Summary
Fotleden-subtalarkomplexet (ASCJ) är fotens kärna och spelar en nyckelroll för balanskontroll i dagliga aktiviteter. Idrottsskador leder ofta till instabilitet i denna led. Här beskriver vi en musmodell av ligamenttranssektionsinducerad instabilitet hos ASCJ.
Abstract
Fotledsstukningar är kanske de vanligaste idrottsskadorna i det dagliga livet, vilket ofta resulterar i instabilitet i fotleden-subtalarkomplexet (ASCJ), och kan så småningom leda till posttraumatisk artros (PTOA) på lång sikt. Men på grund av skademekanismens komplexitet och de kliniska manifestationerna, såsom ekkymos, hematom eller ömhet i den laterala foten, finns det ingen klinisk konsensus om diagnos och behandling av ASCJ-instabilitet. Eftersom den muskuloskeletala strukturen hos ben och ligament i musens bakfot är jämförbar med den hos människor, etablerades en djurmodell av ASCJ-instabilitet hos möss genom transsektion av ligament runt ASCJ. Modellen validerades väl genom en serie beteendetester och histologiska analyser, inklusive ett balansstråletest, en fotavtrycksanalys (en bedömning av träningsnivå och balansförmåga hos möss), en termisk nociceptionsbedömning (en bedömning av fotens sensoriska funktion hos möss), mikrodatortomografi (CT) skanning och snittfärgning av ledbrosket (en bedömning av ledbroskskador och degeneration hos möss). Den framgångsrika etableringen av en musmodell av ASCJ-instabilitet kommer att ge en värdefull referens för klinisk forskning om skademekanismen och resultera i bättre behandlingsalternativ för fotledsstukning.
Introduction
Fotledsstukningar är en av de vanligaste idrottsskadorna i världen. Det uppskattas att 10 000 personer skadas dagligen i USA1, varav idrottsrelaterade skador står för 15–45 %2. De medicinska kostnaderna för behandling av fotledsstukningar i USA uppgår till 4,2 miljarder dollar årligen 3,4,5. Kronisk fotinstabilitet är ett vanligt problem efter fotledsstukningar och förekommer i cirka 74 % av fotledsstukningarna6, inklusive fotleds- eller subtalarinstabilitet. Men på grund av liknande kliniska symtom och tecken är det svårt för medicinsk personal att avgöra om kronisk fotledsinstabilitet också åtföljs av kronisk subtalarledsinstabilitet på kliniken, och som ett resultat kan kronisk subtalarinstabilitet lätt missas. Därför kan den verkliga incidensen av kronisk instabilitet i fotleden-subtalarkomplexet (ASCJ) (en specifik typ av kronisk fotinstabilitet som inkluderar både kronisk fotledsinstabilitet och kronisk subtalarinstabilitet) vara högre än vad som rapporterats 7,8,9. Om den lämnas obehandlad kan kronisk ledinstabilitet i fotledssubtalarkomplexet orsaka upprepade fotledsstukningar, vilket leder till en ond cirkel av fotledsstukningar och kronisk instabilitet i fotledssubtalarkomplexet. Långvarig kronisk instabilitet i fotledssubtalarkomplexet kan leda till degeneration av ASCJ och posttraumatisk artros, vilket kan påverka de intilliggande lederna iallvarliga fall. För dessa sjukdomar är den nuvarande kliniska behandlingen huvudsakligen konservativ, förutom kirurgiska behandlingsmetoder som ligamentreparation och ligamentrekonstruktion11,12.
ASCJ är fotens kärnstruktur och upprätthåller balansen i kroppen under rörelse13. Omfattande forskning har bedrivits på fotledens och subtalarledens struktur var för sig14,15,16,17. Forskning på hela fotleden är dock sällsynt. Ungefär en fjärdedel av fallen av fotledsskada är förknippade med subtalarledskada18. På grund av den komplexa skademekanismen för ASCJ-instabilitet finns det ingen konsensus om att diagnostisera och behandla den i den kliniska miljön. Med tanke på den nuvarande situationen med fotledsskador i kliniken behövs en mer vetenskaplig metod för att studera fotleden och subtalarleden som helhet och därmed ge en ny förståelse för att studera fotsjukdomar.
Eftersom den anatomiska strukturen hos musens bakfot på muskuloskeletal nivå är jämförbar med den hos den mänskliga foten 19, har i flera studier musmodeller för fot-/fotledsforskning redan implementerats10,19. Chang et al.19 utvecklade framgångsrikt tre olika musmodeller av fotledsartros. Inspirerade av den framgångsrika etableringen av fotledsinstabilitet i musmodellen, etablerade vi en musmodell för ankel-subtalarkomplex instabilitet, med hypotesen att transsektionen av de partiella ligamenten i musens bakfot skulle resultera i mekanisk instabilitet i ASCJ, vilket skulle leda till posttraumatisk artros (PTOA) i ASCJ. ASCJ-instabilitetsdjurmodellen skulle kunna användas för behandling av både fotledsinstabilitet och subtalarinstabilitet, vilket är mer i linje med den faktiska kliniska situationen än den för närvarande använda enkla fotledsinstabilitetsmodellen 7,8,9,19. För att testa denna hypotes designades två musmodeller av ligamenttranssektionsinducerad instabilitet hos ASCJ. Resultaten för den sensorisk-motoriska funktionen - balansstråletestet, fotavtrycksanalysen och bedömningen av termisk nociception - användes för att utvärdera modellens genomförbarhet, och mikrodatortomografi (CT) och histologisk färgning användes för att utvärdera skador och degeneration av musens ledbrosk. Den framgångsrika etableringen av en musmodell av ASCJ-instabilitet ger inte bara en ny förståelse för att studera fotsjukdomar utan ger också en värdefull referens för klinisk forskning om de skaderelaterade mekanismerna, ger bättre behandlingsalternativ för fotledsstukningar och är till hjälp för ytterligare studier av sjukdomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Soochow University.
1. Kirurgiska ingrepp
- Dela upp 21, 6 veckor gamla C57BL/6 hanmöss i tre grupper: det tvärgående cervikala ligamentet och den främre talofibulära ligamentgruppen, det tvärgående cervikala ligamentet och deltaideusligamentgruppen och skenkirurgigruppen. Se till att alla möss har fötts upp i en miljö som uppfyller specifika standarder för patogenfritt (SPF).
- Acklimatisera mössen till den nya uppfödningsmiljön (en ljus/mörk cykel på 12 timmar/12 timmar och en konstant temperatur och luftfuktighet på 18-22 °C respektive 40-70 %) under 2 veckor före försöket. Utsätt mössen för balansbom- och gångträning, gå från ena änden av en balansbom eller ett U-format rör till den andra änden utan att stanna, 1 vecka före experimentet.
- Vid 8 veckors ålder, bedöva musen med isofluraninandning genom att fukta en bomullstuss med 2 ml isofluran och placera den i en lufttät behållare för full avdunstning. Övervaka musens aktivitet och fortsätt inandningen tills musens aktivitet har minskat avsevärt. Bestäm anestesidjupet genom att nypa ihop tårna på mössen för att observera deras reaktioner. Inhalera förångat isofluran (2%) genom en ansiktsmask för att bibehålla anestesi hos möss under efterföljande operationer. Använd veterinär ögonsalva under narkos för att förhindra att ögonen torkar ut.
- Efter bedövning, ta bort håret på fotleden på musens högra bakben med en rakapparat och desinficera den exponerade huden tre gånger med omväxlande omgångar av jodbomullstussar och alkoholbomullstussar. Administrera 5 mg/kg karprofen genom subkutan injektion. Överför musen till den mikrokirurgiska djuroperationssalen med hjälp av en steril kirurgisk dyna.
- För det tvärgående cervikala ligamentet och den främre talofibulära ligamentgruppen (CL + ATFL), gör ett 7 mm snett nedåtgående snitt med en skalpell på huden ovanför höger fotled och sond med mikroskopisk rak pincett framför fotleden.
- Se till att ATFL exponeras vid den nedre kanten av taluskroppen och vadbenet efter sondering och skär den försiktigt med en skalpell. Separera de långa och korta vadbenssenorna och extensor digitorum longus-senorna, exponera CL och skär av den med en skalpell.
- För den tvärgående CL + deltoideusligamentgruppen (DL), gör ett 8 mm vertikalt snitt på den mediala huden i höger fotled och separera DL från den mediala fotknölen för att slutligen skära av den. Skär sedan CL enligt beskrivningen i steg 1.5.
- För skengruppen (skenkirurgigruppen), utför skenkirurgi på höger fotled men skär inte av några ligament.
- Spola snittet med steril vanlig koksaltlösning och sy ihop det med 5-0 kirurgisk nylontråd. Desinficera slutligen det suturerade snittet med en jodbomullstuss.
- Håll musen under uppsikt tills den kan bibehålla sternal vila och övervaka tills den är fullt medveten. Desinficera ankelsnittet två gånger per dag med en jodbomullstuss och administrera karprofen (5 mg/kg, subkutan injektion), en gång om dagen i 1 vecka. Bakåt ensam efter operationen och var noga med musens postoperativa tillstånd.
- Två veckor efter operationen och när svullnaden i fotleden har minskat, börja träna mössen i musens roterande trötthetsmaskin i 1 timme varje dag.
2. Provning av balansbom
- Kläm fast en cirkulär träbalk med en längd på 1 m och en diameter på 20 mm, lutad i 15° i ena änden, med en fotostativklämma, och placera den andra änden på en arbetsyta ansluten till en sluten kassett.
- Utför balansbomträning 1 vecka före operationen för att säkerställa att mössen smidigt rör sig från ena änden av strålen till den andra. Tänk dig att en mus har klarat testet när den passerar genom strålen två gånger på 60 s utan att pausa.
- Utför två på varandra följande försök för varje mus och spraya balansstrålen med 75 % alkohol efter varje försök för att förhindra att kvarvarande lukt från föregående mus påverkar nästa mus.
- Utför balansstråletestet preoperativt, 3 dagar, 1 vecka, 4 veckor, 8 veckor och 12 veckor efter operationen. Registrera den genomsnittliga tiden för varje mus som passerar balansbommen två gånger i rad och antalet gånger som höger bakfot glider av bommen som beroende variabler.
3. Analys av fotavtryck
- Placera en U-formad plastkanal med en längd på 50 cm, en bredd på 10 cm och en höjd på 10 cm på experimentbordet och anslut ena änden av plastkanalen till en sluten kassett.
- Lägg ett vanligt pigmentpapper platt i kanalen och håll sedan musen med båda händerna och måla fram- och baktassarna jämnt med giftfritt rött och grönt pigment.
- Placera den målade musen försiktigt i ena änden av kanalen och låt dem flytta till den andra änden av kassetten. Ta ut det pigmenterade pappret med fotavtrycken, markera det och lägg det på ett galler för att torka på en ventilerad och skuggad plats.
- Efter att varje mus har passerat, spraya den U-formade plastkanalen med 75 % alkohol för att förhindra att den föregående musens kvarvarande lukt påverkar nästa mus.
- Välj tre på varandra följande tydliga musfotavtryck på varje papper och använd en linjal för att mäta steglängden på fotavtrycket på musens högra fot, samt stegbredden mellan vänster och höger fotavtryck.
4. Bedömning av termisk nociception
- Under experimentet används plantartestet för att registrera reaktionstiden för musfoten och reaktionstiden för musen under aktivitet respektive vila. Registrera mätdata på några sekunder.
- Placera musen i mätinstrumentet, rikta in instrumentet med dess högra fot och börja värma instrumentet med temperaturen som ökar långsamt. Observera musens svar. När temperaturen stiger över toleransen kommer musen snabbt att dra sig tillbaka eller slicka sin högra fot. Registrera tiden med instrumentet och definiera tiden som reaktionstid under aktiviteten.
- För att mäta reaktionstiden i vila, låt musen sitta i 30 minuter på vilobordet utan uppvärmning och få sedan tidsdata enligt beskrivningen i steg 4.2. Använd dessa inhämtade temporala data för efterföljande analys.
5. Mikro-CT-skanning
- Avliva 12 veckor gamla möss med koldioxid postoperativt, skala av huden på deras högra fotleder och klipp sedan av deras mellersta skenben och vadben med en kirurgisk sax för att få fullständiga fotledsprover. Placera proverna i märkta 15 ml centrifugrör som innehåller 10 % neutralt formalin i 48 timmar.
- Efter fixering, placera proverna i omgångar (fyra prover per sats) i en speciell svamptank för mikro-CT-skanning. Ställ in maskinparametrarna enligt följande: voltage = 50 kV, ström = 200 mA, filter = 0.5 mmAl och upplösning = 9 μm. Kör mikro-CT-skannern.
- Efter skanning, använd rekonstruktionsprogramvaran för att avgränsa bildens omfång och välj en specifik vinkelposition efter att ha justerat XYZ-axeln för den avgränsade bilden med hjälp av kommersiell dataanalysprogramvara, som beskrivs i Liu et al.10.
- Använd mikro-CT-analysprogramvara för att välja kontinuerliga 10-lagersregioner av intresse i de omstrukturerade bilderna justerade av XYZ-axlarna, och kvantitativt analysera de nödvändiga lederna för att bestämma benvolymfraktionen (BV/TV), som beskrivs i Liu et al.10.
- Slutligen, använd tredimensionell medicinsk bildbehandlingsprogramvara för att utföra tredimensionell CT-bildbehandling av musens fotleder, som beskrivs i Liu et al.10. Efter rekonstruktion, observera slitaget och bildandet av osteofyter i ASCJ.
6. Sektionsfärgning av ledbrosk
OBS: Alla färgningssteg utförs i ett dragskåp och en mask bärs under proceduren.
- Använd mikroskopisk pincett och sax för att ta bort överflödig mjukvävnad runt fotledsproverna och placera sedan proverna i ett centrifugrör som innehåller 10 % EDTA-avkalkningslösning beredd med 44 g NaOH, två förpackningar PBS och 400 g EDTA-2Na, med pH justerat till 7,35-7,45 med saltsyra, och markera de olika grupperna.
- Placera sedan centrifugröret på ett skakbord (hastighet inställd på 20 rpm) för avkalkning och byt avkalkningslösning en gång per dag. Bestäm avkalkningen av proverna.
- Efter 1 månads avkalkning, dehydrera proverna med gradientalkohol och använd sedan n-butanol i 8 timmar för rensningsändamål. Sänk slutligen ner de rensade proverna i paraffin i en koronal position för inbäddning.
- Placera paraffinproverna i ett kylskåp på 4 °C för senare användning. Innan du snittar, ta proverna från kylskåpet med 4 °C och placera dem i en frys på −20 °C i cirka 10 minuter för att underlätta skärningen av hela planet.
- Fäst proverna på mikrotomen och snitta dem med en tjocklek av 6 μm. Använd samtidigt ett mikroskop för att observera om proverna har skurits på den förväntade nivån - lätt penetration av en sprutnål i benvävnaden.
- Justera tablettmaskinens vattentemperatur till 40 °C i förväg. Skär sedan två till tre kompletta paraffinsektioner i rad och överför dem till tablettmaskinen för full expansion. Ta sedan bort paraffinsektionerna med en glasskiva och töm vattnet. Markera slutligen bilderna med grupper och siffror.
7. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E)
- Placera sektionerna i en 60 °C inkubator på ett sådant sätt att den intakta ASCJ-fogstrukturen kan observeras under mikroskopet och grädda sektionerna i 40-50 min. Avvaxa sedan sektionerna med xylen 3x, numrerade som I, II och III för enkel identifiering, i 15 min, 15 min respektive 10 min.
- Placera de avvaxade sektionerna i 100 % etanol 2x, numrerade som I och II för enkel identifiering, 90 % etanol och 80 % etanol i 3 min, 3 min, 5 min respektive 5 min. Tvätta sedan sektionerna med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) i 5 minuter.
- Efter blötläggning med hematoxylin i 1 min, tvätta sektionerna med ddH2O tills de blir färglösa. Blötlägg sektionerna i 1 % sur etanoldifferentieringslösning i 30 s och tvätta dem 3 gånger i 1 min med ddH2O. Färga sedan sektionerna med 1% ammoniaklösning i 1 minut och tvätta sedan 3 gånger i 1 minut vardera med ddH2O.
- Färga sedan proverna med eosinfärgningslösning i 1 minut och lägg dem sedan i 95 % etanol och 100 % etanol i 1 minut vardera i följd. Behandla slutligen sektionerna med xylen IV i 1 min.
- Lufttorka sektionerna, klistra in en droppe neutralt harts på proverna på objektglasen och täck dem med ett täckglas. Ta sedan bilder med ett upprätt fluorescensmikroskop i ljusfält vid 5x och 20x.
8. Safranin O-fast grön färgning
- Lägg de valda delarna i en 60 °C inkubator och grädda delarna i 40-50 min. Avvaxa sedan sektionerna med xylen I, II och III i 15 minuter, 15 minuter respektive 10 minuter.
- Placera de avvaxade sektionerna i 100 % etanol I, II, 90 % etanol och 80 % etanol i 3 min, 3 min, 5 min respektive 5 min. Tvätta sedan sektionerna med ddH2O i 5 min.
- Efter blötläggning med hematoxylin i 1 min, tvätta sektionerna med ddH2O tills de blir färglösa. Blötlägg sektionerna i 1 % sur etanoldifferentieringslösning i 30 s och tvätta dem 3 gånger i 1 min med ddH2O. Färga sedan sektionerna med 1 % ammoniaklösning i 1 minut och tvätta dem 3 gånger i 1 minut vardera med ddH2O.
- Blötlägg sektionerna i 0,05 % fast green i 2 min, följt av blötläggning av sektionerna i 1 % ättiksyralösning i 30 s och i 0,1 % safranin i 5 min. Placera de färgade proverna i 95 % etanol och 100 % etanol i 1 min, efter varandra.
- Behandla slutligen sektionerna med xylen IV i 1 min. Lufttorka sektionerna, klistra in en droppe neutralt harts på proverna på objektglasen och täck dem med ett täckglas. Ta sedan bilder med ett upprätt fluorescensmikroskop i ljusfält vid 5x och 20x.
9. Immunhistokemi
- Dag 1: Lägg de valda sektionerna i en 60 °C inkubator, grädda sektionerna i 40-50 minuter och vaxa dem sedan med xylen I, II och III i 15 min, 15 min respektive 10 min. Placera de avvaxade sektionerna i 100 % etanol I, II, 90 % etanol och 80 % etanol i 3 min, 3 min, 5 min respektive 5 min. Tvätta sedan sektionerna med ddH2O i 5 minuter, använd en histokemisk penna för att cirkla runt provets område och placera dem i en mörk låda.
- Antigenuttag: Droppa 20-50 μL 0,25 % trypsin i det inringade provområdet, inkubera i en 37 °C inkubator i 60 minuter och tvätta sedan proverna 3x i 2 minuter vardera med PBS. Blockera endogent peroxidas genom att tillsätta 3% H 2 O2, inkubera proverna i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker och tvätta dem sedan 3 gånger i2 minuter vardera med PBS. Utför serumblockering genom att tillsätta 10 % getserum vid rumstemperatur i 20 minuter och inkubera sedan med den primära antikroppen (mus-anti-mus typ II-kollagen, utspätt 1 000 gånger) vid 4 °C över natten.
- Dag 2: Värm upp sektionerna i rumstemperatur i 30 minuter. Ta upp den primära antikroppen och tvätta sektionerna 3 gånger i 2 minuter vardera med PBS. Inkubera med den sekundära antikroppen i 40 minuter i en inkubator vid 37 °C och tvätta sedan sektionerna 3 gånger i 2 minuter vardera med PBS.
- DAB-färgutveckling: Tillsätt 5 ml ddH 2 O,två droppar buffert, fyra droppar DAB och två droppar H 2 O2 för att förberedaDAB-reagenset. Tillsätt 20–50 μL reagens till sektionerna, håll proverna skyddade från ljus i 5 minuter och tvätta sedan sektionerna i 2 minuter med ddH2O.
- Efter blötläggning med hematoxylin i 1 min, tvätta sektionerna med ddH2O tills de blir färglösa. Blötlägg sektionerna i 1 % sur etanoldifferentieringslösning i 30 s och tvätta dem 3 gånger i 1 minut vardera med ddH 2 O. Färga sektionerna i 1 min med 1 % ammoniaklösning och tvätta dem sedan 3 gånger i 1 min vardera med ddH2O.
- Lägg sedan sektionerna i 95 % etanol respektive 100 % etanol i 1 minut vardera. Inkubera slutligen sektionerna i 1 minut med xylen IV. Lufttorka sektionerna, klistra in en droppe neutralt harts på proverna på objektglasen och täck dem med ett täckglas. Ta sedan bilder med ett upprätt fluorescensmikroskop i ljusfält vid 5x och 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den statistiska analysen av korrelationsdata utfördes med hjälp av statistiska analysverktyg online. De data som uppfyllde de två testerna av normalfördelning och varianshomogenitet användes för vidare statistisk analys genom envägsanalys av varians. Om data inte uppfyllde de två testerna användes Kruskal-Wallis-testet för den statistiska analysen. Data uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelse (SD) och p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Provning av balansbom
Den statistiska analysen av den genomsnittliga tiden som krävdes för varje mus att passera genom balansstrålen två gånger i varje steg visade att det inte fanns några statistiska skillnader i den tid som krävdes för varje grupp av möss att passera balansstrålen före operationen (p = 0,73). Tre dagar efter operationen krävde mössen i grupperna CL + ATFL och CL + DL längre tid att passera genom balansstrålen jämfört med mössen i shamgruppen, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,05). Fyra veckor efter operationen observerades inga signifikanta skillnader i den tid det tog för möss i grupperna CL + ATFL och CL + DL att passera balansstrålen jämfört med mössen i skengruppen (p > 0,05). Dessutom, 8 veckor och 12 veckor efter operationen, krävde mössen i CL + ATFL och CL + DL grupperna mer tid för att passera balansstrålen jämfört med mössen i sham-gruppen, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,01). Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades i den tid det tog för mössen i CL + ATFL-gruppen att passera balansstrålen jämfört med mössen i CL + DL-gruppen under varje testperiod (p > 0,05; Figur 1A).
Antalet gånger musens högra bakfot gled genom balansbommen skilde sig inte statistiskt mellan de tre grupperna av möss före operationen (p = 0,68). Dessutom observerades inga signifikanta skillnader i antalet snitt av höger bakfot för mössen i CL + ATFL och CL + DL jämfört med möss i skengruppen 3 dagar efter operationen. När det gäller andra postoperativa tidpunkter var antalet snitt i ligamenttranssektionsgruppen högre jämfört med mössen i skengruppen, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,05). Vid 8 veckor och 12 veckor efter operationen var antalet gånger som höger bakfot i CL + ATFL-gruppen gled av balansbommen högre än hos mössen i CL + DL-gruppen, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,05; Figur 1B).
Analys av fotavtryck
Steglängden hos mössen i varje grupp ökade med åldern, men avhuggning av ligamenten kunde förkorta steglängden. Inga signifikanta skillnader observerades i steglängden på höger bakfot mellan de tre grupperna av möss före operation (p > 0,05). I gångtestet 12 veckor efter operationen var steglängden för höger bakfot i ligamentsnittsgruppen kortare jämfört med i skengruppen vid samma period, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,01). Steglängden för höger bakfot för mössen i CL + ATFL-gruppen skilde sig dock inte signifikant från den för mössen i CL + DL-gruppen (p > 0,05; Figur 2A,B).
Bedömning av termisk nociception
Den statistiska analysen av den termiska nociceptionsresponstiden hos mössens fötter under aktivitet visade att det inte fanns några statistiska skillnader i reaktionstiderna för de tre grupperna av möss före operationen (p > 0,5). I bedömningen av termisk nociception efter operationen var svarstiderna för termisk nociception för mössen i ligamentgruppen längre än för mössen i shamgruppen under samma period, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,01; Figur 3).
Mikro-CT-skanning
Tolv veckor efter operationen användes mikro-CT för att kvantitativt analysera ASCJ i höger bakfot för mössen i varje grupp. Tredimensionell rekonstruktion av CT-bilderna visade att ASCJ i höger bakfot i de två grupperna med avskurna ligament var grövre än i skengruppen. Ledytan var konkav, konvex och platt, det fanns tydliga slitagemärken, osteofyter genererades runt lederna och lederna visade degenerativa förändringar. Dessutom utvecklade cirka 28,6 % av mössen i CL + DL-gruppen talusdislokation (Figur 4A,B)10. Benvolymfraktionen av ASCJ i höger bakfot i CL + ATFL och CL + DL var signifikant högre än i sham gruppen, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,01; Figur 4C,D)10.
Sektionsfärgning av ledbrosket
H&E och Safranin O-fast green färgning visade att strukturen hos ASCJ hos mössen i sham-gruppen var komplett, broskets morfologi var intakt och kondrocyterna var jämnt fördelade. Broskskiktet i ASCJ hos de två grupperna av möss med ligamentsnitt visade tydlig diskontinuitet och antalet kondrocyter minskade (Figur 5A,B)10. Det modifierade poängsystemet Mankin and Osteoarthritis Research Society International (OARSI) användes för att poängsätta H&E och Safranin O-fast grön färgning av ASCJ för mössen i varje grupp20,21,22. Den modifierade Mankin-poängen bestämdes av broskets strukturella egenskaper och antalet och färgningen av kondrocyterna, och OARSI-poängen bestämdes av broskets histopatologiska grad och stadium. Poängen för de två grupperna av möss med ligamentamputation var högre än för mössen i skengruppen, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,05; Figur 5C-F)10.
Bilder av typisk immunhistokemisk färgning av typ II-kollagen visade att innehållet av typ II-kollagen i ASCJ-ledbroskskiktet i höger bakfot i skengruppen var mer enhetligt än hos de två grupperna av möss med avskurna ligament, och det fanns ingen uppenbar förlust av typ II-kollagen (Figur 6A). Resultaten av den kvantitativa analysen visade att uttrycket av kollagen typ II i ASCJ hos mössen i skengruppen var högre än hos de två grupperna av möss med avskurna ligament, och skillnaden var statistiskt signifikant (p < 0,05; Figur 6B,C).
Figur 1: Beteendeanalys av mössen med hjälp av balansbomstestet . (A) Den tid som krävs för mössen att korsa balansbommen. (B) Antalet glidningar av höger fot vid passage av balansbommen. Uppgifterna representerar medelvärdet ± standardavvikelsen, n = 7 prover per grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beteendeanalys av mössen med hjälp av fotavtrycksanalys. (A) Jämförelse av längden på höger fotsteg för mössen i varje grupp före operation. (B) Jämförelse av längden på höger fotsteg för mössen i varje grupp 12 veckor efter operationen. Statistiskt signifikanta skillnader indikeras med **, där p < 0,01, och ***, där p < 0,001 mellan de angivna grupperna. Uppgifterna representerar medelvärdet ± standardavvikelsen, n = 7 prover per grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Beteendeanalys av mössen med hjälp av termisk nociceptionsbedömning. Termiska nociceptionssvarstider under aktivitet hos möss. Uppgifterna representerar medelvärdet ± standardavvikelsen, n = 7 prover per grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mikro-CT-analys av en mus högra fot. (A) Tredimensionell rekonstruktion av musens talus utan luxation i fotleds-subtalarledkomplexet (lateral vy, medial vy, anterior vy). (B) Tredimensionell rekonstruktion av den dislokerade mustalusen i fotleds-subtalarledkomplexet (lateral vy, medial vy, anterior vy). C) Kvantitativ analys av benvolymfraktionen (BV/TV) i fotlederna hos möss. (D) Kvantitativ analys av benvolymfraktionen (BV/TV) i musens subtalarleder. De svarta pilarna indikerar osteofytbildning eller talusluxation. Statistiskt signifikanta skillnader indikeras med ***, där p < 0,001 mellan de angivna grupperna. Denna siffra har modifierats från Liu et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: H&E och Safranin O-fast grön färgning och analys av fotlederna. (A) H&E-färgning av musens fotleder-subtalarleder. (B) Safranin O-fast färgning av musens fotleder. (C) Modifierade Mankin-poäng för musfotlederna. (D) Modifierade Mankin-poäng för musens subtalarleder. (E) Osteoarthritis Research Society International (OARSI) poäng för musfotlederna. (F) OARSI-poäng för musens subtalarleder. Symboler: a = fotled; s = subtalarled. Statistiskt signifikanta skillnader indikeras med ***, där p < 0,001 mellan de angivna grupperna. Skalstapel = 100 μm, n = 7 prover per grupp. Denna siffra har modifierats från Liu et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Immunhistokemisk färgning och analys av fotlederna. A) Immunhistokemisk färgning av kollagen typ II i fotleden och subtalarlederna hos möss. (B) Kollagen II (+) procentuell area ratio för musfotlederna. (C) Kollagen II (+) areakvot i procent för musens subtalarleder. Symboler: a = fotled; s = subtalarled. Statistiskt signifikanta skillnader indikeras med ***, där p < 0,001 mellan de angivna grupperna. Skalstapel = 100 μm, n = 7 prover per grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie konstruerades två musmodeller av ASCJ-instabilitet framgångsrikt genom att transektera CL + ATFL eller CL + DL. Tiden för mössen att passera genom balansstrålen ökade signifikant vid 8 veckor och 12 veckor efter operationen, vilket liknar de resultat som erhölls av Hubbard-Turner-teamet genom att skära av det laterala ligamentet i fotleden23,24. I glidtestet för höger fot observerade vi att glidtiderna för de två grupperna av möss med avskurna ligament var signifikant högre än för möss i skengruppen, och glidtiderna nådde ett maximum 12 veckor efter operationen, vilket tyder på att de två grupperna av möss med avskurna ligament kan ha lidit av instabilitet i ASCJ. Gångtestet visade att, även om steglängden hos mössen gradvis ökade med åldern, var 12-veckors steglängderna för de två grupperna av möss med avskurna ligament lägre än för skengruppen, och steglängden för CL + ATFL-gruppen var 7,2 % mindre än för skengruppen. Sammantaget tyder ovanstående resultat på att den motoriska nivån och balansförmågan hos de två grupperna av möss med ligamentamputation var signifikant nedsatta.
I den tredimensionella rekonstruktionen av CT-bilderna observerades att ASCJ-ledytan i de två grupperna av möss med avskurna ligament var grövre än hos mössen i sham-gruppen, osteofyter bildades runt lederna och benvolymfraktionen i leden ökade. Dessa resultat tyder på att ASCJ-ledbrosket i ligamentamputationsgruppen hade degenerativa lesioner. Färgningen av ledbrosksektionerna visade broskdegeneration, såsom diskontinuitet i broskytan och en minskning av kondrocyter, vilket ytterligare verifierade att långvarig ASCJ-instabilitet kunde utvecklas till PTOA, vilket liknar de resultat som beskrivs av Chang et al.18.
I processen för modelletablering är nyckeln till framgångsrik modellering att exakt hitta motsvarande ligament för skärning. Samtidigt kan en måttlig ökning av mössens aktivitet påskynda deras utveckling av artros. I den efterföljande färgningsprocessen spelar avkalkning av musens fotledsvävnad en avgörande roll. Därför är det nödvändigt att ofta observera vävnadens hårdhet och välja en lämplig snittningstid.
I studien användes ett gångpapper för att analysera förändringarna i mössens gång före och efter operationen, och endast förändringar i mössens steglängd erhölls. Om ett instrument för analys av djurs gång användes skulle fler parametrar kunna analyseras beroende på storlek och area, position, rörelsedynamik och tryck för varje steg hos mössen för kvalitativ och kvantitativ analys av gången. Dessutom är Semmes Weinsteins monofilamentdetektion internationellt erkänd som en mycket effektiv metod för att detektera sensoriska störningarvid beröring 25, och bättre experimentella resultat kan erhållas om denna metod används för att utvärdera den sensoriska funktionen hos mössens fötter. På grund av de begränsade experimentella förhållandena och bristen på instrument för analys av djurs gång, användes dock inte Semmes Weinsteins monofilamentdetektion. Därför finns det möjligheter till fördjupade studier med hjälp av dessa experimentella tekniker i framtiden.
Eftersom PTOA är en kronisk degenerativ sjukdom26 bör ledinstabilitet och broskskador observeras vid olika tidpunkter, och detta är värt fler långsiktiga och fleråriga studier i framtiden. Dessutom, på grund av den lilla strukturen hos musens ASCJ, kunde kondrocyterna inte extraheras för in vitro-experiment för att utvärdera förändringarna i inflammatoriska faktorer och för att verifiera förekomsten av PTOA på cellulär nivå. I framtida studier kommer mer tid och energi att läggas på att studera de underliggande molekylärbiologiska mekanismerna för ASCJ-degeneration. För det andra, även om strukturen hos musens bakfötter och vrister liknar människans, är möss strängt taget fyrfotadjur, medan människor är tvåbenta, och krafterna som upplevs av lederna under rörelse är inte exakt desamma.
Den framgångsrika etableringen av ASCJ-instabilitetsmusmodellen utökar dock den enkla fotledsinstabilitetsdjurmodellen till ASCJ-instabilitetsdjurmodellen, vilket ger en mer omfattande förståelse för mekanismen för fotinstabilitet och ger en ny förståelse för studier av kliniska fotsjukdomar, samt en djurmodell för diagnos och behandling av sjukdomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Jiangsu-provinsens regerings stipendieprogram och Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
