Summary
المفصل المعقد الكاحل تحت الكاحل (ASCJ) هو جوهر القدم ويلعب دورا رئيسيا في التحكم في التوازن في الأنشطة اليومية. غالبا ما تؤدي الإصابات الرياضية إلى عدم الاستقرار في هذا المفصل. هنا ، نصف نموذج فأر لعدم الاستقرار الناجم عن قطع الرباط في ASCJ.
Abstract
ربما تكون التواءات الكاحل أكثر الإصابات الرياضية شيوعا في الحياة اليومية ، وغالبا ما تؤدي إلى عدم استقرار المفصل المعقد تحت الكاحل (ASCJ) ، ويمكن أن تؤدي في النهاية إلى هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) على المدى الطويل. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد آلية الإصابة والمظاهر السريرية ، مثل الكدمات أو الورم الدموي أو الرقة في القدم الجانبية ، لا يوجد إجماع سريري على تشخيص وعلاج عدم استقرار ASCJ. نظرا لأن البنية العضلية الهيكلية لعظام وأربطة مؤخرة الفأر يمكن مقارنتها بتلك الموجودة في البشر ، فقد تم إنشاء نموذج حيواني لعدم استقرار ASCJ في الفئران عن طريق قطع الأربطة حول ASCJ. تم التحقق من صحة النموذج بشكل جيد من خلال سلسلة من الاختبارات السلوكية والتحليلات النسيجية ، بما في ذلك اختبار شعاع التوازن ، وتحليل البصمة (تقييم مستوى التمرين والقدرة على التوازن في الفئران) ، وتقييم استشعار الألم الحراري (تقييم الوظيفة الحسية للقدم في الفئران) ، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT) ، وتلطيخ مقطع الغضروف المفصلي (تقييم تلف الغضروف المفصلي وانحطاطه في الفئران). سيوفر الإنشاء الناجح لنموذج فأر لعدم استقرار ASCJ مرجعا قيما للبحث السريري حول آلية الإصابة ويؤدي إلى خيارات علاج أفضل لالتواء الكاحل.
Introduction
التواء الكاحل هي واحدة من أكثر الإصابات الرياضية شيوعا في جميع أنحاء العالم. تشير التقديرات إلى أن 10000 شخص يصابون يوميا في الولايات المتحدة1 ، منهم إصابات مرتبطة بالرياضة تمثل 15٪ -45٪2. التكاليف الطبية المرتبطة بعلاج التواء الكاحل في الولايات المتحدة تصل إلى 4.2 مليار دولار سنويا3،4،5. يعد عدم استقرار القدم المزمن مشكلة شائعة بعد التواء الكاحل ويحدث في حوالي 74٪ من التواء الكاحل6 ، بما في ذلك عدم استقرار الكاحل أو تحت الكاحل. ومع ذلك ، نظرا للأعراض والعلامات السريرية المماثلة ، يصعب على الطاقم الطبي التمييز بين ما إذا كان عدم استقرار الكاحل المزمن مصحوبا أيضا بعدم استقرار المفصل تحت الكاحل المزمن في العيادة ، ونتيجة لذلك ، يمكن بسهولة تفويت عدم الاستقرار المزمن تحت الكاحل. لذلك ، قد يكون معدل الإصابة الحقيقي لعدم استقرار المفصل المعقد المزمن في الكاحل (ASCJ) (نوع معين من عدم استقرار القدم المزمن الذي يشمل كلا من عدم استقرار الكاحل المزمن وعدم الاستقرار المزمن تحت الكاحل) أعلى منالمبلغ عنه 7،8،9. إذا تركت دون علاج ، يمكن أن يسبب عدم استقرار المفصل المعقد المزمن في الكاحل تحت الكاحل التواء متكرر في الكاحل ، مما يؤدي إلى حلقة مفرغة من التواء الكاحل وعدم الاستقرار المزمن المعقد الكاحل تحت الكاحل. يمكن أن يؤدي عدم الاستقرار المزمن المعقد في الكاحل والكاحل على المدى الطويل إلى تنكس ASCJ وهشاشة العظام بعد الصدمة ، والتي يمكن أن تؤثر على المفاصل المجاورة في الحالات الشديدة10. بالنسبة لهذه الأمراض ، فإن العلاج السريري الحالي محافظ بشكل أساسي ، بالإضافة إلى طرق العلاج الجراحي مثل إصلاح الأربطة وإعادة بناء الأربطة11,12.
ASCJ هو الهيكل الأساسي للقدم ويحافظ على توازن الجسم أثناء الحركة13. تم إجراء بحث مكثف حول بنية مفصل الكاحل والمفصل تحت الكاحل بشكل منفصل14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن البحث عن مفصل الكاحل تحت الكاحل بأكمله أمر نادر الحدوث. يرتبط حوالي ربع حالات إصابة الكاحل بإصابة المفصل تحت الكاحل18. نظرا لآلية الإصابة المعقدة لعدم استقرار ASCJ ، لا يوجد إجماع على تشخيصها وعلاجها في الإعداد السريري. بالنظر إلى الوضع الحالي لإصابات الكاحل في العيادة ، هناك حاجة إلى طريقة أكثر علمية لدراسة الكاحل والمفصل تحت الكاحل ككل ، وبالتالي توفير فهم جديد لدراسة أمراض القدم.
نظرا لأن التركيب التشريحي للفأر الخلفي على المستوى العضلي الهيكلي يمكن مقارنته بالقدم البشرية 19 ، في العديد من الدراسات ، تم بالفعل تنفيذ نماذج الفئران لأبحاث القدم / الكاحل10,19. نجح Chang et al.19 في تطوير ثلاثة نماذج مختلفة من الفئران من هشاشة العظام في الكاحل. مستوحاة من التأسيس الناجح لعدم استقرار الكاحل في نموذج الفأر ، أنشأنا نموذجا للفأر لعدم الاستقرار المعقد في الكاحل تحت الكاحل ، وافترضنا أن قطع الأربطة الجزئية في مؤخرة القدم للفأر سيؤدي إلى عدم الاستقرار الميكانيكي ل ASCJ ، مما قد يؤدي إلى هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) من ASCJ. يمكن استخدام النموذج الحيواني لعدم الاستقرار ASCJ لعلاج كل من عدم استقرار الكاحل وعدم الاستقرار تحت الكاحل ، وهو أكثر انسجاما مع الوضع السريري الفعلي من نموذج عدم استقرار الكاحل البسيط المستخدم حاليا7،8،9،19. لاختبار هذه الفرضية ، تم تصميم نموذجين للفأر لعدم الاستقرار الناجم عن استئصال الرباط في ASCJ. تم استخدام نتائج الوظيفة الحسية الحركية - اختبار شعاع التوازن ، وتحليل البصمة ، وتقييم nociception الحراري - لتقييم جدوى النموذج ، وتم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT) والتلوين النسيجي لتقييم تلف وانحطاط الغضروف المفصلي للفأر. إن الإنشاء الناجح لنموذج الفئران لعدم استقرار ASCJ لا يوفر فهما جديدا لدراسة أمراض القدم فحسب ، بل يوفر أيضا مرجعا قيما للبحث السريري حول الآليات المرتبطة بالإصابة ، ويوفر خيارات علاجية أفضل لالتواء الكاحل ، ومفيد لمزيد من الدراسات حول المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الدراسات على وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سوشو.
1. العمليات الجراحية
- قسم ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 21 أسبوعا إلى ثلاث مجموعات: الرباط العنقي المستعرض ومجموعة الرباط الأنبوبي الأمامي ، والرباط العنقي المستعرض ومجموعة الرباط الدالي ، ومجموعة الجراحة الوهمية. تأكد من تربية جميع الفئران في بيئة تلبي معايير محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).
- تأقلم الفئران مع بيئة التربية الجديدة (دورة الضوء / الظلام من 12 ساعة / 12 ساعة ، ودرجة حرارة ثابتة ورطوبة من 18-22 درجة مئوية و 40٪ -70٪ على التوالي) لمدة أسبوعين قبل التجربة. إخضاع الفئران لموازنة شعاع وتدريب المشي ، والانتقال من أحد طرفي عارضة التوازن أو الأنبوب على شكل حرف U إلى الطرف الآخر دون توقف ، قبل 1 أسبوع من التجربة.
- في عمر 8 أسابيع ، قم بتخدير الفأر باستخدام استنشاق الأيزوفلوران عن طريق ترطيب كرة قطنية مع 2 مل من الأيزوفلوران ووضعها في حاوية محكمة الإغلاق للتطاير الكامل. راقب نشاط الماوس واستمر في الاستنشاق حتى ينخفض نشاط الماوس بشكل كبير. تحديد عمق التخدير عن طريق الضغط على أصابع الفئران لمراقبة ردود أفعالهم. استنشق الأيزوفلوران المتبخر (2٪) من خلال قناع الوجه للحفاظ على التخدير في الفئران أثناء العمليات اللاحقة. استخدم مرهم العين البيطري أثناء التخدير لمنع جفاف العينين.
- بعد التخدير ، قم بإزالة الشعر الموجود على مفصل الكاحل للأطراف الخلفية اليمنى للفأر باستخدام ماكينة حلاقة ، وقم بتطهير الجلد المكشوف ثلاث مرات بجولات متناوبة من كرات قطن اليود وكرات القطن الكحولية. تطبيق 5 ملغ/ كغ كاربروفين عن طريق الحقن تحت الجلد. انقل الفأر إلى غرفة عمليات المجهرية باستخدام وسادة جراحية معقمة.
- بالنسبة لمجموعة الرباط العنقي المستعرض والرباط التلوفي الأمامي (CL + ATFL) ، قم بعمل شق طولي مائل لأسفل 7 مم مع مشرط على الجلد فوق مفصل الكاحل الأيمن ، والتحقيق باستخدام ملقط مستقيم مجهري أمام مفصل الكاحل.
- تأكد من تعرض ATFL عند الحد السفلي لجسم الكاحل والشظية بعد فحصها وقطعها برفق بمشرط. افصل الأوتار الشظوية الطويلة والقصيرة وأوتار الباسطة الرقمية الطويلة ، واكشف CL ، واقطعها بمشرط.
- بالنسبة لمجموعة الرباط الدالي CL + المستعرض (DL) ، قم بعمل شق عمودي 8 مم على الجلد الإنسي لمفصل الكاحل الأيمن وافصل DL بصراحة عن المليولوس الإنسي لقطعه أخيرا. ثم قم بقص CL كما هو موضح في الخطوة 1.5.
- بالنسبة للمجموعة الوهمية (مجموعة الجراحة الوهمية) ، قم بإجراء جراحة وهمية على مفصل الكاحل الأيمن ولكن لا تقطع أي أربطة.
- اغسل الشق بمحلول ملحي طبيعي معقم وخيطه بخيط نايلون جراحي 5-0. أخيرا ، قم بتطهير الشق المخيط بكرة قطنية من اليود.
- أبق الفأر تحت الملاحظة حتى يتمكن من الحفاظ على الاستلقاء القصي ، والإشراف حتى يصبح واعيا تماما. تطهير شق الكاحل مرتين يوميا مع كرة القطن اليود وإدارة كاربروفين (5 ملغ / كغ، الحقن تحت الجلد)، مرة واحدة في اليوم لمدة 1 أسبوع. الخلفية وحدها بعد العملية ، وإيلاء اهتمام وثيق لحالة ما بعد الجراحة من الماوس.
- بعد أسبوعين من الجراحة وعندما ينخفض تورم مفصل الكاحل ، ابدأ في ممارسة الفئران في آلة التعب الدوار للفأر لمدة 1 ساعة كل يوم.
2. اختبار شعاع التوازن
- قم بتثبيت شعاع خشبي دائري بطول 1 متر وقطر 20 مم ، يميل عند 15 درجة في أحد طرفيه ، مع مشبك ثلاثي القوائم للتصوير الفوتوغرافي ، وضع الطرف الآخر على سطح عمل متصل بشريط كاسيت مغلق.
- أداء التدريب شعاع التوازن 1 أسبوع قبل الجراحة لضمان أن الفئران تتحرك بسلاسة من نهاية شعاع إلى آخر. ضع في اعتبارك أن الفأر قد اجتاز الاختبار عندما يمر عبر الحزمة مرتين في 60 ثانية دون توقف.
- قم بإجراء تجربتين متتاليتين لكل فأر ورش عارضة التوازن بنسبة 75٪ كحول بعد كل تجربة لمنع الرائحة المتبقية للفأر السابق من التأثير على الماوس التالي.
- قم بإجراء اختبار عارضة التوازن قبل الجراحة ، 3 أيام ، 1 أسبوع ، 4 أسابيع ، 8 أسابيع ، و 12 أسبوعا بعد الجراحة. سجل متوسط الوقت لكل فأر يمر بعارضة التوازن مرتين متتاليتين وعدد المرات التي تنزلق فيها القدم الخلفية اليمنى من العارضة كمتغيرات تابعة.
3. تحليل البصمة
- ضع قناة بلاستيكية على شكل حرف U بطول 50 سم وعرض 10 سم وارتفاع 10 سم على الطاولة التجريبية وقم بتوصيل أحد طرفي القناة البلاستيكية بشريط كاسيت مغلق.
- ضع ورقة صبغية عادية بشكل مسطح في القناة ، ثم أمسك الماوس بكلتا يديه وقم بطلاء أقدامهما الأمامية والخلفية بالتساوي باستخدام صبغة حمراء وخضراء غير سامة.
- ضع الماوس المطلي برفق في أحد طرفي القناة واتركه ينتقل إلى الطرف الآخر من الكاسيت. أخرج الورق المصطبغ مع آثار الأقدام ، وقم بتمييزه ، وضعه على رف حتى يجف في مكان جيد التهوية ومظلل.
- بعد مرور كل ماوس ، قم برش القناة البلاستيكية على شكل حرف U بنسبة 75٪ كحول لمنع الرائحة المتبقية للفأر السابق من التأثير على الماوس التالي.
- حدد ثلاث آثار أقدام متتالية واضحة للماوس على كل ورقة ، واستخدم مسطرة لقياس طول خطوة بصمة القدم اليمنى للماوس ، بالإضافة إلى عرض الخطوة بين آثار الأقدام اليمنى واليسرى.
4. تقييم الإحساس الحراري بالألم
- أثناء التجربة ، استخدم الاختبار الأخمصي لتسجيل وقت تفاعل الإحساس الحراري لقدم الفأر ووقت رد فعل الماوس أثناء النشاط والراحة ، على التوالي. سجل بيانات القياس في ثوان.
- ضع الماوس في أداة القياس ، وقم بمحاذاة الجهاز بقدمه اليمنى ، وابدأ في تسخين الجهاز مع زيادة درجة الحرارة ببطء. راقب استجابة الماوس. عندما ترتفع درجة الحرارة فوق التسامح ، سوف ينسحب الماوس بسرعة أو يلعق قدمه اليمنى. سجل الوقت باستخدام الأداة وحدد الوقت على أنه وقت رد الفعل أثناء النشاط.
- لقياس وقت رد الفعل أثناء الراحة ، اترك الماوس يجلس لمدة 30 دقيقة على طاولة الراحة دون تسخين ، ثم احصل على بيانات الوقت كما هو موضح في الخطوة 4.2. استخدم هذه البيانات الزمنية المكتسبة للتحليل اللاحق.
5. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
- القتل الرحيم للفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا مع ثاني أكسيد الكربون بعد الجراحة ، وتقشير جلد كاحليها الأيمن ، ثم قطع الساق الوسطى والشظية بمقص جراحي للحصول على عينات كاملة من الكاحل. ضع العينات في أنابيب طرد مركزي 15 مل تحتوي على 10٪ فورمالين محايد لمدة 48 ساعة.
- بعد التثبيت ، ضع العينات على دفعات (أربع عينات لكل دفعة) في خزان إسفنجي خاص للمسح بالأشعة المقطعية الدقيقة. اضبط معلمات الماكينة على النحو التالي: الجهد = 50 كيلو فولت ، التيار = 200 مللي أمبير ، المرشح = 0.5 مم ، والدقة = 9 ميكرومتر. قم بتشغيل الماسح الضوئي الدقيق بالتصوير المقطعي المحوسب.
- بعد المسح ، استخدم برنامج إعادة البناء لتحديد نطاق الصورة ، وحدد موضع زاوية معين بعد ضبط محور XYZ للصورة المحددة باستخدام برنامج تحليل البيانات التجارية ، كما هو موضح في Liu et al.10.
- استخدم برنامج تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحديد مناطق الاهتمام المستمرة المكونة من 10 طبقات في الصور المعاد هيكلتها المعدلة بواسطة محاور XYZ ، وتحليل المفاصل المطلوبة كميا لتحديد جزء حجم العظام (BV / TV) ، كما هو موضح في Liu et al.10.
- أخيرا ، استخدم برنامج معالجة الصور الطبية ثلاثي الأبعاد لإجراء معالجة صور التصوير المقطعي المحوسب ثلاثية الأبعاد لمفاصل كاحل الفأر ، كما هو موضح في Liu et al.10. بعد إعادة الإعمار ، لاحظ تآكل وتشكيل الخلايا العظمية في ASCJ.
6. قسم تلطيخ الغضروف المفصلي
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات التلوين في غطاء دخان ، ويتم ارتداء قناع أثناء العملية.
- استخدم ملاقط ومقص مجهري لإزالة الأنسجة الرخوة الزائدة حول عينات الكاحل ، ثم ضع العينات في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 10٪ محلول إزالة الكلس EDTA محضر ب 44 جم من هيدروكسيد الصوديوم ، وعبوتين من PBS ، و 400 جم من EDTA-2Na ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.35-7.45 مع حمض الهيدروكلوريك ، وتحديد المجموعات المختلفة.
- بعد ذلك ، ضع أنبوب الطرد المركزي على طاولة اهتزاز (ضبط السرعة على 20 دورة في الدقيقة) لإزالة الكلس وتغيير محلول إزالة الكلس مرة واحدة يوميا. تحديد إزالة الكلس من العينات.
- بعد 1 شهر من إزالة الكلس ، قم بتجفيف العينات بالكحول المتدرج ثم استخدم n-butanol لمدة 8 ساعات لأغراض التطهير. أخيرا ، اغمر العينات التي تم تطهيرها في البارافين في وضع إكليلي للتضمين.
- ضع عينات البارافين في ثلاجة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا. قبل التقسيم ، خذ العينات من الثلاجة 4 درجة مئوية وضعها في فريزر -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا لتسهيل قطع المستوى الكامل.
- إصلاح العينات على microtome وتقسيمها بسمك 6 ميكرومتر. في الوقت نفسه ، استخدم المجهر لمراقبة ما إذا كانت العينات قد تم قطعها عند المستوى المتوقع من اختراق سهل لإبرة حقنة في الأنسجة العظمية.
- اضبط درجة حرارة الماء في الجهاز اللوحي على 40 درجة مئوية مقدما. بعد ذلك ، قم بقص قسمين إلى ثلاثة أقسام كاملة من البارافين على التوالي ونقلها إلى الجهاز اللوحي للتوسع الكامل. ثم قم بإزالة أقسام البارافين بشريحة زجاجية واستنزاف الماء. أخيرا ، قم بتمييز الشرائح بالمجموعات والأرقام.
7. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E)
- ضع الأقسام في حاضنة 60 درجة مئوية بطريقة يمكن من خلالها ملاحظة هيكل مفصل ASCJ السليم تحت المجهر واخبز الأقسام لمدة 40-50 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الشمع من المقاطع باستخدام الزيلين 3x ، المرقمة ك I و II و III لسهولة التعرف عليها ، لمدة 15 دقيقة و 15 دقيقة و 10 دقائق على التوالي.
- ضع المقاطع منزوعة الشمع في إيثانول 100٪ 2x ، مرقمة ك I و II لسهولة التعرف عليها ، و 90٪ إيثانول ، و 80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق و 3 دقائق و 5 دقائق و 5 دقائق على التوالي. بعد ذلك ، اغسل الأقسام بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) لمدة 5 دقائق.
- بعد النقع مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، اغسل الأقسام ب ddH2O حتى تصبح عديمة اللون. انقع المقاطع في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية واغسلها 3x لمدة دقيقة واحدة باستخدام ddH2O. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بمحلول الأمونيا بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة ، ثم اغسل 3x لمدة دقيقة واحدة لكل منها ddH2O.
- بعد ذلك ، قم بتلطيخ العينات بمحلول تلطيخ eosin لمدة 1 دقيقة ، ثم ضعها في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة لكل منهما على التوالي. أخيرا ، عالج الأقسام بالزيلين الوريدي لمدة 1 دقيقة.
- جفف الأقسام في الهواء ، والصق قطرة من الراتنج المحايد على العينات الموجودة على الشرائح ، وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام مجهر مضان عمودي في برايت فيلد بمعدل 5x و 20x.
8. سافرانين يا فاست تلطيخ أخضر
- ضع الأقسام المحددة في حاضنة 60 درجة مئوية واخبز الأقسام لمدة 40-50 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الشمع من المقاطع باستخدام الزيلين الأول والثاني والثالث لمدة 15 دقيقة و 15 دقيقة و 10 دقائق على التوالي.
- ضع الأجزاء منزوعة الشمع في 100٪ إيثانول I و II و 90٪ إيثانول و 80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق و 3 دقائق و 5 دقائق و 5 دقائق على التوالي. بعد ذلك ، اغسل الأقسام باستخدام ddH2O لمدة 5 دقائق.
- بعد النقع مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، اغسل الأقسام ب ddH2O حتى تصبح عديمة اللون. انقع المقاطع في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية واغسلها 3x لمدة دقيقة واحدة باستخدام ddH2O. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بمحلول الأمونيا بنسبة 1٪ لمدة دقيقة واحدة ، واغسلها 3 مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها باستخدام ddH2O.
- انقع المقاطع في 0.05٪ أخضر سريع لمدة دقيقتين ، متبوعا بنقع الأقسام في محلول حمض الخليك 1٪ لمدة 30 ثانية وفي 0.1٪ سافرانين لمدة 5 دقائق. ضع العينات الملطخة في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ، واحدة تلو الأخرى.
- أخيرا ، عالج الأقسام بالزيلين الوريدي لمدة 1 دقيقة. جفف الأقسام في الهواء ، والصق قطرة من الراتنج المحايد على العينات الموجودة على الشرائح ، وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام مجهر مضان عمودي في برايت فيلد بمعدل 5x و 20x.
9. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
- اليوم 1: ضع الأقسام المحددة في حاضنة 60 درجة مئوية ، واخبز الأقسام لمدة 40-50 دقيقة ، ثم قم بإزالة الشمع منها بالزيلين الأول والثاني والثالث لمدة 15 دقيقة و 15 دقيقة و 10 دقائق على التوالي. ضع الأجزاء منزوعة الشمع في 100٪ إيثانول I و II و 90٪ إيثانول و 80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق و 3 دقائق و 5 دقائق و 5 دقائق على التوالي. بعد ذلك ، اغسل الأقسام باستخدام ddH2O لمدة 5 دقائق ، واستخدم قلما كيميائيا لوضع دائرة حول منطقة العينة ، ووضعها في صندوق مظلم.
- استرجاع المستضد: قم بإسقاط 20-50 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين في منطقة العينة المحاطة بدائرة ، واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، ثم اغسل العينات 3x لمدة 2 دقيقة لكل منها باستخدام برنامج تلفزيوني. منع البيروكسيديز الداخلي عن طريق إضافة 3 ٪ H 2 O 2 ، واحتضان العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، ثم غسلها 3x لمدة2دقيقة لكل منهما مع برنامج تلفزيوني. قم بإجراء حجب المصل عن طريق إضافة 10٪ من مصل الماعز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم احتضانه بالجسم المضاد الأساسي (الكولاجين المضاد للفأر من النوع الثاني ، المخفف 1000 مرة) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- اليوم 2: أعد تدفئة الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. استعادة الجسم المضاد الأساسي وغسل الأقسام 3x لمدة 2 دقيقة لكل منها مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي لمدة 40 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، ثم اغسل الأقسام 3x لمدة 2 دقيقة لكل منها مع برنامج تلفزيوني.
- تطوير لون DAB: أضف 5 مل من ddH 2 O ، وقطرتين من المخزن المؤقت ، وأربع قطرات من DAB ، وقطرتين من H 2O2لتحضير كاشف DAB. أضف 20-50 ميكرولتر من الكاشف إلى الأقسام ، واحتفظ بالعينات محمية من الضوء لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الأقسام لمدة دقيقتين باستخدام ddH2O.
- بعد النقع مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، اغسل الأقسام ب ddH2O حتى تصبح عديمة اللون. انقع الأقسام في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية واغسلها 3 مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها باستخدام ddH 2O. قم بتلطيخ الأقسام لمدة دقيقة واحدة بمحلول الأمونيا 1٪ ، ثم اغسلها 3x لمدة دقيقة واحدة لكل منها ddH2O.
- بعد ذلك ، ضع الأقسام في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول ، على التوالي ، لمدة 1 دقيقة لكل منهما. أخيرا ، احتضان الأقسام لمدة 1 دقيقة باستخدام الزيلين الوريدي. جفف الأقسام في الهواء ، والصق قطرة من الراتنج المحايد على العينات الموجودة على الشرائح ، وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام مجهر مضان عمودي في برايت فيلد بمعدل 5x و 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء التحليل الإحصائي لبيانات الارتباط باستخدام أدوات التحليل الإحصائي عبر الإنترنت. واستخدمت البيانات التي استوفت اختباري التوزيع الطبيعي وتجانس التباين لإجراء مزيد من التحليل الإحصائي عن طريق تحليل التباين في اتجاه واحد. إذا لم تستوف البيانات الاختبارين ، تم استخدام اختبار Kruskal-Wallis للتحليل الإحصائي. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) ، واعتبر p < 0.05 ذا دلالة إحصائية.
اختبار شعاع التوازن
أظهر التحليل الإحصائي لمتوسط الوقت اللازم لكل فأر للمرور عبر عارضة التوازن مرتين في كل مرحلة أنه لا توجد فروق إحصائية في الوقت اللازم لكل مجموعة من الفئران لتمرير عارضة التوازن قبل الجراحة (p = 0.73). بعد ثلاثة أيام من الجراحة ، احتاجت الفئران في مجموعات CL + ATFL و CL + DL إلى وقت أطول للمرور عبر عارضة التوازن مقارنة بالفئران في المجموعة الوهمية ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.05). بعد أربعة أسابيع من الجراحة ، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في الوقت الذي استغرقته الفئران في مجموعات CL + ATFL و CL + DL لتمرير شعاع التوازن مقارنة بالفئران في المجموعة الوهمية (p > 0.05). علاوة على ذلك ، بعد 8 أسابيع و 12 أسبوعا من الجراحة ، احتاجت الفئران في مجموعات CL + ATFL و CL + DL إلى مزيد من الوقت لتمرير شعاع التوازن مقارنة بالفئران في المجموعة الوهمية ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.01). لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في الوقت الذي استغرقته الفئران في مجموعة CL + ATFL لتمرير حزمة التوازن مقارنة بالفئران في مجموعة CL + DL خلال كل فترة اختبار (p > 0.05; الشكل 1 أ).
لم يكن عدد المرات التي انزلقت فيها مؤخرة القدم اليمنى للفأر عبر عارضة التوازن مختلفا إحصائيا بين المجموعات الثلاث من الفئران قبل الجراحة (p = 0.68). علاوة على ذلك ، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في عدد أقسام القدم الخلفية اليمنى للفئران في مجموعات CL + ATFL و CL + DL مقارنة بالفئران في المجموعة الوهمية بعد 3 أيام من الجراحة. فيما يتعلق بالنقاط الزمنية الأخرى بعد الجراحة ، كان عدد الأقسام في مجموعة استئصال الرباط أعلى مقارنة بالفئران في المجموعة الوهمية ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.05). في 8 أسابيع و 12 أسبوعا بعد الجراحة ، كان عدد المرات التي انزلقت فيها القدم الخلفية اليمنى في مجموعة CL + ATFL من شعاع التوازن أعلى من الفئران في مجموعة CL + DL ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.05; الشكل 1 ب).
تحليل البصمة
زاد طول خطوة الفئران في كل مجموعة مع تقدم العمر ، لكن قطع الأربطة يمكن أن يقصر طول الخطوة. لم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية في طول خطوة القدم الخلفية اليمنى بين المجموعات الثلاث من الفئران قبل الجراحة (p > 0.05). في اختبار المشي بعد 12 أسبوعا من الجراحة ، كان طول خطوة القدم الخلفية اليمنى في مجموعة قطع الرباط أقصر مقارنة بالمجموعة الوهمية في نفس الفترة ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.01). ومع ذلك ، فإن طول خطوة القدم الخلفية اليمنى للفئران في مجموعة CL + ATFL لم يكن مختلفا بشكل كبير عن تلك الخاصة بالفئران في مجموعة CL + DL (p > 0.05; الشكل 2 أ ، ب).
تقييم الإحساس الحراري بالألم
أظهر التحليل الإحصائي لوقت استجابة الإحساس الحراري لألم الألم لأقدام الفئران أثناء النشاط أنه لا توجد فروق إحصائية في أوقات رد الفعل للمجموعات الثلاث من الفئران قبل الجراحة (p > 0.5). في تقييم الإحساس الحراري بالألم بعد الجراحة، كانت أوقات استجابة الإحساس الحراري للألم للفئران في مجموعة قطع الأربطة أطول من تلك الخاصة بالفئران في المجموعة الوهمية في نفس الفترة، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.01; الشكل 3).
التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
بعد اثني عشر أسبوعا من الجراحة ، تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحليل ASCJ كميا للقدم الخلفية اليمنى للفئران في كل مجموعة. أظهرت إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لصور التصوير المقطعي المحوسب أن ASCJ للقدم الخلفية اليمنى في المجموعتين مع الأربطة المقطوعة كانت أكثر خشونة من تلك الموجودة في المجموعة الوهمية. كان سطح المفصل مقعرا ومحدبا ومسطحا ، وكانت هناك علامات تآكل واضحة ، وتم إنشاء نباتات عظمية حول المفاصل ، وأظهرت المفاصل تغيرات تنكسية. بالإضافة إلى ذلك ، ما يقرب من 28.6 ٪ من الفئران في مجموعة CL + DL طورت خلع الكاحل (الشكل 4A ، B) 10. كان جزء حجم العظام في ASCJ للمؤخرة اليمنى في مجموعات CL + ATFL و CL + DL أعلى بكثير منه في المجموعة الوهمية ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.01; الشكل 4 ج ، د) 10.
تلطيخ قسم الغضروف المفصلي
أظهر تلطيخ H&E و Safranin O-fast الأخضر أن بنية ASCJ للفئران في المجموعة الوهمية كانت كاملة ، وكان مورفولوجيا الغضروف سليما ، وتم توزيع الخلايا الغضروفية بالتساوي. أظهرت الطبقة الغضروفية ل ASCJ لمجموعتي الفئران المصابة بقطع في الأربطة انقطاعا واضحا ، وانخفض عدد الخلايا الغضروفية (الشكل 5A ، B) 10. تم استخدام نظام تسجيل Mankin and Osteoarthritis Association International (OARSI) المعدل لتسجيل تلطيخ H& E و Safranin O-fast الأخضر ل ASCJ للفئران في كل مجموعة20،21،22. تم تحديد درجة مانكين المعدلة من خلال الخصائص الهيكلية للغضروف وعدد الخلايا الغضروفية وتلطيخها ، وتم تحديد درجة OARSI من خلال الدرجة النسيجية المرضية ومرحلة الغضروف. كانت درجات مجموعتي الفئران المصابة ببتر الأربطة أعلى من تلك الخاصة بالفئران في المجموعة الوهمية ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.05; الشكل 5C-F)10.
أظهرت صور التلوين الكيميائي المناعي للكولاجين من النوع الثاني أن محتوى الكولاجين من النوع الثاني في طبقة الغضروف المفصلي ASCJ في مؤخرة القدم اليمنى في المجموعة الوهمية كان أكثر اتساقا من مجموعتي الفئران ذات الأربطة المقطوعة ، ولم يكن هناك فقدان واضح للكولاجين من النوع الثاني (الشكل 6 أ). أظهرت نتائج التحليل الكمي أن التعبير عن الكولاجين من النوع الثاني في ASCJ للفئران في المجموعة الوهمية كان أعلى من مجموعتي الفئران ذات الأربطة المقطوعة ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.05; الشكل 6 ب ، ج).
الشكل 1: التحليل السلوكي للفئران باستخدام اختبار عارضة التوازن. أ: الزمن اللازم لعبور الفئران لحزمة التوازن. ب: عدد انزلاقات القدم اليمنى عند اجتياز عارضة التوازن. تمثل البيانات متوسط الانحراف المعياري ± ، n = 7 عينات لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحليل السلوكي للفئران باستخدام تحليل البصمة. (أ) مقارنة طول العتبة اليمنى للفئران في كل مجموعة قبل الجراحة. (ب) مقارنة طول العتبة اليمنى للفئران في كل مجموعة بعد 12 أسبوعا من الجراحة. يشار إلى الفروق ذات الدلالة الإحصائية ب ** ، حيث p < 0.01 ، و ** ، حيث p < 0.001 بين المجموعات المشار إليها. تمثل البيانات متوسط الانحراف المعياري ± ، n = 7 عينات لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحليل السلوكي للفئران باستخدام تقييم استقبال الألم الحراري. أوقات استجابة الإحساس الحراري للألم أثناء النشاط في الفئران. تمثل البيانات متوسط الانحراف المعياري ± ، n = 7 عينات لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق للقدم اليمنى للفأر. (أ) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لطاحل الفأر دون خلع في مجمع مفصل الكاحل تحت الكاحل (منظر جانبي ، منظر وسطي ، منظر أمامي). (ب) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمخلوع الكاحل الفأري في مجمع مفصل الكاحل تحت الكاحل (منظر جانبي ، منظر وسطي ، منظر أمامي). (ج) التحليل الكمي لجزء حجم العظام (BV / TV) لمفاصل كاحل الفأر. (د) التحليل الكمي لجزء حجم العظام (BV / TV) للمفاصل تحت الكاحل للفأر. تشير الأسهم السوداء إلى تكوين النابت العظمية أو خلع الكاحل. يشار إلى الفروق ذات الدلالة الإحصائية ب ** ، حيث < p 0.001 بين المجموعات المشار إليها. تم تعديل هذا الرقم من Liu et al.10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلطيخ H&E و Safranin O-fast الأخضر وتحليل مفاصل الكاحل. (أ) تلطيخ H& E لمفاصل الكاحل تحت الكاحل الفأر. (ب) تلطيخ Safranin O-fast لمفاصل الكاحل تحت الكاحل الفأر. (ج) درجات مانكين المعدلة لمفاصل كاحل الفأر. (د) درجات مانكين المعدلة للمفاصل تحت الكاحل للفأر. (ه) درجات الجمعية الدولية لبحوث هشاشة العظام (OARSI) لمفاصل كاحل الفأر. (F) درجات OARSI للمفاصل تحت الكاحل الفأر. الرموز: أ = مفصل الكاحل. ق = مفصل تحت الكاحل. يشار إلى الفروق ذات الدلالة الإحصائية ب ** ، حيث < p 0.001 بين المجموعات المشار إليها. شريط المقياس = 100 ميكرومتر ، ن = 7 عينات لكل مجموعة. تم تعديل هذا الرقم من Liu et al.10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتحليل مفاصل الكاحل. (أ) تلطيخ الكولاجين الكيميائي المناعي من النوع الثاني لكاحل الفأر والمفاصل تحت الكاحل. (ب) الكولاجين II (+) نسبة المساحة لمفاصل كاحل الفأر. (ج) الكولاجين II (+) نسبة المساحة للمفاصل تحت الكاحل للفأر. الرموز: أ = مفصل الكاحل. ق = مفصل تحت الكاحل. يشار إلى الفروق ذات الدلالة الإحصائية ب ** ، حيث < p 0.001 بين المجموعات المشار إليها. شريط المقياس = 100 ميكرومتر ، ن = 7 عينات لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، تم بناء نموذجين للفأر لعدم استقرار ASCJ بنجاح عن طريق عبور CL + ATFL أو CL + DL. زاد وقت مرور الفئران عبر عارضة التوازن بشكل ملحوظ في 8 أسابيع و 12 أسبوعا بعد الجراحة ، وهو ما يشبه النتائج التي حصل عليها فريق Hubbard-Turner عن طريق قطع الرباط الجانبي لمفصل الكاحل23,24. في اختبار انزلاق القدم اليمنى ، لاحظنا أن أوقات انزلاق مجموعتي الفئران ذات الأربطة المقطوعة كانت أعلى بكثير من تلك الخاصة بالفئران في المجموعة الوهمية ، ووصلت أوقات الانزلاق إلى الحد الأقصى في 12 أسبوعا بعد الجراحة ، مما يشير إلى أن مجموعتي الفئران ذات الأربطة المقطوعة ربما عانوا من عدم استقرار ASCJ. أظهر اختبار المشي أنه على الرغم من أن طول خطوة الفئران زاد تدريجيا مع تقدم العمر ، إلا أن أطوال الخطوات لمدة 12 أسبوعا لمجموعتي الفئران ذات الأربطة المقطوعة كانت أقل من تلك الموجودة في المجموعة الوهمية ، وكان طول الخطوة لمجموعة CL + ATFL أقل بنسبة 7.2٪ من المجموعة الوهمية. مجتمعة ، تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أن المستوى الحركي وقدرة التوازن لمجموعتي الفئران المصابة ببتر الأربطة قد ضعفا بشكل كبير.
في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لصور التصوير المقطعي المحوسب ، لوحظ أن السطح المفصلي ASCJ في مجموعتي الفئران ذات الأربطة المقطوعة كان أكثر خشونة من الفئران في المجموعة الوهمية ، وتشكلت النباتات العظمية حول المفاصل ، وزاد جزء حجم العظام للمفصل. تشير هذه النتائج إلى أن الغضروف المفصلي ASCJ في مجموعة بتر الرباط كان يعاني من آفات تنكسية. أظهر تلطيخ أقسام الغضروف المفصلي تنكس الغضروف ، مثل انقطاع سطح الغضروف وتقليل الخلايا الغضروفية ، مما تحقق كذلك من أن عدم استقرار ASCJ على المدى الطويل يمكن أن يتطور إلى PTOA، وهو مشابه للنتائج التي وصفها Chang et al.18.
في عملية إنشاء النموذج ، فإن مفتاح النمذجة الناجحة هو العثور بدقة على الأربطة المقابلة للقطع. في الوقت نفسه ، يمكن أن تؤدي زيادة نشاط الفئران بشكل معتدل إلى تسريع تطورها في هشاشة العظام. في عملية التلوين اللاحقة ، يلعب إزالة الكلس من أنسجة مفصل كاحل الفأر دورا حاسما. لذلك ، من الضروري مراقبة صلابة الأنسجة بشكل متكرر وتحديد وقت التقسيم المناسب.
في الدراسة ، تم استخدام ورقة المشي لتحليل التغيرات في مشية الفئران قبل وبعد الجراحة ، وتم الحصول على التغييرات فقط في طول خطوة الفئران. إذا تم استخدام أداة تحليل مشية ، يمكن تحليل المزيد من المعلمات وفقا للحجم والمساحة والموضع وديناميكيات الحركة وضغط كل خطوة من الفئران للتحليل النوعي والكمي للمشية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اكتشاف الشعيرات الأحادية Semmes Weinstein معترف به دوليا كطريقة فعالة للغاية للكشف عن الاضطرابات الحسية لضغط اللمس25 ، ويمكن الحصول على نتائج تجريبية أفضل إذا تم استخدام هذه الطريقة لتقييم الوظيفة الحسية لأقدام الفئران. ومع ذلك ، نظرا للظروف التجريبية المحدودة وعدم توفر أدوات تحليل مشية ، لم يتم استخدام كشف الشعيرات الأحادية Semmes Weinstein ؛ لذلك ، هناك فرص للدراسات المتعمقة باستخدام هذه التقنيات التجريبية في المستقبل.
نظرا لأن PTOA هو مرض تنكسي مزمن26 ، يجب ملاحظة عدم استقرار المفاصل وتلف الغضاريف في نقاط زمنية مختلفة ، وهذا يستحق المزيد من الدراسات طويلة الأجل ومتعددة الأوقات في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب البنية الصغيرة للفأر ASCJ ، لا يمكن استخراج الخلايا الغضروفية للتجارب المختبرية لتقييم التغيرات في العوامل الالتهابية والتحقق من وجود PTOA على المستوى الخلوي. في الدراسات المستقبلية ، سيتم إنفاق المزيد من الوقت والطاقة على دراسة الآليات البيولوجية الجزيئية الأساسية لانحطاط ASCJ. ثانيا ، على الرغم من أن بنية مؤخرة الفأر والكاحلين تشبه بنية البشر ، بالمعنى الدقيق للكلمة ، فإن الفئران رباعية الأرجل ، في حين أن البشر ثنائيو القدمين ، والقوى التي تعاني منها المفاصل أثناء الحركة ليست هي نفسها تماما.
ومع ذلك ، فإن الإنشاء الناجح لنموذج فأر عدم الاستقرار ASCJ يوسع النموذج الحيواني البسيط لعدم استقرار الكاحل إلى النموذج الحيواني لعدم استقرار ASCJ ، والذي يوفر فهما أكثر شمولا لآلية عدم استقرار القدم ويوفر فهما جديدا لدراسة أمراض القدم السريرية ، بالإضافة إلى نموذج حيواني لتشخيص وعلاج المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي مصالح متضاربة.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج المنح الدراسية لحكومة مقاطعة جيانغسو وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
