Summary
발목-거골하 복합 관절(ASCJ)은 발의 핵심이며 일상 활동에서 균형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 스포츠 부상은 종종 이 관절의 불안정성을 초래합니다. 여기에서는 ASCJ의 인대 절개로 인한 불안정성의 마우스 모델을 설명합니다.
Abstract
발목 염좌는 아마도 일상 생활에서 가장 흔한 스포츠 부상일 것이며, 종종 발목-거골하 복합 관절(ASCJ)의 불안정성을 초래하고 결국 장기적으로 외상 후 골관절염(PTOA)으로 이어질 수 있습니다. 그러나 부상 메커니즘의 복잡성과 외측 발의 반상출혈, 혈종 또는 압통과 같은 임상 증상으로 인해 ASCJ 불안정성을 진단하고 치료하는 것에 대한 임상적 합의는 없습니다. 쥐 뒷발의 뼈와 인대의 근골격계 구조가 인간과 비슷하기 때문에 ASCJ 주변의 인대 횡단에 의해 마우스의 ASCJ 불안정성에 대한 동물 모델이 확립되었습니다. 이 모델은 균형 빔 테스트, 발자국 분석(생쥐의 운동 수준 및 균형 능력 평가), 열 통각 평가(생쥐의 발 감각 기능 평가), 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔 및 관절 연골 단면 염색(생쥐의 관절 연골 손상 및 퇴행 평가)을 포함한 일련의 행동 테스트 및 조직학적 분석을 통해 잘 검증되었습니다. ASCJ 불안정성의 마우스 모델을 성공적으로 확립하면 부상 메커니즘에 대한 임상 연구에 귀중한 참고 자료를 제공하고 발목 염좌에 대한 더 나은 치료 옵션을 제공할 것입니다.
Introduction
발목 염좌는 전 세계적으로 가장 흔한 스포츠 부상 중 하나입니다. 미국에서는 매일 10,000명이 부상을 입는 것으로 추정되며1 그 중 스포츠 관련 부상이 15%-45%2를 차지합니다. 미국에서 발목 염좌 치료와 관련된 의료 비용은 연간 42억 달러에 달합니다 3,4,5. 만성 발 불안정은 발목 염좌 후 흔히 발생하는 문제로, 발목 염좌의 약 74%에서 발생하며, 발목 또는 거골하 불안정성을 포함한다6. 그러나 임상적 증상 및 징후가 유사하기 때문에 의료진은 클리닉에서 만성 발목 불안정성이 만성 거골하 관절 불안정을 동반하는지 여부를 구별하기 어렵고, 그 결과 만성 거골하 불안정성을 쉽게 놓칠 수 있습니다. 따라서 만성 발목-거골하 복합 관절(ASCJ) 불안정성(만성 발목 불안정성과 만성 거골하 불안정성을 모두 포함하는 특정 유형의 만성 발 불안정성)의 실제 발생률은 보고된 것보다 높을 수 있습니다 7,8,9. 치료하지 않고 방치하면 만성 발목-거골하 복합 관절 불안정이 반복되어 발목 염좌와 만성 발목-거골하 복합 불안정성의 악순환으로 이어질 수 있습니다. 장기간의 만성 발목-거골하 복합체 불안정은 ASCJ의 퇴행과 외상 후 골관절염으로 이어질 수 있으며, 심한 경우 인접 관절에 영향을 미칠 수 있다10. 이러한 질환에 대한 현재의 임상적 치료는 주로 보존적 치료이며, 인대 재건 및 인대 재건과 같은 수술적 치료 방법11,12.
ASCJ는 발의 핵심 구조이며 동작13 동안 신체의 균형을 유지합니다. 발목 관절과 거골하 관절의 구조에 대한 광범위한 연구가 수행되었습니다14,15,16,17. 그러나 발목-거골하 관절 전체에 대한 연구는 드뭅니다. 발목 부상의 약 1/4은 거골하 관절 손상과 관련이 있다18. ASCJ 불안정성의 복잡한 손상 메커니즘으로 인해 임상 환경에서 진단 및 치료에 대한 합의가 이루어지지 않았습니다. 현재 임상에서 발목 부상의 현황을 고려할 때, 발목과 거골하 관절을 전체적으로 연구하여 발 질환 연구에 대한 새로운 이해를 제공하기 위해서는 보다 과학적인 방법이 필요합니다.
근골격계 수준에서 쥐 뒷발의 해부학적 구조는 인간의 발과 비슷하기 때문에19 여러 연구에서 발/발목 연구를 위한 마우스 모델이 이미 구현되었다10,19. Chang et al.19은 발목 골관절염에 대한 세 가지 다른 마우스 모델을 성공적으로 개발했습니다. 마우스 모델에서 발목 불안정성을 성공적으로 확립한 것에서 영감을 받아 발목-거골하 복합 불안정성에 대한 마우스 모델을 확립하여 마우스 뒷발의 부분 인대 절개가 ASCJ의 기계적 불안정성을 초래하여 ASCJ의 외상 후 골관절염(PTOA)으로 이어질 것이라는 가설을 세웠습니다. ASCJ 불안정성 동물모델은 발목 불안정성과 거골하 불안정성 모두에 사용될 수 있으며, 이는 현재 사용되는 단순 발목 불안정성 모델 7,8,9,19보다 실제 임상 상황에 더 부합합니다. 이 가설을 테스트하기 위해 ASCJ의 인대 절개로 인한 불안정성의 두 마우스 모델을 설계했습니다. 균형 빔 테스트, 발자국 분석 및 열 통각 평가와 같은 감각 운동 기능 결과는 모델의 타당성을 평가하는 데 사용되었으며 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 조직학적 염색은 마우스 관절 연골의 손상 및 변성을 평가하는 데 사용되었습니다. ASCJ 불안정성 마우스 모델의 성공적인 확립은 발 질환 연구에 대한 새로운 이해를 제공할 뿐만 아니라 부상 관련 메커니즘에 대한 임상 연구에 귀중한 참고 자료를 제공하고 발목 염좌에 대한 더 나은 치료 옵션을 제공하며 질병에 대한 추가 연구에 도움이 됩니다.
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Protocol
모든 동물 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 Soochow University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 수술 절차
- 생후 6주 된 C57BL/6 수컷 마우스 21마리를 횡경부 인대 및 전방 거골 인대 그룹, 횡경부 인대 및 삼각근 인대 그룹, 가짜 수술 그룹의 세 그룹으로 나눕니다. 모든 마우스가 특정 병원균 프리(SPF) 표준을 충족하는 환경에서 사육되었는지 확인하십시오.
- 실험 전 2주 동안 마우스를 새로운 사육 환경(12시간/12시간의 밝음/어둠 주기, 각각 18-22°C 및 40%-70%의 일정한 온도 및 습도)에 적응시킵니다. 실험 1주일 전에 생쥐에게 균형 빔 또는 U자형 파이프의 한쪽 끝에서 멈추지 않고 다른 쪽 끝으로 이동하면서 균형 빔과 보행 훈련을 실시합니다.
- 생후 8주가 되면 이소플루란 2mL의 면봉을 적셔 이소플루란 흡입을 사용하여 쥐를 마취하고 완전 휘발을 위해 밀폐 용기에 넣습니다. 마우스의 활동을 모니터링하고 마우스의 활동이 현저히 줄어들 때까지 계속 흡입합니다. 쥐의 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 결정하여 반응을 관찰합니다. 후속 수술 중에 마우스의 마취를 유지하기 위해 안면 마스크를 통해 기화된 이소플루란(2%)을 흡입합니다. 마취 중 동물용 눈 연고를 사용하여 눈이 건조해지는 것을 방지하십시오.
- 마취 후 면도기로 쥐의 오른쪽 뒷다리 발목 관절에 있는 털을 제거하고 노출된 피부를 요오드 면봉과 알코올 면봉을 번갈아 가며 3회 소독합니다. 5mg/kg의 카프로펜을 피하주사로 투여한다. 멸균 수술 패드를 사용하여 마우스를 미세 수술 동물 수술실로 옮깁니다.
- 횡경 인대와 전방 거골 인대(CL + ATFL) 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절 위 피부에 메스로 7mm 비스듬한 아래쪽 세로 절개를 하고 발목 관절 앞쪽에 미세한 직선 집게로 프로브합니다.
- 탐침 후 거골 몸체와 비골의 아래쪽 경계에 ATFL이 노출되도록 하고 메스로 부드럽게 자릅니다. 장섬유힘줄과 단비골힘줄, 신전근 장힘줄을 분리하고 CL을 노출시켜 메스로 자른다.
- 횡 CL + 삼각인대 (DL) 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절의 내측 피부를 8mm 수직으로 절개하고 DL과 내측 연골을 뭉툭하게 분리하여 최종적으로 절단합니다. 그런 다음 1.5단계에서 설명한 대로 CL을 자릅니다.
- 가짜 그룹(가짜 수술 그룹)의 경우 오른쪽 발목 관절에 가짜 수술을 하되 인대를 자르지 마십시오.
- 멸균 생리식염수로 절개 부위를 씻어내고 5-0 수술용 나일론 실로 봉합합니다. 마지막으로 봉합된 절개 부위를 요오드 면봉으로 소독합니다.
- 흉골 누움을 유지할 수 있을 때까지 쥐를 관찰하고 완전히 의식이 있을 때까지 감독하십시오. 발목 절개 부위는 요오드 면봉으로 하루 2회 소독하고 카프로펜(5mg/kg, 피하주사제)을 1주일 1일 1회 투여한다. 수술 후 혼자 뒤로 물러나 마우스의 수술 후 상태에 세심한 주의를 기울이십시오.
- 수술 후 2주가 지나고 발목 관절 부종이 가라앉으면 마우스 회전식 피로 기계에서 매일 1시간 동안 마우스 운동을 시작합니다.
2. 밸런스 빔 테스트
- Clamp 길이 1m, 직경 20mm의 원형 나무 빔을 사진 삼각대 클립으로 한쪽 끝이 15° 기울어지고 다른 쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결된 작업 표면에 놓습니다.
- 수술 1주일 전에 균형 빔 훈련을 수행하여 마우스가 빔의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 이동할 수 있도록 합니다. 마우스가 멈추지 않고 60초 동안 빔을 두 번 통과할 때 테스트를 통과한 것으로 간주합니다.
- 각 마우스에 대해 두 번의 연속 시도를 수행하고 각 시도 후 밸런스 빔에 75% 알코올을 분사하여 이전 마우스의 잔여 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 합니다.
- 수술 전 3일, 1주, 4주, 8주, 수술 후 12주에 밸런스빔 검사를 시행합니다. 각 마우스가 밸런스 빔을 연속으로 두 번 통과하는 평균 시간과 오른쪽 뒷발이 빔에서 미끄러지는 횟수를 종속 변수로 기록합니다.
3. 발자국 분석
- 길이 50cm, 너비 10cm, 높이 10cm의 U자형 플라스틱 채널을 실험 테이블에 놓고 플라스틱 채널의 한쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결합니다.
- 일반 안료 용지를 채널에 평평하게 놓은 다음 양손으로 마우스를 잡고 무독성 빨간색과 녹색 안료로 앞발과 뒷발을 고르게 칠합니다.
- 페인트 칠한 마우스를 채널의 한쪽 끝에 부드럽게 놓고 카세트의 다른 쪽 끝으로 이동시킵니다. 발자국이 있는 착색지를 꺼내 표시한 다음 선반에 올려 통풍이 잘되고 그늘진 곳에서 말립니다.
- 각 마우스가 지나간 후 U자형 플라스틱 채널에 75% 알코올을 뿌려 이전 마우스의 잔여 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 합니다.
- 각 용지에서 세 개의 연속된 투명 마우스 발자국을 선택하고 자를 사용하여 마우스 오른쪽 발자국의 계단 길이와 왼쪽 발자국과 오른쪽 발자국 사이의 계단 너비를 측정합니다.
4. 열 통각 평가
- 실험하는 동안 발바닥 테스트를 사용하여 쥐 발의 열 통각 반응 시간과 활동 및 휴식 중 쥐의 반응 시간을 각각 기록합니다. 측정 데이터를 몇 초 만에 기록합니다.
- 마우스를 측정기에 놓고 기기를 오른발에 맞춘 다음 온도가 천천히 상승하면서 기기를 가열하기 시작합니다. 마우스의 반응을 관찰합니다. 온도가 허용 오차 이상으로 올라가면 마우스는 오른발을 빠르게 빼거나 핥습니다. 기기를 사용하여 시간을 기록하고 시간을 활동 중 반응 시간으로 정의합니다.
- 정지 시 반응 시간을 측정하려면 가열하지 않고 마우스를 나머지 테이블에 30분 동안 앉힌 다음 4.2단계에서 설명한 대로 시간 데이터를 얻습니다. 이렇게 획득한 시계열 데이터를 후속 분석에 사용합니다.
5. Micro-CT 스캔
- 수술 후 12주 된 쥐를 이산화탄소로 안락사시키고 오른쪽 발목의 피부를 벗겨낸 다음 수술용 가위로 중간 경골과 비골을 잘라 완전한 발목 표본을 얻습니다. 10% 중성 포르말린이 포함된 표시된 15mL 원심분리 튜브에 검체를 48시간 동안 넣습니다.
- 고정 후 micro-CT 스캔을 위해 표본을 배치(배치당 4개의 표본)로 특수 스폰지 탱크에 넣습니다. 기계 매개변수를 전압 = 50kV, 전류 = 200mA, 필터 = 0.5mmAl, 분해능 = 9μm로 설정합니다. micro-CT 스캐너를 실행합니다.
- 스캔 후 재구성 소프트웨어를 사용하여 이미지의 범위를 묘사하고 Liu et al.10에 설명된 대로 상용 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 묘사된 이미지의 XYZ 축을 조정한 후 특정 각도 위치를 선택합니다.
- Liu et al.10에 설명된 대로 마이크로 CT 분석 소프트웨어를 사용하여 XYZ 축에 의해 조정된 재구성된 이미지에서 연속적인 10층 관심 영역을 선택하고 필요한 관절을 정량적으로 분석하여 골부피 분율(BV/TV)을 결정합니다.
- 마지막으로, Liu et al.10에 설명된 대로 3차원 의료 영상 처리 소프트웨어를 사용하여 마우스 발목 관절의 3차원 CT 영상 처리를 수행합니다. 재건 후 ASCJ에서 골사상물의 마모 및 형성을 관찰합니다.
6. 관절 연골의 단면 염색
알림: 모든 염색 단계는 흄 후드에서 수행되며 절차 중에는 마스크를 착용합니다.
- 미세한 핀셋과 가위를 사용하여 발목 검체 주변의 과도한 연조직을 제거한 다음 NaOH 10g, PBS 2팩 및 EDTA-2Na 400g으로 준비된 2% EDTA 석회질 제거 용액이 포함된 원심분리기 튜브에 검체를 넣고 pH를 염산으로 7.35-7.45로 조정하고 다른 그룹을 표시합니다.
- 그런 다음 석회질 제거를 위해 원심분리기 튜브를 쉐이킹 테이블(속도 20rpm으로 설정)에 놓고 하루에 한 번 석회질 제거 용액을 교체합니다. 표본의 석회질 제거를 결정합니다.
- 석회질 제거 1개월 후 그래디언트 알코올로 표본을 탈수한 다음 투명화 목적으로 n-부탄올을 8시간 동안 사용합니다. 마지막으로, 세척된 표본을 임베딩을 위해 코로나 위치에 파라핀에 담그십시오.
- 나중에 사용할 수 있도록 파라핀 표본을 4°C 냉장고에 넣습니다. 절단하기 전에 4°C 냉장고에서 시편을 꺼내 -20°C 냉동고에 약 10분 동안 넣어 전체 평면을 쉽게 절단할 수 있습니다.
- 마이크로톰에 표본을 고정하고 6μm 두께로 절단합니다. 동시에 현미경을 사용하여 샘플이 주사기 바늘이 뼈 조직에 쉽게 침투할 수 있는 예상 수준으로 절단되었는지 관찰합니다.
- 태블릿 기계의 수온을 미리 40°C로 조정하십시오. 그런 다음 2-3개의 완전한 파라핀 섹션을 연속으로 자르고 완전히 확장되도록 태블릿 기계로 옮깁니다. 그런 다음 유리 슬라이드로 파라핀 부분을 제거하고 물을 배출합니다. 마지막으로 슬라이드를 그룹과 숫자로 표시합니다.
7. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
- 현미경으로 온전한 ASCJ 접합 구조를 관찰할 수 있는 방식으로 절편을 60°C 인큐베이터에 넣고 40-50분 동안 절편을 굽습니다. 그런 다음 쉽게 식별할 수 있도록 I, II 및 III로 번호가 매겨진 크실렌 3x로 섹션을 각각 15분, 15분 및 10분 동안 왁스를 제거합니다.
- 쉽게 식별할 수 있도록 I 및 II로 번호가 매겨진 100% 에탄올 2x, 90% 에탄올 및 80% 에탄올을 각각 3분, 3분, 5분 및 5분 동안 넣습니다. 다음으로 이중 증류수(ddH2O)로 섹션을 5분 동안 세척합니다.
- 헤마톡실린을 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 ddH2O로 절편을 씻습니다. 섹션을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 ddH2O로 1분 동안 3번 세척합니다. 그 후, 1 % 암모니아 용액으로 1 분 동안 섹션을 염색 한 다음 ddH2O로 각각 1 분 동안 3 번 세척합니다.
- 다음으로, 샘플을 에오신 염색 용액으로 1분 동안 염색한 다음 95% 에탄올과 100% 에탄올에 각각 1분 동안 연속적으로 넣습니다. 마지막으로 절편을 크실렌 IV로 1분 동안 처리합니다.
- 섹션을 자연 건조하고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙이고 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 명시야에서 5x 및 20x로 이미지를 촬영합니다.
8. 사프라닌 O-fast 녹색 염색
- 선택한 섹션을 60°C 인큐베이터에 넣고 40-50분 동안 굽습니다. 그런 다음 크실렌 I, II 및 III로 섹션을 각각 15분, 15분, 10분 동안 왁스를 제거합니다.
- 탈랍된 부분을 100% 에탄올 I, II, 90% 에탄올 및 80% 에탄올에 각각 3분, 3분, 5분 및 5분 동안 넣습니다. 그런 다음 ddH2O로 섹션을 5분 동안 세척합니다.
- 헤마톡실린을 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 ddH2O로 절편을 씻습니다. 섹션을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 ddH2O로 1분 동안 3번 세척합니다. 그런 다음 1 % 암모니아 용액으로 1 분 동안 섹션을 염색하고 ddH2O로 각각 1 분 동안 3 번 세척합니다.
- 절편을 0.05% 빠른 녹색에 2분 동안 담근 다음 절편을 1% 아세트산 용액에 30초 동안 담그고 0.1% 사프라닌에 5분 동안 담근다. 염색된 샘플을 95% 에탄올과 100% 에탄올에 1분 동안 차례로 넣습니다.
- 마지막으로 절편을 크실렌 IV로 1분 동안 처리합니다. 섹션을 자연 건조하고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙이고 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 명시야에서 5x 및 20x로 이미지를 촬영합니다.
9. 면역조직화학
- 1일차: 선택한 섹션을 60°C 인큐베이터에 넣고 섹션을 40-50분 동안 구운 다음 각각 15분, 15분, 10분 동안 크실렌 I, II 및 III으로 왁스를 제거합니다. 탈랍된 부분을 100% 에탄올 I, II, 90% 에탄올 및 80% 에탄올에 각각 3분, 3분, 5분 및 5분 동안 넣습니다. 그런 다음 ddH2O로 절편을 5분 동안 세척하고 조직화학 펜을 사용하여 검체 영역을 동그라미로 표시한 다음 어두운 상자에 넣습니다.
- 항원 회수: 0.25% 트립신 20-50μL를 원으로 표시된 검체 영역에 떨어뜨리고 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 배양한 다음 PBS로 검체를 각각 2분 동안 3회 세척합니다. 3 % H 2 O 2 를 첨가하여 내인성 과산화 효소를 차단하고 어두운 곳에서 실온에서 10 분 동안 표본을 배양 한 다음 PBS로 각각2분 동안 3 회 세척합니다. 염소 혈청 10%를 실온에서 20분 동안 첨가하여 혈청 차단을 수행한 후 1차 항체(마우스 항마우스 II형 콜라겐, 1,000배 희석)를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 2일차: 실온에서 30분 동안 섹션을 다시 데웁니다. 1차 항체를 회수하고 PBS로 절편을 각각 2분 동안 3회 세척합니다. 37°C의 인큐베이터에서 2차 항체로 40분 동안 배양한 후 PBS로 절편을 각각 2분 동안 3회 세척합니다.
- DAB 발색: ddH2O 5mL, 완충액 2방울, DAB 4방울 및H2O22방울을 첨가하여 DAB 시약을 준비합니다. 절편에 20-50 μL의 시약을 첨가하고, 샘플을 5분 동안 빛으로부터 보호한 다음, ddH 2 O로 절편을2분 동안 세척합니다.
- 헤마톡실린을 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 ddH2O로 절편을 씻습니다. 단면을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 ddH2O로 각각 1분 동안 3번 세척합니다. 1% 암모니아 용액으로 단면을 1분 동안 염색한 다음 ddH2O로 각각 1분 동안 3번 세척합니다.
- 다음으로, 섹션을 각각 95% 에탄올과 100% 에탄올에 각각 1분 동안 넣습니다. 마지막으로 절편을 크실렌 IV로 1분 동안 배양합니다. 섹션을 자연 건조하고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙이고 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 명시야에서 5x 및 20x로 이미지를 촬영합니다.
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Representative Results
상관관계 데이터의 통계적 분석은 온라인 통계 분석 도구를 사용하여 수행되었습니다. 정규 분포 및 분산의 동질성에 대한 두 가지 검정을 충족하는 데이터는 일원 분산 분석을 통한 추가 통계 분석에 사용되었습니다. 데이터가 두 검정을 충족하지 않는 경우 통계 분석에 Kruskal-Wallis 검정을 사용했습니다. 데이터는 평균± 표준편차(SD)로 표현되며, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
밸런스 빔 테스트
각 마우스가 각 단계에서 밸런스 빔을 두 번 통과하는 데 필요한 평균 시간을 통계적으로 분석한 결과, 수술 전 각 마우스 그룹이 밸런스 빔을 통과하는 데 필요한 시간에는 통계적 차이가 없는 것으로 나타났다(p =0.73). 수술 3일 후, CL+ATFL 및 CL+DL 그룹의 마우스는 가짜 그룹의 마우스에 비해 밸런스 빔을 통과하는 데 더 오랜 시간이 걸렸으며, 그 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.05). 수술 4주 후, CL+ATFL 및 CL+DL 그룹의 마우스가 가짜 그룹의 마우스와 비교하여 밸런스 빔을 통과하는 데 걸리는 시간에서 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다(p > 0.05). 또한, 수술 후 8주 및 12주가 경과한 후, CL+ATFL 및 CL+DL 그룹의 마우스는 가짜 그룹의 마우스에 비해 밸런스 빔을 통과하는 데 더 많은 시간이 소요되었으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(p < 0.01). 각 시험 기간 동안 CL+DL 그룹의 마우스와 비교하여 CL+ATFL 그룹의 마우스가 밸런스 빔을 통과하는 데 걸리는 시간에서 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p > 0.05; 그림 1A).
쥐의 오른쪽 뒷발이 균형 빔을 통과한 횟수는 수술 전 세 그룹의 쥐 간에 통계적으로 차이가 없었습니다(p =0.68). 또한, 수술 3일 후 가짜 그룹의 마우스와 비교하여 CL+ATFL 및 CL+DL 그룹의 마우스에 대한 오른쪽 뒷발의 절편 수에서 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 다른 수술 후 시점과 관련하여, 인대 절제군의 절편 수는 가짜 군에 있는 마우스에 비해 더 많았으며, 그 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.05). 수술 후 8주, 12주가 지났을 때 CL+ATFL 투여군의 오른쪽 뒷발이 균형빔에서 미끄러진 횟수는 CL+DL 투여군의 마우스보다 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.05; 그림 1B).
발자국 분석
각 그룹에서 마우스의 보폭은 나이가 들면서 증가했지만, 인대 절단은 보폭을 단축시킬 수 있었다. 수술 전 세 그룹의 마우스 간에 오른쪽 뒷발의 보폭 길이에서 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다(p > 0.05). 수술 12주 후 보행 검사에서 인대 절단군의 오른쪽 뒷발의 보행 길이는 같은 시기의 가짜 군에 비해 짧았으며, 그 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.01). 그러나, CL+ATFL 그룹의 마우스에 대한 오른쪽 뒷발의 보폭은 CL+DL 그룹의 마우스에 대한 보폭과 유의한 차이가 없었다(p > 0.05; 그림 2A,B).
열 통각 평가
활동 중 생쥐 발의 열 통각 반응 시간을 통계적으로 분석한 결과, 수술 전 세 그룹의 생쥐의 반응 시간에는 통계적 차이가 없는 것으로 나타났다(p > 0.5). 수술 후 열통각반응평가에서 인대절단군 마우스의 열통각반응 시간은 같은 기간 가짜 그룹군 마우스보다 길었고, 그 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.01; 그림 3).
Micro-CT 스캔
수술 12주 후, 마이크로 CT를 사용하여 각 그룹의 마우스에 대한 오른쪽 뒷발의 ASCJ를 정량적으로 분석했습니다. CT 영상을 3차원으로 재구성한 결과, 인대가 절단된 두 그룹의 오른쪽 뒷발의 ASCJ가 가짜 그룹보다 거칠었다. 관절 표면은 오목하고 볼록하며 평평하고, 뚜렷한 마모 자국이 있으며, 관절 주위에 골식물이 생성되고, 관절은 퇴행성 변화를 보였습니다. 또한, CL + DL 그룹의 마우스의 약 28.6%에서 거골 탈구가 발생했습니다(그림 4A,B)10. CL+ATFL 및 CL+DL 그룹에서 오른쪽 뒷발의 ASCJ의 골용적 분율은 가짜 그룹보다 유의하게 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.01; 그림 4C,D)10.
관절 연골의 단면 염색
H&E 및 Safranin O-fast 녹색 염색은 가짜 그룹에 속한 마우스의 ASCJ 구조가 완전하고 연골의 형태가 온전하며 연골세포가 고르게 분포되어 있음을 보여주었습니다. 인대가 절단된 두 그룹의 마우스의 ASCJ의 연골층은 명백한 불연속성을 보였으며 연골세포의 수가 감소했습니다(그림 5A,B)10. 수정된 Mankin and Osteoarthritis Research Society International(OARSI) 채점 시스템을 사용하여 각 그룹20,21,22의 마우스에 대한 ASCJ의 H&E 및 Safranin O-fast 녹색 염색을 채점했습니다. 변형된 Mankin 점수는 연골 구조적 특성과 연골세포의 수 및 염색에 의해 결정되었으며, OARSI 점수는 연골의 조직병리학적 등급과 단계에 의해 결정되었습니다. 인대 절단을 받은 두 그룹의 마우스의 점수는 가짜 그룹의 마우스보다 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.05; 그림 5C-F)10.
전형적인 II형 콜라겐 면역조직화학적 염색의 이미지는 가짜 그룹의 오른쪽 뒷발의 ASCJ 관절 연골층의 II형 콜라겐 함량이 인대가 절단된 두 그룹의 마우스보다 더 균일했으며 II형 콜라겐의 명백한 손실이 없음을 보여주었습니다(그림 6A). 정량분석 결과, 가짜 군에 속한 마우스의 ASCJ에서 콜라겐 II형의 발현은 인대가 절단된 두 군에 비해 높았으며, 그 차이는 통계적으로 유의한 것으로 나타났다(p < 0.05; 그림 6B,C).
그림 1: 밸런스 빔 테스트를 사용한 마우스의 행동 분석. (A) 마우스가 밸런스 빔을 통과하는 데 필요한 시간. (B) 밸런스 빔을 횡단할 때 오른발의 미끄러짐 횟수. 데이터는 평균± 표준 편차(n = 그룹당 7개 표본)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 발자국 분석을 사용한 생쥐의 행동 분석 . (A) 수술 전 각 그룹의 마우스에 대한 오른쪽 발자국의 길이 비교. (B) 수술 후 12주 동안 각 그룹의 마우스에 대한 오른쪽 발자국 길이 비교. 통계적으로 유의한 차이는 ** (p가 0.01인 경우)와 ***(p가 0.001인 경우)로 표시되며, 표시된 그룹 간에 p 가 0.001<< 표시됩니다. 데이터는 평균± 표준 편차(n = 그룹당 7개 표본)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 열 통각 평가를 사용한 생쥐의 행동 분석. 생쥐의 활동 중 열 통각 반응 시간. 데이터는 평균± 표준 편차(n = 그룹당 7개 표본)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마우스 오른발의 Micro-CT 분석 . (A) 발목-거골하 관절 복합체(측면도, 내측도, 전방도)에서 탈구가 없는 쥐 거골의 3차원 재건. (B) 발목-거골하 관절 복합체에서 탈구된 쥐 거골의 3차원 재건(측면도, 내측도, 전방도). (C) 마우스 발목 관절의 골부피 분율(BV/TV)의 정량 분석. (D) 마우스 거골하 관절의 골부피 분율(BV/TV)의 정량 분석. 검은색 화살표는 골식물 형성 또는 거골 탈구를 나타냅니다. 통계적으로 유의한 차이는 ***로 표시되며, 여기서 p 는 표시된 그룹 간에 0.001<. 이 그림은 Liu et al.10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: H&E 및 Safranin O-fast 녹색 염색 및 발목 관절 분석. (A) 마우스 발목-거골하 관절의 H&E 염색. (B) 마우스 발목-거골하 관절의 사프라닌 O-fast 염색. (C) 마우스 발목 관절에 대한 수정된 Mankin 점수. (D) 마우스 거골하 관절에 대한 수정된 Mankin 점수. (E) OARSI(Osteoarthritis Research Society International)는 마우스 발목 관절에 대한 점수를 매겼습니다. (F) 마우스 거골하 관절에 대한 OARSI 점수. 기호: a = 발목 관절; s = 거골하 관절. 통계적으로 유의한 차이는 ***로 표시되며, 여기서 p는 표시된 그룹 간에 0.001<. 스케일 바 = 100 μm, n = 그룹당 7개 샘플. 이 그림은 Liu et al.10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 발목 관절의 면역조직화학 염색 및 분석. (A) 마우스 발목 및 거골하 관절의 II형 콜라겐 면역조직화학적 염색. (B) 마우스 발목 관절에 대한 콜라겐 II(+) 면적 비율 백분율. (C) 마우스 거골하 관절에 대한 콜라겐 II(+) 면적 비율 백분율. 기호: a = 발목 관절; s = 거골하 관절. 통계적으로 유의한 차이는 ***로 표시되며, 여기서 p는 표시된 그룹 간에 0.001<. 스케일 바 = 100 μm, n = 그룹당 7개 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 CL + ATFL 또는 CL + DL을 transecting하여 ASCJ 불안정성의 두 마우스 모델을 성공적으로 구축했습니다. 마우스가 밸런스 빔을 통과하는 시간은 수술 후 8 주 및 12 주에 크게 증가했으며, 이는 Hubbard-Turner 팀이 발목 관절의 측면 인대를 절단하여 얻은 결과와 유사합니다23,24. 오른발 슬라이딩 테스트에서 인대가 절단된 두 그룹의 쥐의 슬라이딩 시간이 가짜 그룹의 마우스보다 유의하게 높았고, 수술 후 12주에 슬라이딩 시간이 최대에 도달하여 인대가 절단된 두 그룹의 마우스가 ASCJ의 불안정성으로 고통받았을 수 있음을 시사했습니다. 보행 테스트 결과, 마우스의 보행 길이는 나이가 들면서 점차 증가했지만, 인대가 절단된 두 그룹의 마우스의 12주 보행 길이는 가짜 그룹보다 낮았고, CL+ATFL 그룹의 보행 길이는 가짜 그룹보다 7.2% 짧았다. 종합하면, 위의 결과는 인대 절단을 받은 두 그룹의 쥐의 운동 수준과 균형 능력이 현저히 손상되었음을 시사합니다.
CT 영상의 3차원 재구성에서 인대가 절단된 두 그룹의 마우스의 ASCJ 관절 표면이 가짜 그룹의 마우스보다 거칠고 관절 주위에 골극이 형성되고 관절의 골부피 분율이 증가하는 것이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 인대 절단 그룹의 ASCJ 관절 연골에 퇴행성 병변이 있음을 시사합니다. 관절 연골 절편의 염색은 연골 표면의 불연속성 및 연골 세포의 감소와 같은 연골 변성을 보여주었으며, 이는 Chang et al.18이 설명한 결과와 유사한 장기적인 ASCJ 불안정성이 PTOA로 발전할 수 있음을 추가로 확인했습니다.
모델 설정 과정에서 성공적인 모델링의 핵심은 절단에 해당하는 인대를 정확하게 찾는 것입니다. 동시에 마우스의 활동을 적당히 증가시키면 골관절염의 발병을 가속화할 수 있습니다. 후속 염색 과정에서 마우스 발목 관절 조직의 석회질 제거가 결정적인 역할을 합니다. 따라서 조직의 경도를 자주 관찰하고 적절한 절편 시간을 선택해야합니다.
이 연구에서는 수술 전후 생쥐의 보행 변화를 분석하기 위해 보행 논문을 사용했으며, 생쥐의 보폭 길이의 변화만 얻었다. 동물의 보행 분석 장비를 사용하면 보행의 정성적 및 정량적 분석을 위해 마우스의 각 단계의 크기와 면적, 위치, 움직임 역학 및 압력에 따라 더 많은 매개 변수를 분석 할 수 있습니다. 또한, 세메스 와인스타인(Semmes Weinstein) 모노필라멘트 검출은 촉압 감각 장애를 검출하기 위한 매우 효과적인 방법으로서 국제적으로 인정받고 있으며(25), 이 방법이 마우스의 발의 감각 기능을 평가하는데 사용된다면 더 나은 실험 결과를 얻을 수 있을 것이다. 그러나 제한된 실험 조건과 동물 보행 분석 장비를 사용할 수 없기 때문에 Semmes Weinstein 모노필라멘트 검출은 사용되지 않았습니다. 따라서 향후 이러한 실험 기법을 활용한 심도 있는 연구의 기회가 있습니다.
PTOA는 만성 퇴행성 질환(26)이기 때문에 관절 불안정성과 연골 손상은 서로 다른 시점에서 관찰되어야 하며, 이는 향후 더 많은 장기적이고 다중적인 시점 연구가 필요하다. 또한 마우스 ASCJ의 작은 구조로 인해 염증 인자의 변화를 평가하고 세포 수준에서 PTOA의 존재를 확인하기 위한 시험관 내 실험을 위해 연골세포를 추출할 수 없었습니다. 향후 연구에서는 ASCJ 변성의 근본적인 분자 생물학적 메커니즘을 연구하는 데 더 많은 시간과 에너지가 투입될 것입니다. 둘째, 쥐의 뒷발과 발목의 구조는 인간과 비슷하지만 엄밀히 말하면 쥐는 사족보행이고 인간은 이족보행이며 움직일 때 관절에 가해지는 힘은 정확히 같지 않습니다.
그러나 ASCJ 불안정성 마우스 모델의 성공적인 확립은 단순 발목 불안정성 동물 모델을 ASCJ 불안정성 동물 모델로 확장하여 발 불안정성의 메커니즘에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공하고 질병의 진단 및 치료를 위한 동물 모델뿐만 아니라 임상 발 질환 연구에 대한 새로운 이해를 제공합니다.
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Disclosures
저자 중 누구도 상충되는 이해관계를 가지고 있지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 장쑤성 정부 장학금 프로그램과 장쑤성 고등 교육 기관(PAPD)의 우선 학술 프로그램 개발의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
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