Summary
L'articolazione complessa caviglia-sottoastragalica (ASCJ) è il nucleo del piede e svolge un ruolo chiave nel controllo dell'equilibrio nelle attività quotidiane. Gli infortuni sportivi spesso portano all'instabilità di questa articolazione. Qui, descriviamo un modello murino di instabilità indotta dalla transezione legamentosa dell'ASCJ.
Abstract
Le distorsioni della caviglia sono forse gli infortuni sportivi più comuni nella vita quotidiana, spesso con conseguente instabilità dell'articolazione del complesso caviglia-sottoastragalico (ASCJ) e possono eventualmente portare all'artrosi post-traumatica (PTOA) a lungo termine. Tuttavia, a causa della complessità del meccanismo della lesione e delle manifestazioni cliniche, come ecchimosi, ematoma o dolorabilità nel piede laterale, non esiste un consenso clinico sulla diagnosi e sul trattamento dell'instabilità dell'ASCJ. Poiché la struttura muscolo-scheletrica delle ossa e dei legamenti del retropiede del topo è paragonabile a quella degli esseri umani, un modello animale di instabilità dell'ASCJ nei topi è stato stabilito dalla transezione dei legamenti attorno all'ASCJ. Il modello è stato ben convalidato attraverso una serie di test comportamentali e analisi istologiche, tra cui un test del fascio di equilibrio, un'analisi dell'impronta (una valutazione del livello di esercizio e della capacità di equilibrio nei topi), una valutazione della nocicezione termica (una valutazione della funzione sensoriale del piede nei topi), una scansione con tomografia microcomputerizzata (TC) e la colorazione della sezione della cartilagine articolare (una valutazione del danno e della degenerazione della cartilagine articolare nei topi). Il successo della creazione di un modello murino di instabilità ASCJ fornirà un prezioso riferimento per la ricerca clinica sul meccanismo della lesione e si tradurrà in migliori opzioni di trattamento per la distorsione della caviglia.
Introduction
Le distorsioni della caviglia sono uno degli infortuni sportivi più comuni in tutto il mondo. Si stima che 10.000 persone si infortunano ogni giorno negli Stati Uniti1, di cui gli infortuni legati allo sport rappresentano il 15%-45%2. I costi medici associati al trattamento delle distorsioni della caviglia negli Stati Uniti ammontano a 4,2 miliardi di dollari all'anno 3,4,5. L'instabilità cronica del piede è un problema comune dopo le distorsioni della caviglia e si verifica in circa il 74% delle distorsioni della caviglia6, compresa l'instabilità della caviglia o sottoastragalica. Tuttavia, a causa dei sintomi e dei segni clinici simili, è difficile per il personale medico distinguere se l'instabilità cronica della caviglia è accompagnata anche da un'instabilità cronica dell'articolazione sottoastragalica in clinica e, di conseguenza, l'instabilità cronica del sottoastragalo può essere facilmente ignorata. Pertanto, la vera incidenza dell'instabilità cronica dell'articolazione complessa caviglia-sottoastragalica (ASCJ) (un tipo specifico di instabilità cronica del piede che include sia l'instabilità cronica della caviglia che l'instabilità cronica sottoastragalica) può essere superiore a quella riportata 7,8,9. Se non trattata, l'instabilità cronica dell'articolazione del complesso caviglia-sottoastragalico può causare ripetute distorsioni della caviglia, portando a un circolo vizioso di distorsioni della caviglia e instabilità cronica del complesso caviglia-sottoastragalico. L'instabilità cronica a lungo termine del complesso caviglia-sottoastragalico può portare alla degenerazione dell'ASCJ e all'artrosi post-traumatica, che può interessare le articolazioni adiacenti nei casi più gravi10. Per queste malattie, l'attuale trattamento clinico è principalmente conservativo, oltre ai metodi di trattamento chirurgico come la riparazione dei legamenti e la ricostruzione dei legamenti11,12.
L'ASCJ è la struttura centrale del piede e mantiene l'equilibrio del corpo durante il movimento13. Sono state condotte ricerche approfondite sulla struttura dell'articolazione della caviglia e dell'articolazione sottoastragalica separatamente14,15,16,17. Tuttavia, la ricerca sull'intera articolazione caviglia-sottoastragalica è rara. Circa un quarto dei casi di lesione alla caviglia è associato a lesione dell'articolazione sottoastragalica18. A causa del complesso meccanismo di lesione dell'instabilità dell'ASCJ, non c'è consenso sulla diagnosi e sul trattamento in ambito clinico. Considerando l'attuale situazione delle lesioni alla caviglia in clinica, è necessario un metodo più scientifico per studiare la caviglia e l'articolazione sottoastragalica nel suo complesso, fornendo così una nuova comprensione per lo studio delle malattie del piede.
Poiché la struttura anatomica del retropiede del topo a livello muscolo-scheletrico è paragonabile a quella del piede umano 19, in diversi studi sono già stati implementati modelli murini per la ricerca piede/caviglia10,19. Chang et al.19 hanno sviluppato con successo tre diversi modelli murini di osteoartrosi della caviglia. Ispirati dall'instaurazione dell'instabilità della caviglia nel modello murino, abbiamo stabilito un modello murino per l'instabilità del complesso caviglia-sottoastragalico, ipotizzando che la transezione dei legamenti parziali nel retropiede del topo avrebbe provocato un'instabilità meccanica dell'ASCJ, che avrebbe portato all'osteoartrite post-traumatica (PTOA) dell'ASCJ. Il modello animale di instabilità ASCJ potrebbe essere utilizzato per il trattamento sia dell'instabilità della caviglia che dell'instabilità sottoastragalica, che è più in linea con la situazione clinica reale rispetto al modello di instabilità della caviglia semplice 7,8,9,19 attualmente utilizzato. Per testare questa ipotesi, sono stati progettati due modelli murini di instabilità indotta da transezione legamentosa dell'ASCJ. I risultati per la funzione senso-motoria - il test del fascio di equilibrio, l'analisi dell'impronta e la valutazione della nocicezione termica - sono stati utilizzati per valutare la fattibilità del modello, mentre la micro-tomografia computerizzata (TC) e la colorazione istologica sono state utilizzate per valutare il danno e la degenerazione della cartilagine articolare del topo. Il successo della creazione di un modello murino di instabilità ASCJ non solo fornisce una nuova comprensione per lo studio delle malattie del piede, ma fornisce anche un prezioso riferimento per la ricerca clinica sui meccanismi correlati alla lesione, fornisce migliori opzioni di trattamento per le distorsioni della caviglia ed è utile per ulteriori studi sulla malattia.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Soochow University.
1. Procedure chirurgiche
- Dividere 21 topi maschi C57BL/6 di 6 settimane in tre gruppi: il gruppo del legamento cervicale trasverso e del legamento peroneo-astragalico anteriore, il gruppo del legamento cervicale trasverso e del legamento deltoideo e il gruppo della chirurgia fittizia. Assicurarsi che tutti i topi siano stati allevati in un ambiente che soddisfi specifici standard di assenza di agenti patogeni (SPF).
- Acclimatare i topi al nuovo ambiente di allevamento (un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore e una temperatura e umidità costanti rispettivamente di 18-22 °C e 40%-70%) per 2 settimane prima dell'esperimento. Sottoponi i topi a un allenamento per l'equilibrio e l'andatura, passando da un'estremità di una trave di equilibrio o di un tubo a forma di U all'altra estremità senza fermarsi, 1 settimana prima dell'esperimento.
- All'età di 8 settimane, anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano bagnando un batuffolo di cotone con 2 ml di isoflurano e mettendolo in un contenitore ermetico per la completa volatilizzazione. Monitorare l'attività del topo e continuare l'inalazione fino a quando l'attività del topo non si è ridotta in modo significativo. Determinare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei topi per osservare le loro reazioni. Inalare l'isoflurano vaporizzato (2%) attraverso una maschera facciale per mantenere l'anestesia nei topi durante le operazioni successive. Utilizzare un unguento per gli occhi veterinario durante l'anestesia per evitare che gli occhi si secchino.
- Dopo l'anestesia, rimuovere i peli sull'articolazione della caviglia degli arti posteriori destri del topo con un rasoio e disinfettare la pelle esposta tre volte alternando cicli di batuffoli di cotone allo iodio e batuffoli di cotone imbevuti di alcol. Somministrare 5 mg/kg di carprofene per iniezione sottocutanea. Trasferire il topo nella sala operatoria dell'animale di microchirurgia utilizzando un tampone chirurgico sterile.
- Per il gruppo legamento cervicale trasverso e legamento peroneo-astragalico anteriore (CL + ATFL), eseguire un'incisione longitudinale obliqua verso il basso di 7 mm con un bisturi sulla pelle sopra l'articolazione della caviglia destra e sondare con una microscopica pinza diritta davanti all'articolazione della caviglia.
- Assicurarsi dell'esposizione dell'ATFL al bordo inferiore del corpo astragalico e del perone dopo il sondaggio e tagliarlo delicatamente con un bisturi. Separare i tendini del perone lungo e corto e i tendini estensori lunghi delle dita, esporre il CL e tagliarlo con un bisturi.
- Per il gruppo CL trasverso + legamento deltoide (DL), praticare un'incisione verticale di 8 mm sulla pelle mediale dell'articolazione della caviglia destra e separare bruscamente il DL dal malleolo mediale per tagliarlo definitivamente. Quindi, tagliare il CL come descritto al punto 1.5.
- Per il gruppo sham (gruppo di finta chirurgia), eseguire un intervento chirurgico fittizio sull'articolazione della caviglia destra ma non tagliare alcun legamento.
- Sciacquare l'incisione con soluzione fisiologica normale sterile e suturarla con filo di nylon chirurgico 5-0. Infine, disinfettare l'incisione suturata con un batuffolo di cotone iodico.
- Tenere il topo sotto osservazione fino a quando non è in grado di mantenere il decubito sternale e sorvegliarlo fino a quando non è completamente cosciente. Disinfettare l'incisione della caviglia due volte al giorno con un batuffolo di cotone allo iodio e somministrare carprofene (5 mg/kg, iniezione sottocutanea), una volta al giorno per 1 settimana. Alzati da solo dopo l'operazione e presta molta attenzione alle condizioni postoperatorie del topo.
- Due settimane dopo l'intervento chirurgico e quando il gonfiore dell'articolazione della caviglia si è ridotto, iniziare ad allenare i topi nella macchina per la fatica rotante del mouse per 1 ora al giorno.
2. Test del fascio di equilibrio
- Fissare una trave circolare in legno con una lunghezza di 1 m e un diametro di 20 mm, inclinata di 15° a un'estremità, con una clip per treppiede fotografico e posizionare l'altra estremità su un piano di lavoro collegato a una cassetta chiusa.
- Eseguire l'allenamento del fascio di equilibrio 1 settimana prima dell'intervento chirurgico per assicurarsi che i topi si muovano agevolmente da un'estremità all'altra del raggio. Si consideri che un topo ha superato il test quando passa attraverso il raggio due volte in 60 s senza fermarsi.
- Eseguire due prove consecutive per ogni topo e spruzzare il bilanciere con alcol al 75% dopo ogni prova per evitare che l'odore residuo del topo precedente influisca sul topo successivo.
- Eseguire il test del fascio di equilibrio prima dell'intervento, 3 giorni, 1 settimana, 4 settimane, 8 settimane e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico. Registra il tempo medio di ogni topo che passa la trave di equilibrio due volte di seguito e il numero di volte in cui il retropiede destro scivola dalla trave come variabili dipendenti.
3. Analisi dell'impronta
- Posizionare un canale di plastica a forma di U con una lunghezza di 50 cm, una larghezza di 10 cm e un'altezza di 10 cm sul tavolo sperimentale e collegare un'estremità del canale di plastica a una cassetta chiusa.
- Posiziona una carta pigmentata piatta nel canale, quindi tieni il mouse con entrambe le mani e dipingi uniformemente le zampe anteriori e posteriori con pigmento rosso e verde non tossico.
- Posiziona delicatamente il mouse dipinto a un'estremità del canale e lascialo spostare all'altra estremità della cassetta. Prendi la carta pigmentata con le impronte, segnala e mettila su una griglia ad asciugare in un luogo ventilato e ombreggiato.
- Dopo che ogni topo è passato, spruzzare il canale di plastica a forma di U con alcol al 75% in modo da evitare che l'odore residuo del topo precedente influisca sul topo successivo.
- Seleziona tre impronte di topo chiare consecutive su ciascun foglio e usa un righello per misurare la lunghezza del passo dell'impronta del piede destro del mouse, nonché la larghezza del passo tra le impronte sinistra e destra.
4. Valutazione della nocicezione termica
- Durante l'esperimento, utilizzare il test plantare per registrare il tempo di reazione alla nocicezione termica del piede del topo e il tempo di reazione del topo durante l'attività e il riposo, rispettivamente. Registra i dati di misurazione in pochi secondi.
- Posizionare il mouse nello strumento di misura, allineare lo strumento con il piede destro e iniziare a riscaldare lo strumento con la temperatura che aumenta lentamente. Osserva la risposta del mouse. Quando la temperatura aumenta al di sopra della tolleranza, il mouse si ritrae rapidamente o si lecca il piede destro. Registrare il tempo utilizzando lo strumento e definire il tempo come tempo di reazione durante l'attività.
- Per misurare il tempo di reazione a riposo, lasciare che il mouse si sieda per 30 minuti sul tavolo di riposo senza riscaldarsi, quindi ottenere i dati temporali come spiegato al punto 4.2. Utilizzare questi dati temporali acquisiti per analisi successive.
5. Scansione micro-CT
- Sopprimere topi di 12 settimane con anidride carbonica dopo l'intervento, staccare la pelle della caviglia destra e poi tagliare la tibia media e il perone con forbici chirurgiche per ottenere campioni completi di caviglia. Collocare i campioni in provette da centrifuga da 15 mL contrassegnate contenenti formalina neutra al 10% per 48 ore.
- Dopo il fissaggio, posizionare i campioni in lotti (quattro campioni per lotto) in uno speciale serbatoio di spugna per la scansione micro-CT. Impostare i parametri della macchina come segue: tensione = 50 kV, corrente = 200 mA, filtro = 0,5 mmAl e risoluzione = 9 μm. Eseguire lo scanner micro-CT.
- Dopo la scansione, utilizzare il software di ricostruzione per delineare l'intervallo dell'immagine e selezionare una posizione angolare specifica dopo aver regolato l'asse XYZ dell'immagine delineata utilizzando un software di analisi dei dati commerciale, come descritto in Liu et al.10.
- Utilizzare il software di analisi micro-CT per selezionare le regioni continue a 10 strati di interesse nelle immagini ristrutturate regolate dagli assi XYZ e analizzare quantitativamente le articolazioni necessarie per determinare la frazione di volume osseo (BV/TV), come descritto in Liu et al.10.
- Infine, utilizzare un software di elaborazione delle immagini mediche tridimensionali per eseguire l'elaborazione tridimensionale delle immagini TC delle articolazioni della caviglia del topo, come descritto in Liu et al.10. Dopo la ricostruzione, osservare l'usura e la formazione degli osteofiti nell'ASCJ.
6. Colorazione della cartilagine articolare in sezione
NOTA: Tutte le fasi di colorazione vengono eseguite in una cappa aspirante e durante la procedura viene indossata una maschera.
- Utilizzare pinzette microscopiche e forbici per rimuovere i tessuti molli in eccesso intorno ai campioni di caviglia, quindi posizionare i campioni in una provetta da centrifuga contenente una soluzione di decalcificazione EDTA al 10% preparata con 44 g di NaOH, due confezioni di PBS e 400 g di EDTA-2Na, con il pH regolato a 7,35-7,45 con acido cloridrico, e contrassegnare i diversi gruppi.
- Successivamente, posizionare la provetta da centrifuga su un tavolo vibrante (velocità impostata su 20 giri/min) per la decalcificazione e cambiare la soluzione di decalcificazione una volta al giorno. Determinare la decalcificazione dei campioni.
- Dopo 1 mese di decalcificazione, disidratare i campioni con alcool a gradiente e quindi utilizzare l'n-butanolo per 8 ore a scopo di pulizia. Infine, immergere i campioni eliminati in paraffina in posizione coronale per l'inclusione.
- Mettere i campioni di paraffina in frigorifero a 4 °C per un uso successivo. Prima del sezionamento, prelevare i campioni dal frigorifero a 4 °C e metterli in un congelatore a -20 °C per circa 10 minuti per facilitare il taglio dell'intero piano.
- Fissare i campioni sul microtomo e sezionarli a uno spessore di 6 μm. Allo stesso tempo, utilizzare un microscopio per osservare se i campioni sono stati tagliati al livello previsto: facilità di penetrazione di un ago da siringa nel tessuto osseo.
- Regolare in anticipo la temperatura dell'acqua della comprimitrice a 40 °C. Quindi, taglia due o tre sezioni complete di paraffina in fila e trasferiscile nella macchina per compresse per un'espansione completa. Quindi, rimuovere le sezioni di paraffina con un vetrino e scolare l'acqua. Infine, contrassegna le diapositive con gruppi e numeri.
7. Colorazione dell'ematossilina e dell'eosina (H&E)
- Mettere le sezioni in un incubatore a 60 °C in modo tale che la struttura intatta dell'articolazione ASCJ possa essere osservata al microscopio e cuocere le sezioni per 40-50 minuti. Quindi, decerare le sezioni con xilene 3x, numerate come I, II e III per una facile identificazione, rispettivamente per 15 minuti, 15 minuti e 10 minuti.
- Posizionare le sezioni decerate in etanolo al 100% 2x, numerato come I e II per una facile identificazione, etanolo al 90% ed etanolo all'80% rispettivamente per 3 minuti, 3 minuti, 5 minuti e 5 minuti. Successivamente, lavare le sezioni con acqua bidistillata (ddH2O) per 5 min.
- Dopo l'ammollo con ematossilina per 1 minuto, lavare le sezioni con ddH2O fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 s e lavarle 3 volte per 1 min con ddH2O. Successivamente, colorare le sezioni con una soluzione di ammoniaca all'1% per 1 minuto, quindi lavare 3 volte per 1 minuto ciascuna con ddH2O.
- Successivamente, colorare i campioni con una soluzione colorante di eosina per 1 minuto, quindi metterli in etanolo al 95% e etanolo al 100% per 1 minuto ciascuno in successione. Infine, trattare le sezioni con xilene IV per 1 minuto.
- Asciugare all'aria le sezioni, incollare una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini e coprirli con un vetrino coprioggettivo. Quindi, scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5x e 20x.
8. Colorazione verde Safranina O-fast
- Mettere le sezioni selezionate in un'incubatrice a 60 °C e cuocere le sezioni per 40-50 minuti. Quindi, decerare le sezioni con xilene I, II e III rispettivamente per 15 minuti, 15 minuti e 10 minuti.
- Posizionare le sezioni decerate in etanolo al 100% I, II, etanolo al 90% ed etanolo all'80% rispettivamente per 3 minuti, 3 minuti, 5 minuti e 5 minuti. Successivamente, lavare le sezioni con ddH2O per 5 min.
- Dopo l'ammollo con ematossilina per 1 minuto, lavare le sezioni con ddH2O fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 s e lavarle 3 volte per 1 min con ddH2O. Quindi, colorare le sezioni con una soluzione di ammoniaca all'1% per 1 minuto e lavarle 3 volte per 1 minuto ciascuna con ddH2O.
- Immergere le sezioni in verde rapido allo 0,05% per 2 minuti, quindi immergere le sezioni in una soluzione di acido acetico all'1% per 30 secondi e in safranina allo 0,1% per 5 minuti. Mettere i campioni colorati in etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 1 minuto, uno dopo l'altro.
- Infine, trattare le sezioni con xilene IV per 1 minuto. Asciugare all'aria le sezioni, incollare una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini e coprirli con un vetrino coprioggettivo. Quindi, scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5x e 20x.
9. Immunoistochimica
- Giorno 1: Mettere le sezioni selezionate in un'incubatrice a 60 °C, cuocere le sezioni per 40-50 minuti, quindi decerarle con xilene I, II e III rispettivamente per 15 minuti, 15 minuti e 10 minuti. Posizionare le sezioni decerate in etanolo al 100% I, II, etanolo al 90% ed etanolo all'80% rispettivamente per 3 minuti, 3 minuti, 5 minuti e 5 minuti. Quindi, lavare le sezioni con ddH2O per 5 minuti, utilizzare una penna istochimica per cerchiare l'area del campione e posizionarle in una scatola scura.
- Recupero dell'antigene: far cadere 20-50 μL di tripsina allo 0,25% nell'area del campione cerchiato, incubare in un incubatore a 37 °C per 60 minuti, quindi lavare i campioni 3 volte per 2 minuti ciascuno con PBS. Bloccare la perossidasi endogena aggiungendo il 3% di H 2 O 2 , incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente al buio e poi lavarli 3 volte per2minuti ciascuno con PBS. Eseguire il blocco del siero aggiungendo il 10% di siero di capra a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi incubare con l'anticorpo primario (collagene di tipo II anti-topo di topo, diluito 1.000 volte) a 4 °C per una notte.
- Giorno 2: Riscaldare le sezioni a temperatura ambiente per 30 min. Recuperare l'anticorpo primario e lavare le sezioni 3 volte per 2 minuti ciascuna con PBS. Incubare con l'anticorpo secondario per 40 minuti in un'incubatrice a 37 °C, quindi lavare le sezioni 3 volte per 2 minuti ciascuna con PBS.
- Sviluppo del colore DAB: aggiungere 5 mL di ddH 2O, due gocce di tampone, quattro gocce di DAB e due gocce di H 2 O2per preparare il reagente DAB. Aggiungere 20-50 μL di reagente alle sezioni, tenere i campioni al riparo dalla luce per 5 minuti, quindi lavare le sezioni per 2 minuti con ddH2O.
- Dopo l'ammollo con ematossilina per 1 minuto, lavare le sezioni con ddH2O fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 secondi e lavarle 3 volte per 1 minuto ciascuna con ddH 2 O. Colorare le sezioni per 1 minuto con una soluzione di ammoniaca all'1%, quindi lavarle 3 volte per 1 minuto ciascuna conddH2O.
- Quindi, posizionare le sezioni rispettivamente in etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 1 minuto ciascuna. Infine, incubare le sezioni per 1 minuto con xilene IV. Asciugare all'aria le sezioni, incollare una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini e coprirli con un vetrino coprioggettivo. Quindi, scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5x e 20x.
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Representative Results
L'analisi statistica dei dati di correlazione è stata effettuata utilizzando strumenti di analisi statistica online. I dati che hanno soddisfatto i due test di distribuzione normale e omogeneità della varianza sono stati utilizzati per un'ulteriore analisi statistica mediante analisi unidirezionale della varianza. Se i dati non soddisfacevano i due test, per l'analisi statistica è stato utilizzato il test di Kruskal-Wallis. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD) e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Test del fascio di equilibrio
L'analisi statistica del tempo medio necessario a ciascun topo per passare due volte attraverso il fascio di equilibrio in ogni fase ha mostrato che non c'erano differenze statistiche nel tempo necessario a ciascun gruppo di topi per superare il fascio di equilibrio prima dell'intervento chirurgico (p = 0,73). Tre giorni dopo l'intervento chirurgico, i topi nei gruppi CL + ATFL e CL + DL hanno richiesto un tempo più lungo per passare attraverso il fascio di equilibrio rispetto ai topi nel gruppo sham e la differenza è stata statisticamente significativa (p < 0,05). Quattro settimane dopo l'intervento chirurgico, non sono state osservate differenze significative nel tempo impiegato dai topi nei gruppi CL + ATFL e CL + DL per superare il fascio di equilibrio rispetto ai topi nel gruppo sham (p > 0,05). Inoltre, 8 settimane e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, i topi nei gruppi CL + ATFL e CL + DL hanno richiesto più tempo per superare il fascio di equilibrio rispetto ai topi nel gruppo sham e la differenza è risultata statisticamente significativa (p < 0,01). Non sono state osservate differenze statisticamente significative nel tempo impiegato dai topi del gruppo CL + ATFL per superare il fascio di equilibrio rispetto ai topi del gruppo CL + DL durante ciascun periodo di prova (p > 0,05; Figura 1A).
Il numero di volte in cui il piede posteriore destro del topo è scivolato attraverso la trave di equilibrio non era statisticamente diverso tra i tre gruppi di topi prima dell'intervento chirurgico (p = 0,68). Inoltre, non sono state osservate differenze significative nel numero di sezioni del retropiede destro per i topi nei gruppi CL + ATFL e CL + DL rispetto ai topi nel gruppo sham 3 giorni dopo l'intervento chirurgico. Per quanto riguarda altri punti temporali postoperatori, il numero di sezioni nel gruppo di transezione legamentosa era più alto rispetto a quello dei topi nel gruppo sham e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,05). A 8 settimane e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, il numero di volte in cui il retropiede destro nel gruppo CL + ATFL è scivolato fuori dalla trave di equilibrio è stato superiore a quello dei topi nel gruppo CL + DL e la differenza è stata statisticamente significativa (p < 0,05; Figura 1B).
Analisi dell'impronta
La lunghezza del passo dei topi in ciascun gruppo è aumentata con l'età, ma la recisione del legamento potrebbe accorciare la lunghezza del passo. Non sono state osservate differenze significative nella lunghezza del passo del retropiede destro tra i tre gruppi di topi prima dell'intervento chirurgico (p > 0,05). Nel test del passo 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, la lunghezza del passo del retropiede destro nel gruppo tagliato dai legamenti era più breve rispetto al gruppo sham nello stesso periodo e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,01). Tuttavia, la lunghezza del passo del retropiede destro per i topi del gruppo CL + ATFL non era significativamente diversa da quella dei topi del gruppo CL + DL (p > 0,05; Figura 2A,B).
Valutazione della nocicezione termica
L'analisi statistica del tempo di risposta alla nocicezione termica dei piedi dei topi durante l'attività ha mostrato che non c'erano differenze statistiche nei tempi di reazione dei tre gruppi di topi prima dell'intervento chirurgico (p > 0,5). Nella valutazione della nocicezione termica dopo l'intervento chirurgico, i tempi di risposta della nocicezione termica dei topi nel gruppo tagliato dei legamenti erano più lunghi di quelli dei topi nel gruppo sham nello stesso periodo e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,01; Figura 3).
Scansione micro-CT
Dodici settimane dopo l'intervento chirurgico, la micro-TC è stata utilizzata per analizzare quantitativamente l'ASCJ del retropiede destro per i topi di ciascun gruppo. La ricostruzione tridimensionale delle immagini TC ha mostrato che l'ASCJ del retropiede destro nei due gruppi con legamenti recisi era più ruvida di quella nel gruppo sham. La superficie articolare era concava, convessa e piatta, c'erano evidenti segni di usura, gli osteofiti si generavano intorno alle articolazioni e le articolazioni mostravano cambiamenti degenerativi. Inoltre, circa il 28,6% dei topi del gruppo CL + DL ha sviluppato una lussazione dell'astragalo (Figura 4A,B)10. La frazione di volume osseo dell'ASCJ del retropiede destro nei gruppi CL + ATFL e CL + DL era significativamente più alta rispetto al gruppo sham e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,01; Figura 4C,D)10.
Colorazione in sezione della cartilagine articolare
La colorazione verde H&E e Safranina O-fast ha mostrato che la struttura dell'ASCJ dei topi nel gruppo sham era completa, la morfologia della cartilagine era intatta e i condrociti erano distribuiti uniformemente. Lo strato di cartilagine dell'ASCJ dei due gruppi di topi con tagli ai legamenti ha mostrato un'evidente discontinuità e il numero di condrociti è diminuito (Figura 5A,B)10. Il sistema di punteggio modificato di Mankin e Osteoarthritis Research Society International (OARSI) è stato utilizzato per valutare la colorazione verde H&E e Safranina O-fast dell'ASCJ per i topi di ciascun gruppo20,21,22. Il punteggio di Mankin modificato è stato determinato dalle caratteristiche strutturali della cartilagine e dal numero e dalla colorazione dei condrociti, mentre il punteggio OARSI è stato determinato dal grado istopatologico e dallo stadio della cartilagine. I punteggi dei due gruppi di topi con amputazione dei legamenti erano superiori a quelli dei topi del gruppo sham e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,05; Figura 5C-F)10.
Le immagini della tipica colorazione immunoistochimica del collagene di tipo II hanno mostrato che il contenuto di collagene di tipo II nello strato di cartilagine articolare ASCJ del retropiede destro nel gruppo sham era più uniforme rispetto a quello dei due gruppi di topi con legamenti recisi e non c'era alcuna perdita evidente di collagene di tipo II (Figura 6A). I risultati dell'analisi quantitativa hanno mostrato che l'espressione del collagene di tipo II nell'ASCJ dei topi del gruppo sham era superiore a quella dei due gruppi di topi con legamenti recisi, e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,05; Figura 6B,C).
Figura 1: Analisi comportamentale dei topi utilizzando il test del fascio di bilanciamento . (A) Tempo necessario ai topi per attraversare il raggio di equilibrio. (B) Il numero di scivolamenti del piede destro durante l'attraversamento della trave di equilibrio. I dati rappresentano la media ± deviazione standard, n = 7 campioni per gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi comportamentale dei topi utilizzando l'analisi dell'impronta. (A) Confronto della lunghezza del passo destro per i topi di ciascun gruppo prima dell'intervento chirurgico. (B) Confronto della lunghezza del passo destro per i topi di ciascun gruppo 12 settimane dopo l'intervento chirurgico. Le differenze statisticamente significative sono indicate da **, dove p < 0,01, e ***, dove p < 0,001 tra i gruppi indicati. I dati rappresentano la media ± deviazione standard, n = 7 campioni per gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi comportamentale dei topi utilizzando la valutazione della nocicezione termica. Tempi di risposta alla nocicezione termica durante l'attività nei topi. I dati rappresentano la media ± deviazione standard, n = 7 campioni per gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi micro-CT del piede destro di un topo. (A) Ricostruzione tridimensionale dell'astragalo di topo senza lussazione nel complesso caviglia-articolazione sottoastragalica (vista laterale, vista mediale, vista anteriore). (B) Ricostruzione tridimensionale dell'astragalo di topo lussato nel complesso caviglia-articolazione sottoastragalica (vista laterale, vista mediale, vista anteriore). (C) Analisi quantitativa della frazione di volume osseo (BV/TV) delle articolazioni della caviglia del topo. (D) Analisi quantitativa della frazione di volume osseo (BV/TV) delle articolazioni sottoastragaliche del topo. Le frecce nere indicano la formazione di osteofiti o la lussazione dell'astragalo. Le differenze statisticamente significative sono indicate da ***, dove p < 0,001 tra i gruppi indicati. Questa cifra è stata modificata da Liu et al.10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Colorazione verde H&E e Safranina O-fast e analisi delle articolazioni della caviglia. (A) Colorazione H&E delle articolazioni caviglia-sottoastragalica del topo. (B) Colorazione O-fast con safranina delle articolazioni sottoastragali-caviglia del topo. (C) Punteggi di Mankin modificati per le articolazioni della caviglia del topo. (D) Punteggi di Mankin modificati per le articolazioni sottoastragaliche del topo. (E) Punteggi dell'Osteoarthritis Research Society International (OARSI) per le articolazioni della caviglia del topo. (F) Punteggi OARSI per le articolazioni sottoastragaliche del topo. Simboli: a = articolazione della caviglia; s = articolazione sottoastragalica. Le differenze statisticamente significative sono indicate da ***, dove p < 0,001 tra i gruppi indicati. Barra della scala = 100 μm, n = 7 campioni per gruppo. Questa cifra è stata modificata da Liu et al.10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Colorazione immunoistochimica e analisi delle articolazioni della caviglia. (A) Colorazione immunoistochimica del collagene di tipo II della caviglia del topo e delle articolazioni sottoastragaliche. (B) Percentuale di rapporto dell'area di collagene II (+) per le articolazioni della caviglia del topo. (C) Percentuale del rapporto tra l'area del collagene II (+) per le articolazioni sottoastragaliche del topo. Simboli: a = articolazione della caviglia; s = articolazione sottoastragalica. Le differenze statisticamente significative sono indicate da ***, dove p < 0,001 tra i gruppi indicati. Barra della scala = 100 μm, n = 7 campioni per gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, due modelli murini di instabilità ASCJ sono stati costruiti con successo sezionando CL + ATFL o CL + DL. Il tempo impiegato dai topi per passare attraverso il fascio di equilibrio è aumentato significativamente a 8 settimane e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, il che è simile ai risultati ottenuti dal team Hubbard-Turner tagliando il legamento laterale dell'articolazione della caviglia23,24. Nel test di scorrimento del piede destro, abbiamo osservato che i tempi di scorrimento dei due gruppi di topi con legamenti recisi erano significativamente più alti di quelli dei topi del gruppo sham e i tempi di scorrimento hanno raggiunto un massimo a 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, suggerendo così che i due gruppi di topi con legamenti recisi potrebbero aver sofferto di instabilità dell'ASCJ. Il test dell'andatura ha mostrato che, sebbene la lunghezza del passo dei topi aumentasse gradualmente con l'età, la lunghezza del passo di 12 settimane dei due gruppi di topi con legamenti recisi era inferiore a quella del gruppo sham e la lunghezza del passo del gruppo CL + ATFL era inferiore del 7,2% rispetto a quella del gruppo sham. Nel loro insieme, i risultati di cui sopra suggeriscono che il livello motorio e la capacità di equilibrio dei due gruppi di topi con amputazione del legamento erano significativamente compromessi.
Nella ricostruzione tridimensionale delle immagini TC, è stato osservato che la superficie articolare ASCJ nei due gruppi di topi con legamenti recisi era più ruvida di quella dei topi nel gruppo sham, si formavano osteofiti intorno alle articolazioni e la frazione di volume osseo dell'articolazione era aumentata. Questi risultati suggeriscono che la cartilagine articolare ASCJ nel gruppo con amputazione dei legamenti presentava lesioni degenerative. La colorazione delle sezioni di cartilagine articolare ha mostrato una degenerazione della cartilagine, come la discontinuità della superficie della cartilagine e una riduzione dei condrociti, che ha ulteriormente verificato che l'instabilità a lungo termine dell'ASCJ potrebbe svilupparsi in PTOA, che è simile ai risultati descritti da Chang et al.18.
Nel processo di creazione del modello, la chiave per una modellazione di successo è trovare con precisione i legamenti corrispondenti per il taglio. Allo stesso tempo, aumentare moderatamente l'attività dei topi può accelerare lo sviluppo dell'osteoartrite. Nel successivo processo di colorazione, la decalcificazione del tessuto articolare della caviglia del topo gioca un ruolo decisivo. Pertanto, è necessario osservare frequentemente la durezza del tessuto e selezionare un tempo di sezionamento appropriato.
Nello studio, è stata utilizzata una carta dell'andatura per analizzare i cambiamenti nell'andatura dei topi prima e dopo l'intervento chirurgico e sono stati ottenuti solo cambiamenti nella lunghezza del passo dei topi. Se si utilizzasse uno strumento di analisi dell'andatura animale, si potrebbero analizzare più parametri in base alle dimensioni e all'area, alla posizione, alle dinamiche di movimento e alla pressione di ogni passo dei topi per un'analisi qualitativa e quantitativa dell'andatura. Inoltre, il rilevamento del monofilamento di Semmes Weinstein è riconosciuto a livello internazionale come un metodo molto efficace per rilevare i disturbi sensoriali della pressione tattile25 e si possono ottenere risultati sperimentali migliori se questo metodo viene utilizzato per valutare la funzione sensoriale dei piedi dei topi. Tuttavia, a causa delle limitate condizioni sperimentali e dell'indisponibilità di strumenti per l'analisi dell'andatura degli animali, il rilevamento del monofilamento di Semmes Weinstein non è stato utilizzato; Pertanto, ci sono opportunità per studi approfonditi utilizzando queste tecniche sperimentali in futuro.
Poiché la PTOA è una malattia degenerativa cronica26, l'instabilità articolare e il danno alla cartilagine dovrebbero essere osservati in diversi punti temporali, e questo è degno di ulteriori studi a lungo termine e multi-punto temporale in futuro. Inoltre, a causa della piccola struttura dell'ASCJ murino, non è stato possibile estrarre i condrociti per esperimenti in vitro per valutare le variazioni dei fattori infiammatori e per verificare l'esistenza di PTOA a livello cellulare. Negli studi futuri, più tempo ed energia saranno spesi per studiare i meccanismi biologici molecolari alla base della degenerazione ASCJ. In secondo luogo, sebbene la struttura delle zampe posteriori e delle caviglie dei topi sia simile a quella degli esseri umani, a rigor di termini, i topi sono quadrupedi, mentre gli esseri umani sono bipedi e le forze sperimentate dalle articolazioni durante il movimento non sono esattamente le stesse.
Tuttavia, il successo dell'istituzione del modello murino di instabilità ASCJ estende il modello animale di instabilità semplice della caviglia al modello animale di instabilità ASCJ, che fornisce una comprensione più completa del meccanismo di instabilità del piede e fornisce una nuova comprensione per lo studio delle malattie cliniche del piede, nonché un modello animale per la diagnosi e il trattamento della malattia.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha interessi contrastanti.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal programma di borse di studio del governo provinciale di Jiangsu e dal programma accademico prioritario di sviluppo degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
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