צביעת חתך של סחוס מפרקי
הערה: כל שלבי הצביעה מבוצעים במכסה אדים, ומסכה נלבשת במהלך ההליך.
- השתמשו בפינצטה מיקרוסקופית ובמספריים כדי להסיר עודפי רקמה רכה סביב דגימות הקרסול, ולאחר מכן הניחו את הדגימות בצינור צנטריפוגה המכיל 10% תמיסת הסתיידות EDTA שהוכנה עם 44 גרם NaOH, שתי חבילות PBS ו-400 גרם EDTA-2Na, כאשר ה-pH מותאם ל-7.35-7.45 עם חומצה הידרוכלורית, וסמנו את הקבוצות השונות.
- לאחר מכן, הניחו את צינור הצנטריפוגה על שולחן ניעור (מהירות מוגדרת ל-20 סל"ד) לצורך הסתיידות והחליפו את תמיסת ההסתיידות פעם ביום. לקבוע את decalcification של הדגימות.
- לאחר חודש אחד של הסתיידות, לייבש את הדגימות עם אלכוהול הדרגתי ולאחר מכן להשתמש n-butanol במשך 8 שעות למטרות ניקוי. לבסוף, לטבול את הדגימות שסולקו בפרפין במצב קורונלי להטמעה.
- הניחו את דגימות הפרפין במקרר בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר. לפני החיתוך, קחו את הדגימות מהמקרר בטמפרטורה של 4°C והכניסו אותן למקפיא של -20°C למשך כ-10 דקות כדי להקל על חיתוך המישור השלם.
- מקבעים את הדגימות על המיקרוטום וחותכים אותן בעובי של 6 מיקרומטר. במקביל, השתמש במיקרוסקופ כדי לבחון אם הדגימות נחתכו ברמה הקלה הצפויה של מחט מזרק לתוך רקמת העצם.
- כוונן מראש את טמפרטורת המים של מכונת הטבליה ל- 40 °C. לאחר מכן, חותכים שניים עד שלושה חלקי פרפין שלמים בשורה ומעבירים אותם למכונת הטבליה להרחבה מלאה. לאחר מכן, להסיר את קטעי פרפין עם מגלשת זכוכית לנקז את המים. לבסוף, סמן את השקופיות בקבוצות ובמספרים.
7. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
- מניחים את המקטעים באינקובטור של 60 מעלות צלזיוס כך שניתן יהיה לצפות במבנה המפרק השלם של ASCJ תחת המיקרוסקופ ואופים את המקטעים במשך 40-50 דקות. לאחר מכן, הסר את החלקים בשעווה עם קסילן 3x, ממוספרים כ- I, II ו- III לזיהוי קל, למשך 15 דקות, 15 דקות ו- 10 דקות, בהתאמה.
- הניחו את החלקים נטולי השעווה ב-100% אתנול 2x, ממוספרים כ-I ו-II לזיהוי קל, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 3 דקות, 3 דקות, 5 דקות ו-5 דקות, בהתאמה. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים פעמיים (ddH2O) במשך 5 דקות.
- לאחר השריה עם hematoxylin במשך 1 דקות, לשטוף את החלקים עם ddH2O עד שהם הופכים חסרי צבע. השרו את החלקים בתמיסת התמיינות אתנול חומצי 1% למשך 30 שניות ושטפו אותם 3x למשך דקה אחת עם ddH2O. לאחר מכן, מכתימים את החלקים בתמיסת אמוניה 1% למשך דקה אחת, ולאחר מכן שוטפים 3x למשך דקה אחת כל אחד עם ddH2O.
- לאחר מכן, להכתים את הדגימות עם תמיסת צביעת eosin במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשים אותם 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 1 דקות כל אחד ברצף. לבסוף, לטפל בחלקים עם קסילן IV במשך 1 דקות.
- יבשו את המקטעים באוויר, הדביקו טיפת שרף נייטרלי על הדגימות שעל המגלשות וכסו אותן בחלקת כיסוי. לאחר מכן, צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר במהירות של 5x ו- 20x.
8. ספרנין O-fast כתמים ירוקים
- מכניסים את החלקים שנבחרו לאינקובטור בטמפרטורה של 60 מעלות ואופים את הנתחים במשך 40-50 דקות. לאחר מכן, יש להסיר את החלקים עם קסילן I, II ו-III למשך 15 דקות, 15 דקות ו-10 דקות, בהתאמה.
- מניחים את החלקים ללא שעווה ב-100% אתנול I, II, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 3 דקות, 3 דקות, 5 דקות ו-5 דקות, בהתאמה. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם ddH2O במשך 5 דקות.
- לאחר השריה עם hematoxylin במשך 1 דקות, לשטוף את החלקים עם ddH2O עד שהם הופכים חסרי צבע. השרו את החלקים בתמיסת התמיינות אתנול חומצי 1% למשך 30 שניות ושטפו אותם 3x למשך דקה אחת עם ddH2O. לאחר מכן, הכתימו את החלקים בתמיסת אמוניה 1% למשך דקה אחת, ושטפו אותם 3x למשך דקה אחת כל אחד עם ddH2O.
- השרו את החלקים ב-0.05% ירוק מהיר למשך 2 דקות, ולאחר מכן השרו את החלקים בתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 30 שניות וב-0.1% ספרנין למשך 5 דקות. הניחו את הדגימות המוכתמות ב-95% אתנול ו-100% אתנול למשך דקה, אחת אחרי השנייה.
- לבסוף, לטפל בחלקים עם קסילן IV במשך 1 דקות. יבשו את המקטעים באוויר, הדביקו טיפת שרף נייטרלי על הדגימות שעל המגלשות וכסו אותן בחלקת כיסוי. לאחר מכן, צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר במהירות של 5x ו- 20x.
9. אימונוהיסטוכימיה
- יום 1: מניחים את החלקים שנבחרו באינקובטור של 60 מעלות צלזיוס, אופים את החלקים במשך 40-50 דקות, ולאחר מכן מסירים אותם בשעווה עם קסילן I, II ו- III במשך 15 דקות, 15 דקות ו- 10 דקות, בהתאמה. מניחים את החלקים ללא שעווה ב-100% אתנול I, II, 90% אתנול ו-80% אתנול למשך 3 דקות, 3 דקות, 5 דקות ו-5 דקות, בהתאמה. לאחר מכן, שטפו את החלקים עם ddH2O במשך 5 דקות, השתמשו בעט היסטוכימי כדי להקיף את שטח הדגימה, והניחו אותם בקופסה כהה.
- שליפת אנטיגן: יש לזרוק 20-50 μL של 0.25% טריפסין לאזור הדגימה המעוגלת, לדגור באינקובטור של 37°C למשך 60 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות 3x למשך 2 דקות כל אחת עם PBS. חסום peroxidase אנדוגני על ידי הוספת 3% H 2 O 2, לדגור את הדגימות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן לשטוף אותם 3x במשך2דקות כל אחד עם PBS. בצעו חסימת סרום על ידי הוספת סרום עיזים 10% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן דגרו עם הנוגדן הראשוני (קולגן עכבר נגד עכבר מסוג II, מדולל 1,000 פעמים) בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
- יום 2: חממו מחדש את המקטעים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשחזר את הנוגדן העיקרי ולשטוף את חלקים 3x במשך 2 דקות כל אחד עם PBS. לדגור עם הנוגדן המשני במשך 40 דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את החלקים 3x במשך 2 דקות כל אחד עם PBS.
- פיתוח צבע DAB: הוסף 5 מ"ל של ddH 2 O, שתי טיפות חיץ, ארבע טיפות DAB ושתי טיפות של H 2 O2כדי להכין את מגיב DAB. הוסף 20-50 μL של מגיב לחלקים, לשמור על הדגימות מוגן מפני אור במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את החלקים במשך 2 דקות עם ddH2O.
- לאחר השריה עם hematoxylin במשך 1 דקות, לשטוף את החלקים עם ddH2O עד שהם הופכים חסרי צבע. השרו את החלקים בתמיסת התמיינות אתנול חומצי 1% למשך 30 שניות ושטפו אותם 3x למשך דקה כל אחד עם ddH 2 O. צבעו את החלקים למשך דקה אחת בתמיסת אמוניה 1%, ולאחר מכן שטפו אותם 3x למשך דקה אחת כל אחד עם ddH2O.
- לאחר מכן, מניחים את החלקים באתנול 95% ו -100% אתנול, בהתאמה, למשך דקה אחת כל אחד. לבסוף, לדגור את החלקים במשך 1 דקות עם xylene IV. יבשו את המקטעים באוויר, הדביקו טיפת שרף נייטרלי על הדגימות שעל המגלשות וכסו אותן בחלקת כיסוי. לאחר מכן, צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר במהירות של 5x ו- 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הניתוח הסטטיסטי של נתוני המתאם בוצע באמצעות כלי ניתוח סטטיסטיים מקוונים. הנתונים שעמדו בשני המבחנים של התפלגות נורמלית והומוגניות השונות שימשו לניתוח סטטיסטי נוסף על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות. אם הנתונים לא עמדו בשני המבחנים, מבחן קרוסקל-וואליס שימש לניתוח סטטיסטי. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן (SD), ו-p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
בדיקת קרן איזון
הניתוח הסטטיסטי של הזמן הממוצע שנדרש לכל עכבר לעבור דרך קרן שיווי המשקל פעמיים בכל שלב הראה כי לא היו הבדלים סטטיסטיים בזמן שנדרש לכל קבוצת עכברים לעבור את קרן שיווי המשקל לפני הניתוח (p = 0.73). שלושה ימים לאחר הניתוח, לעכברים בקבוצות CL + ATFL ו- CL + DL נדרש זמן רב יותר לעבור דרך קרן האיזון בהשוואה לעכברים בקבוצת הדמה, וההפרש היה מובהק סטטיסטית (p < 0.05). ארבעה שבועות לאחר הניתוח, לא נצפו הבדלים משמעותיים בזמן שלקח לעכברים בקבוצות CL + ATFL ו- CL + DL לעבור את קרן האיזון בהשוואה לעכברים בקבוצת הדמה (p > 0.05). יתר על כן, 8 שבועות ו -12 שבועות לאחר הניתוח, העכברים בקבוצות CL + ATFL ו- CL + DL נזקקו לזמן רב יותר כדי לעבור את קרן האיזון בהשוואה לעכברים בקבוצת הדמה, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (p < 0.01). לא נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בזמן שלקח לעכברים בקבוצת CL + ATFL לעבור את קרן האיזון בהשוואה לעכברים בקבוצת CL + DL בכל תקופת בדיקה (p > 0.05; איור 1A).
מספר הפעמים שרגלו האחורית הימנית של העכבר החליקה דרך קרן שיווי המשקל לא היה שונה סטטיסטית בין שלוש קבוצות העכברים לפני הניתוח (p = 0.68). יתר על כן, לא נצפו הבדלים משמעותיים במספר המקטעים של כף הרגל האחורית הימנית עבור העכברים בקבוצות CL + ATFL ו- CL + DL בהשוואה לעכברים בקבוצת הדמה 3 ימים לאחר הניתוח. לגבי נקודות זמן אחרות לאחר הניתוח, מספר המקטעים בקבוצת הטרנססקציה של הרצועה היה גבוה יותר בהשוואה לזה של העכברים בקבוצת הדמה, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (p < 0.05). לאחר 8 שבועות ו-12 שבועות לאחר הניתוח, מספר הפעמים שכף רגל ימין האחורית בקבוצת CL + ATFL החליקה מקרן שיווי המשקל היה גבוה מזה של העכברים בקבוצת CL + DL, וההפרש היה מובהק סטטיסטית (p < 0.05; איור 1B).
ניתוח טביעת רגל
אורך הצעד של העכברים בכל קבוצה גדל עם הגיל, אך קטיעת רצועות עלולה לקצר את אורך הצעד. לא נצפו הבדלים משמעותיים באורך הצעד של כף רגל ימין האחורית בין שלוש קבוצות העכברים לפני הניתוח (p > 0.05). בבדיקת ההליכה 12 שבועות לאחר הניתוח, אורך הצעד של כף רגל ימין האחורית בקבוצת חתך הרצועה היה קצר יותר בהשוואה לקבוצת הדמה באותה תקופה, וההפרש היה מובהק סטטיסטית (p < 0.01). עם זאת, אורך הצעד של כף רגל ימין אחורית עבור העכברים בקבוצת CL + ATFL לא היה שונה באופן משמעותי מזה של העכברים בקבוצת CL + DL (p > 0.05; איור 2A,B).
הערכת nociception תרמית
הניתוח הסטטיסטי של זמן התגובה התרמית של כפות הרגליים של העכברים במהלך הפעילות הראה כי לא היו הבדלים סטטיסטיים בזמני התגובה של שלוש קבוצות העכברים לפני הניתוח (p > 0.5). בהערכת התפיסה התרמית לאחר הניתוח, זמני התגובה של העכברים בקבוצת חיתוך הרצועה היו ארוכים יותר מאלה של העכברים בקבוצת הדמה באותה תקופה, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (p < 0.01; איור 3).
סריקת Micro-CT
שנים עשר שבועות לאחר הניתוח, מיקרו-CT שימש לניתוח כמותי של ASCJ של כף רגל ימין האחורית עבור העכברים בכל קבוצה. שחזור תלת מימדי של תמונות ה-CT הראה כי ה-ASCJ של כף רגל ימין האחורית בשתי הקבוצות עם רצועות קטועות היה מחוספס יותר מזה שבקבוצת הדמה. פני המפרק היו קעורים, קמורים ושטוחים, היו סימני שחיקה ברורים, אוסטאופיטים נוצרו סביב המפרקים, והמפרקים הראו שינויים ניווניים. נוסף על כך, כ-28.6% מהעכברים בקבוצת CL + DL פיתחו נקע טאלוס (איור 4A,B)10. מקטע נפח העצם של ASCJ של כף רגל ימין אחורית בקבוצות CL + ATFL ו- CL + DL היה גבוה משמעותית מאשר בקבוצת הדמה, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (p < 0.01; איור 4C,D)10.
צביעת חתך של הסחוס המפרקי
צביעה ירוקה מהירה של H&E וספרנין הראו כי מבנה ה-ASCJ של העכברים בקבוצת הדמה היה שלם, המורפולוגיה של הסחוס הייתה שלמה, והכונדרוציטים התפזרו באופן שווה. שכבת הסחוס של ASCJ של שתי קבוצות העכברים עם חתכי רצועות הראתה חוסר רציפות ברור, ומספר הכונדרוציטים ירד (איור 5A,B)10. שיטת הניקוד הבינלאומית של Mankin and Osteoarthritis Research Society International (OARSI) שונתה שימשה כדי לדרג את הצביעה הירוקה המהירה של H&E וספרנין O-fast של ASCJ עבור העכברים בכל קבוצה20,21,22. ציון מנקין המתוקן נקבע על פי מאפייני מבנה הסחוס ומספר וצביעת הכונדרוציטים, וציון OARSI נקבע על פי הציון ההיסטופתולוגי והשלב של הסחוס. הציונים של שתי קבוצות העכברים עם קטיעת רצועה היו גבוהים יותר מאלה של העכברים בקבוצת הדמה, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (p < 0.05; איור 5C-F)10.
תמונות של צביעה אימונוהיסטוכימית טיפוסית של קולגן מסוג II הראו שתכולת הקולגן מסוג II בשכבת הסחוס המפרקי ASCJ של כף הרגל האחורית הימנית בקבוצת הדמה הייתה אחידה יותר מזו של שתי קבוצות העכברים עם רצועות קטועות, ולא היה אובדן ברור של קולגן מסוג II (איור 6A). תוצאות הניתוח הכמותי הראו כי ביטוי הקולגן מסוג II ב- ASCJ של העכברים בקבוצת הדמה היה גבוה מזה של שתי קבוצות העכברים עם רצועות קטועות, וההבדל היה מובהק סטטיסטית (p < 0.05; איור 6B,C).
איור 1: ניתוח התנהגותי של עכברים באמצעות מבחן קרן שיווי משקל . (A) הזמן הדרוש לעכברים לחצות את קרן האיזון. (B) מספר ההחלקות של רגל ימין בעת חציית קרן האיזון. הנתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן, n = 7 דגימות לקבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח התנהגותי של עכברים באמצעות ניתוח טביעת רגל. (A) השוואת אורך הצעד הימני של העכברים בכל קבוצה לפני הניתוח. (B) השוואת אורך הצעד הימני של העכברים בכל קבוצה 12 שבועות לאחר הניתוח. הבדלים מובהקים סטטיסטית מסומנים על ידי **, כאשר p < 0.01, ו- ***, כאשר p < 0.001 בין הקבוצות שצוינו. הנתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן, n = 7 דגימות לקבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח התנהגותי של עכברים באמצעות הערכת nociception תרמית. זמני תגובה של נוסיספטציה תרמית במהלך פעילות בעכברים. הנתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן, n = 7 דגימות לקבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח מיקרו-CT של כף רגל ימין של עכבר. (A) שחזור תלת ממדי של טאלוס העכבר ללא נקע במכלול מפרק הקרסול-תת-קרקעי (מבט רוחבי, מבט מדיאלי, מבט קדמי). (B) שחזור תלת ממדי של טאלוס העכבר הנקוע במכלול מפרק הקרסול-תת-קרקעי (מבט לטרלי, מבט מדיאלי, מבט קדמי). (C) ניתוח כמותי של מקטע נפח העצם (BV/TV) של מפרקי קרסול העכבר. (D) ניתוח כמותי של מקטע נפח העצם (BV/TV) של המפרקים התת-קרקעיים של העכבר. החיצים השחורים מצביעים על היווצרות אוסטאופיטים או נקע טאלוס. הבדלים מובהקים סטטיסטית מסומנים על ידי ***, כאשר p < 0.001 בין הקבוצות שצוינו. נתון זה שונה מ Liu et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צביעה ירוקה מהירה של H&E וספרנין O-fast Green וניתוח מפרקי הקרסול. (A) צביעת H&E של מפרקי הקרסול-תת-מפרקים של העכבר. (B) ספרנין O-צביעה מהירה של מפרקי הקרסול-תת-קרקעיים של העכבר. (C) ניקוד מנקין שונה עבור מפרקי קרסול העכבר. (D) ציוני מנקין שהשתנו עבור המפרקים התת-קרקעיים של העכבר. (E) ציוני Osteoarthritis Research Society International (OARSI) עבור מפרקי קרסול העכבר. (F) ציוני OARSI עבור המפרקים התת-קרקעיים של העכבר. סמלים: a = מפרק הקרסול; s = מפרק תת-קרקעי. הבדלים מובהקים סטטיסטית מסומנים על ידי ***, כאשר p < 0.001 בין הקבוצות שצוינו. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר, n = 7 דגימות לקבוצה. נתון זה שונה מ Liu et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: צביעה אימונוהיסטוכימית וניתוח של מפרקי הקרסול. (A) צביעה אימונוהיסטוכימית של קולגן מסוג II בקרסול העכבר ובמפרקים התת-קרקעיים. (B) אחוז יחס שטח קולגן II (+) עבור מפרקי קרסול העכבר. (C) אחוז יחס שטח קולגן II (+) עבור המפרקים התת-טלאריים של העכבר. סמלים: a = מפרק הקרסול; s = מפרק תת-קרקעי. הבדלים מובהקים סטטיסטית מסומנים על ידי ***, כאשר p < 0.001 בין הקבוצות שצוינו. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר, n = 7 דגימות לקבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, שני מודלים עכבריים של חוסר יציבות ASCJ נבנו בהצלחה על ידי transecting CL + ATFL או CL + DL. הזמן עבור העכברים לעבור דרך קרן שיווי המשקל גדל באופן משמעותי לאחר 8 שבועות ו -12 שבועות לאחר הניתוח, אשר דומה לתוצאות שהתקבלו על ידי צוות האברד-טרנר על ידי חיתוך הרצועה הצידית של מפרק הקרסול23,24. בבדיקת ההחלקה ברגל ימין, ראינו שזמני ההחלקה של שתי קבוצות העכברים עם רצועות קטועות היו גבוהים משמעותית מאלה של עכברים בקבוצת הדמה, וזמני ההחלקה הגיעו למקסימום 12 שבועות לאחר הניתוח, מה שמרמז על כך ששתי קבוצות העכברים עם רצועות קטועות סבלו מחוסר יציבות של ASCJ. בדיקת ההליכה הראתה כי למרות שאורך הצעד של העכברים עלה בהדרגה עם הגיל, אורכי הצעדים של 12 שבועות של שתי קבוצות העכברים עם רצועות קטועות היו נמוכים מאלה של קבוצת הדמה, ואורך הצעד של קבוצת CL + ATFL היה נמוך ב -7.2% מזה של קבוצת הדמה. יחד, התוצאות הנ"ל מצביעות על כך שהרמה המוטורית ויכולת שיווי המשקל של שתי קבוצות העכברים עם קטיעת רצועות נפגעו באופן משמעותי.
בשחזור התלת-ממדי של תמונות ה-CT, נצפה כי המשטח המפרקי ASCJ בשתי קבוצות העכברים עם רצועות קטועות היה מחוספס יותר מזה של העכברים בקבוצת הדמה, אוסטאופיטים נוצרו סביב המפרקים, וחלק נפח העצם של המפרק גדל. תוצאות אלה מצביעות על כך שהסחוס המפרקי ASCJ בקבוצת קטיעת הרצועה סבל מנגעים ניווניים. הצביעה של קטעי הסחוס המפרקי הראתה ניוון סחוס, כגון חוסר רציפות של פני השטח של הסחוס וירידה של כונדרוציטים, אשר אימתו עוד יותר כי חוסר יציבות ASCJ לטווח ארוך יכול להתפתח PTOA, אשר דומה לתוצאות שתוארו על ידי Chang et al.18.
בתהליך הקמת המודל, המפתח לדוגמנות מוצלחת הוא למצוא במדויק את הרצועות המתאימות לחיתוך. יחד עם זאת, עלייה מתונה בפעילות העכברים יכולה להאיץ את התפתחותם של דלקת מפרקים ניוונית. בתהליך הצביעה שלאחר מכן, decalcification של רקמת מפרק הקרסול העכבר משחק תפקיד מכריע. לכן, יש צורך לבחון לעתים קרובות את קשיות הרקמה ולבחור זמן חתך מתאים.
במחקר נעשה שימוש בנייר הליכה כדי לנתח את השינויים בהליכה של העכברים לפני ואחרי הניתוח, והתקבלו רק שינויים באורך הצעדים של העכברים. אם נעשה שימוש במכשיר לניתוח הליכה של בעלי חיים, ניתן היה לנתח פרמטרים נוספים על פי הגודל והשטח, המיקום, דינמיקת התנועה והלחץ של כל צעד בעכברים לצורך ניתוח איכותי וכמותי של ההליכה. בנוסף, זיהוי מונופילמנט של Semmes Weinstein מוכר בעולם כשיטה יעילה מאוד לזיהוי הפרעות חושיות בלחץ מגע25, וניתן להשיג תוצאות ניסוי טובות יותר אם משתמשים בשיטה זו כדי להעריך את התפקוד החושי של רגלי העכברים. עם זאת, בשל תנאי הניסוי המוגבלים וחוסר הזמינות של מכשירים לניתוח הליכה של בעלי חיים, לא נעשה שימוש בזיהוי מונופילמנט של Semmes Weinstein; לכן, יש הזדמנויות למחקרים מעמיקים באמצעות טכניקות ניסיוניות אלה בעתיד.
מכיוון ש- PTOA היא מחלה ניוונית כרונית26, יש לראות חוסר יציבות במפרקים ונזק לסחוס בנקודות זמן שונות, וזה ראוי למחקרים ארוכי טווח ורב-פעמיים יותר בעתיד. בנוסף, בשל המבנה הקטן של ASCJ העכבר, לא ניתן היה לחלץ את הכונדרוציטים לניסויים במבחנה כדי להעריך את השינויים בגורמים דלקתיים ולאמת את קיומו של PTOA ברמה התאית. במחקרים עתידיים, יותר זמן ואנרגיה יושקעו בחקר המנגנונים הביולוגיים המולקולריים הבסיסיים של ניוון ASCJ. שנית, למרות שהמבנה של כפות רגליים אחוריות וקרסוליים של עכברים דומה לזה של בני אדם, למעשה, עכברים הם מרובעים, בעוד בני אדם הם דו-רגליים, והכוחות שחווים המפרקים במהלך התנועה אינם זהים לחלוטין.
עם זאת, ההקמה המוצלחת של מודל עכבר חוסר היציבות ASCJ מרחיבה את מודל בעלי החיים הפשוט של אי יציבות הקרסול למודל בעלי החיים ASCJ אי יציבות, המספק הבנה מקיפה יותר של מנגנון אי יציבות כף הרגל ומספק הבנה חדשה לחקר מחלות כף רגל קליניות, כמו גם מודל בעלי חיים לאבחון וטיפול במחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף אחד מהמחברים אין אינטרסים מנוגדים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המלגות הממשלתית של מחוז ג'יאנגסו ותוכנית אקדמית מועדפת לפיתוח מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
